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Articolo metodologico

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

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⸱

DOI:

10.3791/59270

⸱

21 marzo 2019

 ,  , 
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

In questo articolo

Sommario

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello di somministrazione orale utilizzando larve di Galleria mellonella e come caratterizzare indotto risposte immunitarie innate. Usando questo protocollo, i ricercatori senza esperienza pratica sarà in grado di utilizzare la mellonella g. alimentazione forzata di metodo.

Abstract

L'indagine del potenziale immunogenico di batteri commensali il sistema immunitario dell'ospite è una componente essenziale nello studio di interazioni ospite-microbo intestinale. È affermato che diversi commensali esibiscono un diverso potenziale per stimolare il sistema immunitario intestinale di host. Tali indagini coinvolgono animali vertebrati, soprattutto roditori. Poiché crescenti preoccupazioni etiche sono collegate con esperimenti su vertebrati, c'è una forte domanda per i modelli di sostituzioni degli invertebrati.

Qui, forniamo un modello di somministrazione orale di Galleria mellonella utilizzando batteri commensali non patogeni e la possibile valutazione del potenziale immunogenico di commensali sul sistema immunitario mellonella g. . Dimostriamo che mellonella g. è un modello di sostituzione degli invertebrati alternativa utile che permette l'analisi di commensali con differente potenziale immunogenico quali Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli. Interessante, i batteri hanno esibito alcun effetto di uccidere le larve, che è simile a quella dei mammiferi. Le risposte immunitarie di g. mellonella erano comparabili con la risposta immune innata dei vertebrati e coinvolgere il riconoscimento dei batteri e la produzione di molecole antimicrobiche. Proponiamo che mellonella g. era in grado di ristabilire l'equilibrio di microbiota precedente, che è ben noto da individui sani dei mammiferi. Anche se fornire risposte immunitarie innate paragonabile in entrambi mellonella g. e vertebrati, g. mellonella non porto un sistema immunitario adattativo. Poiché i componenti studiati del sistema immunitario innato sono evolutivi conservato, il modello consente un'analisi di preselezione e prima del batterica proprietà immunogeniche.

Introduzione

Il microbioma intestinale è una componente essenziale per il mantenimento dell'omeostasi e coinvolge entrambi immunitaria innata e adattativa1,2. La comunità di microflora commensale è caratterizzata da diversi costituenti principali commensale: simbionti che conferiscono benefici effetti immunomodulatori importanti funzioni, e pathobionts che può avere effetti nocivi geneticamente predisposti ospita e promuovere e attivare l'infiammazione intestinale3,4. Molti studi su simbionti e pathobionts e la loro influenza sul sistema immunitario dell'ospite sono stati pubblicati soprattutto studiare risposte immunitarie.

Poiché questi studi coinvolgono molti animali per le indagini e la protezione e la sostituzione degli animali utilizzati per la sperimentazione è di crescente interesse pubblico, noi cerchiamo di trovare un modello di sostituzione per consentire una proiezione di diversi batteri immunogeno Proprietà. Gli insetti, soprattutto Galleria mellonella, sono un modello di sostituzione ampiamente usato nella ricerca di infezione. G. mellonella combina diversi vantaggi quali bassi costi e produttività elevata; consente la somministrazione orale di batteri, che è la via di esposizione naturale, e per infezioni sistemiche5,6. G. mellonella ulteriormente consente di incubazione a 37 ° C, che è la temperatura corporea fisiologica di mammiferi e l'optimum per la virulenza batterica fattore espressione5. Il vantaggio principale di g. mellonella è conservato sistema immune innato che consente la discriminazione di sé dal non-sé e codifica per una varietà di recettori di riconoscimento di pattern come apolipophorin o l'opsonina hemolin6, 7. al momento della rilevazione di microbo, g. mellonella può innescare diverse risposte immunitarie umorali a valle. Può indurre risposte allo stress ossidativo e secernono le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che coinvolge l'attività della NOS (ossidasi nitrico sintasi) e NOX (NADPH ossidasi)6,8. Inoltre, g. mellonella attiva una risposta potente peptide antimicrobico (AMP), che provoca la secrezione di una miscela di diversi amplificatori quali gloverin, moricin, cecropin o la defensina-come gallerimycin6, 8,9,10. Generalmente, AMPs hanno specificità d'ospite piuttosto ampio contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi e funghi e devono fornire una risposta potente poiché gli insetti stanno mancando qualsiasi risposta adattativa10. Gloverin è un amplificatore attivo contro batteri e funghi e inibisce la formazione della membrana esterna6,11. Moricins esibiscono la loro funzione antimicrobica contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi di penetrare la membrana e formando un poro9,11. Cecropine fornire attività contro batteri e funghi e permeabilize la membrana allo stesso modo come moricins9,10. Gallerimycin è un peptide defensina-come con proprietà anti-fungine9. Interessante, è stato trovato che la combinazione di cecropin e gallerimycin aveva un'attività sinergica contro Escherichia coli10.

A causa del loro carattere easy-to-use mellonella g. larve sono un modello di infezione spesso usato per valutare la patogenicità batterica. In particolare, studi in cui i dati ottenuti da g. mellonella correlano con i dati ottenuti da topi sostegno la forza di questo modello di host alternativi. Si è constatato che i sierotipi più patogeni di Listeria monocytogenes in un modello di infezione di topo conducono anche a più alti tassi di mortalità in g. mellonella dopo infezione sistemica. Inoltre, meno virulenti sierotipi che si è rivelati per essere anche meno virulento in g. mellonella modello12. Osservazioni simili sono stati fatti con i funghi patogeni umani Candida albicans. Virulenza di diversi albicans del c. ceppi è stato valutato dall'infezione sistemica e successivo monitoraggio di sopravvivenza larvale. Ceppi non virulenti del mouse erano anche non virulenti o esposte ridotta virulenza in mellonella g., mentre i ceppi virulenti del mouse conducono anche ad alta mortalità larvale13. Il modello g. mellonella ulteriormente possa essere utilizzato per identificare fattori di patogenicità di tipo 3 secrezione sistema di Pseudomonas aeruginosa14.

Poiché la maggior parte delle indagini che coinvolgono mellonella g. erano concentrata su fattori di virulenza utilizzando l'approccio di infezione sistemica eravamo particolarmente interessati a fornire un metodo adatto per l'analisi dei commensali intestinali in un'alimentazione orale forzata modello in cui possiamo applicare un dosaggio distinto di batteri per le larve e non solo osservare il tasso di mortalità larvale ma analizzare diversi tratti distintivi della risposta immunitaria innata per mantenere l'omeostasi intestinale.

Il nostro metodo contribuisce ad per aumentare l'uso di g. mellonella come un modello di sostituzione poiché uniamo l'applicazione dei batteri e l'analisi di espressione di RNA. Non solo è utile per rafforzare il significato degli studi di patogenesi batterica quando si include l'analisi delle risposte immunitarie dopo somministrazione orale e non solo l'osservazione dei tassi di mortalità dopo infezione sistemica. I nostri metodi consente per l'analisi delle proprietà immunogeniche di batterico non patogeni commensali poiché è offre condizioni più complesse rispetto a coltura cellulare offrendo una barriera intestinale in un organismo vivente.

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Protocollo

1. g. mellonella allevamento e preparazione delle larve per gli esperimenti

Nota: Il ciclo da uovo ad instar Ultima larva dura circa 5-6 settimane.

  1. Trasferire le uova deposte da lepidotteri adulti per scatole da 2 L substrato Tarma della cera (granulosità di cereale del 22%, 22% di farina di frumento, 17,5% cera d'api, 11% latte scremato in polvere, miele di 11%, 11% glicerolo, lievito essiccato di 5.5%). Eseguire l'intero allevamento a 30 ° C al buio.
  2. Trasferire 25 g di substrato contenente le larve nel substrato fresco dopo circa 1-2 settimane, quando le larve di piccole e piccolissime erano visibili. Sincronizzare le larve dopo 2 settimane in base alle loro dimensioni e mantenere gruppi di 30-40 larve in contenitori 2 L su substrato di tarma della cera per 2 settimane supplementari.
  3. Selezionare le larve per esperimenti di peso. Utilizzare solo pallide e veloce movimento larve con una massa di 180-200 mg.

2. coltivazione e preparazione di Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli per somministrazione orale

  1. Crescere il batterio anaerobico obbligano Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C anaerobicamente utilizzando vasi e bustine per la creazione di un ambiente anaerobico (vedere Tabella materiali)15,16. Coltivare b. vulgatus per 2 giorni e crescere una sottocultura pernottamento in brodo di cervello cuore infusione (BHI).
  2. Crescere la mpk di Escherichia coli batterio anaerobico facoltativo in condizioni aerobiche in brodo di Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Coltivare e. coli pernottamento in libbra di brodo e far crescere la sottocultura per 2 h a 37 ° C il giorno dell'esperimento.
  3. Raccogliere le culture mediante centrifugazione a 1.700 x g per 5 min. Risospendere il batterico pellet in DPBS (di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Determinare la densità ottica (OD) di colture batteriche a OD 600 nm e calcolare le concentrazioni batteriche. Le concentrazioni batteriche sono state adeguate a 109/ml.

3. alimentazione forzata delle larve di g. mellonella con sospensioni batteriche

  1. Ingozza ogni larva con 10 µ l di sospensione batterica adattata contenente 107 batteri per dose. Utilizzare una siringa da insulina con ago smussato-conclusa per applicazione orale della sospensione batterica.
    1. Difficoltà la siringa nella pompa microsiringa (Figura 1) per assicurare l'accuratezza del volume sospensione applicata ad ogni larva (Vedi Tabella materiali). Inserire la siringa con attenzione tra le mandibole. Non forzare la siringa tra le mandibole. Attendere per le larve di aprirlo apparato boccale e poi inserire la siringa.
  2. Incubare le larve ad alimentazione forzate al buio a 37 ° C tra le larve di h. 1-24 uso DPBS-amministrato come sfondo finto controlli per escludere potenziali risposte allo stress indotte a causa della gestione delle larve durante l'alimentazione forzata.

4. elaborazione di larve somministrate per via orale e di isolamento del RNA

  1. Lavorare sotto una cappa e indossare occhiali di sicurezza. Pulire il cappuccio e spray reagente per evitare la contaminazione RNasi.
    1. Snap-congelare le larve viventi dopo incubazione in azoto liquido e omogeneizzarle. Utilizzare un mortaio e un pistillo per omogeneizzazione. Aggiungere azoto liquido per il mortaio e la griglia ogni individuo larvale fino a quando non sono prodotti in polvere omogeneati.
    2. Versare l'omogeneizzato per un USA e getta pesatura barca e attendere che l'azoto liquido evapori.
  2. Mescolare il liquido esente da azoto congelato omogeneati in polvere con 1 mL di Trizol in una provetta da 2 mL e incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 h.
  3. Centrifugare la miscela a 8.000 x g per 15 min a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una nuova provetta e gettare il pellet. Mescolare il surnatante con 200 µ l di 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vortex e incubare la miscela per 5 min a temperatura ambiente e per 10 minuti in ghiaccio.
  4. Centrifugare le reazioni BCP-aggiunto a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire lo strato superiore trasparente in una nuova provetta da 2 mL e scartare il resto. Precipitare il RNA dello strato superiore trasferito con 500 µ l isopropanolo miscelazione ed invertendo il tubo per 5 min.
  5. Centrifugare la provetta a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Lavare il precipitato pellet di RNA con 500 µ l di etanolo al 75%.
  6. Asciugare il pellet di RNA per 5-10 minuti a TA. Fare attenzione a non sopra a secco come sarà difficile da sciogliere più tardi.
  7. Diluire l'inibitore della ribonucleasi (1: 100) in acqua priva di nucleasi e utilizzare 100 µ l della soluzione per risospendere il pellet di RNA secco. Vortice il tubo con attenzione fino a quando la pallina è completamente sciolto.
  8. Misura RNA qualità e quantità. Assicurare che il rapporto di 260/280 è approssimativamente 2.0 e 260/230 rapporto nella gamma di 2.0-2.2 (Vedi Tabella materiali).
  9. Utilizzare 5 µ g di RNA isolato per digestione dnasi. Mix 5 µ l di tampone, 1 µ l di enzima inibitore della ribonucleasi, 2 µ l di enzima dnasi: 10x, 5 µ g di RNA e riempire con nucleasi-libero dell'acqua fino a 50 µ l. Incubare per 30 minuti a TA.
    1. Aggiungere 6 µ l di reagente di inattivazione e incubare per 2 min a RT e vortice reazione occasionalmente. Centrifugare la reazione a 10.000 x g per 1 min. trasferimento surnatante in provetta da 1,5 mL fresco.
      Nota: il RNA contiene il RNA larvale, come pure il RNA batterico del rispettivo ceppo utilizzato per la somministrazione orale.

5. quantificazione dei numeri batterici 16S copia dopo alimentazione forzata

Nota: I numeri di copia del 16S batterica espressa è stato determinato usando il cDNA sintetizzato dal RNA estratto nella sezione 4. Quantificazione finale viene calcolato con l'aiuto di una curva standard del plasmide in cui è stato clonato il frammento della PCR 16S di b. vulgatus o e. coli .

  1. Preparazione di standard di plasmide
    1. Amplificare i frammenti 16S da e. coli mpk o b. vulgatus mpk DNA genomic di PCR. Miscelare 10 µ l di tampone, 1 µ l di soluzione dNTP 10 mM, 2,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 2,5 µ l della diluizione di 10 µM primer reverse, 1 µ l di DMSO, 1 µ l della mascherina del DNA genomico, 31,5 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,5 µ l di enzima di bozze: 5x.
    2. Eseguire la PCR (denaturazione iniziale: 98 ° C per 30 s, denaturazione: 98 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 30 s, estensione finale: 72 ° C per 5 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 30 cicli).
      1. Utilizzare 16S Escherichia coli primer (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) o primer b. vulgatus 16S (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) per amplificazione.
    3. Utilizzare i frammenti PCR 16S e. coli e b. vulgatus per clonazione smussato-fine in un vettore di clonazione. Impostare la pagina di legatura e mescolare 10 µ l di tampone, 1 µ l di prodotto di PCR non purificate, 1 µ l di plasmide clonazione smussato-fine, 7 µ l di acqua priva di nucleasi e 1 µ l di T4 DNA ligasi: 2x. Incubare la legatura per 10 minuti a TA.
    4. Preparare le celle competenti DH5α di e. coli .
      1. Inoculare 100 mL di LB medium in un matraccio di Erlenmeyer con 1 mL di una coltura durante la notte. Far crescere la cultura fino a OD 600 nm è compreso tra 0.4-0.6. Dividere la cultura risultante in due provette da 50 mL e incubare le colture in ghiaccio per 10 min.
      2. Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 5 mL di soluzione RFI (30mm CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, MnCl2, regolare il pH 5,8 con acido glaciale, sterile filtrata). Riempire ogni provetta con ulteriori 45 mL di soluzione RFI.
      3. Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 6 mL di RFII (MOPS di 10 mM, 15 mM CaCl2, 10mm KCl, 15% glicerolo, sterilizzato nell'autoclave) soluzione. Piscina sia frazioni e incubare la sospensione di 12 mL in ghiaccio per aliquote per la sospensione delle cellule di 15 min. Prepare (200 µ l). Conservare le aliquote a-80 ° C.
    5. Trasferire la reazione di legatura ad un'aliquota del competente Escherichia coli cellule DH5α e lascia la reazione sul ghiaccio per 15 min. Heat shock le cellule per 45 s a 42 ° C e aggiungere 1 mL di terreno LB.
      1. Incubare la trasformazione per 45 min a 37 ° C. Aggiungere 100 µ l della trasformazione ad una piastra di agar LB contenente ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.
    6. Eseguire PCR di 8 trasformanti risultante della Colonia dalla piastra di agar LB di passaggio 5.1.5. Scegli ogni Colonia con uno stuzzicadenti, immergerlo in un fresco piatto LB contenente ampicillina (master piatto) e poi immergere lo stesso stuzzicadenti in un contenente 5,5 µ l di acqua esente da nucleasi in una striscia PCR.
      1. Aggiungere 7,5 µ l di miscela di x PCR 2, 0,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 0,5 µ l della diluizione di reverse primer 10 µM. Utilizzare le stesse coppie di primer menzionate nella sezione 5.1.1.
      2. Eseguire PCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 1 min, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 1 min, estensione finale: 72 ° C per 7 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 35 cicli).
    7. Verificare la dimensione dei frammenti 16S su gel di agarosio 1%. Utilizzare il buffer di Tris-Borato-EDTA (TBE) x 0,5 per sciogliere 1 g di agarosio e portare a ebollizione in un forno a microonde. Aggiungere colorante 1: 50.000 per gel e versarlo. Aggiungere le reazioni di PCR di Colonia e un DNA ladder 100 bp al gel ed eseguire il gel per 45 min a 110 V.
    8. Inoculare una cultura di pernottamento LB 5 mL contenente ampicillina con un clone dalla piastra di master (sezione 5.1.6) per ogni e. coli e b. vulgatus del plasmide 16S che contiene la dimensione inserto giusto.
      1. Centrifugare le colture batteriche durante la notte in una provetta da 2 mL a 1.700 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in acqua sterile di 600 µ l.
      2. Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi e mescolare capovolgendo la provetta 6 volte. Aggiungere 350 µ l di freddo (4° C) soluzione di neutralizzazione e miscelare accuratamente capovolgendo la provetta.
      3. Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 3 min. trasferire il surnatante (~ 900 µ l) per una colonna di spin e centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 15 s.
      4. Scartare l'attraversamento e aggiungere 200 µ l di endotossina rimozione lavaggio e centrifuga alla massima velocità in una centrifuga per 15 s.
      5. Aggiungere 400 µ l di soluzione di lavaggio alla colonna e centrifugare in una centrifuga alla massima velocità per 30 s. trasferimento della colonna in una provetta pulita 1,5 mL, 30 µ l di tampone di eluizione per la colonna viene quindi incubato per 1 min a temperatura ambiente.
      6. Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 30 s (Vedi Tabella materiali).
    9. Determinare la concentrazione di DNA del plasmide mescolando 1 µ l di DNA plasmidico con 199 µ l di soluzione di lavoro (1 µ l di colorante fluorescente a 199 µ l di tampone per ciascuna reazione). Preparare due standard mescolando 10 µ l di standard 1 o 10 µ l di campione 2 con 190 µ l. Vortexare il campione e tubi standard e incubare la reazione per 2 min. misura della concentrazione (Vedi Tabella materiali).
    10. Preparare le concentrazioni standard in diluizioni seriali 10 volte in un intervallo di 10-100.000 copie: calcolo della massa del plasmide singolo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = dimensione del plasmide, m = massa). Calcolare la massa del plasmide DNA necessario a contenere il numero di copie desiderato di interesse (copiare il numero di interesse x massa del plasmide singolo = massa del plasmide DNA necessario).
  2. Preparazione dei campioni per la quantificazione
    1. Sintesi di cDNA. Mescolare 2 µ l di tampone di 7x, 1 µ l di RNA dnasi-digerito da sezione 4 e 11 µ l di acqua esente da nucleasi. Incubare per 2 min a 42 ° C.
      1. Mettere reazione immediatamente sul ghiaccio. Mix 4 µ l di 5 x RT Buffer, 1 µ l di miscela di primer RT (trascrittasi inversa), 1 µ l di enzima RT e la reazione del punto 5.2.1. Incubare per 15 min a 42 ° C. Incubare per 3 min a 95° C per inattivare l'enzima RT.
    2. Quantificare il cDNA concentrazioni fluorometrically come descritto nel passaggio 5.1.9.
  3. Misurazione della carica batterica
    1. Regolare le concentrazioni di cDNA a 5 ng per reazione a 12 µ l per PCR quantitativa. Mescolare 2 x RT-PCR mix, 0,25 µ l di primer in avanti di 100 µM, 0,25 µ l di primer reverse a 100 µM (5.1.1) e 12 µ l di cDNA regolato. Eseguire qPCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 35 cicli, fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).
    2. Tracciare le concentrazioni di10 registro della curva standard plasmide (10-100.000 copie), vale a dire 1-5 (asse x), contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare per ottenere l'equazione di regressione. Risolvere l'equazione per x (concentrazione). Utilizzare la formula per calcolare il log10 dei numeri copia inserendo ct-valore nella formula. Calcolare l'antilogaritmo per ottenere i numeri di copia.

6. determinazione del gene marcatore immune innata mediante RT-PCR quantitativa

  1. Controllare gli iniettori per gene-specificità di PCR e successiva dell'agarosi elettroforesi per verificare la dimensione del frammento corretto. Eseguire PCR come descritto nella sezione 5.1.5.
    Di Ubiquitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC in avanti, retromarcia CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (giornaliere)
    Bp Nox-4 159: TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 in avanti
    Nos 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8 in avanti
    Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 in avanti
    ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 in avanti
    hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverse GCCACGCACATGTATTCACC8 in avanti
    bp gallerimycin 161: GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverse ATCGAAGACATTGACATCCA8 in avanti
    bp cecropin 158: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 in avanti
    bp gloverin 101: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 in avanti
    bp moricin 124: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8in avanti)
  2. Valutare l'efficienza di primer per essere E = 2.
    1. Piscina 2 µ l di 5-10 differenti campioni positivi (cioè, campioni che esprimono il gene per il quale la coppia di primer deve essere studiato).
    2. Preparare una serie di diluizioni 1:5 della piscina del campione: campione 1 (S1): non diluito piscina; S2: 2 µ l di S1 + 8 µ l nuclease-free water; S3: 2 µ l di S2 + 8 µ l nuclease-free water; S4: 2 µ l di S3 + 8 µ l nuclease-free water.
    3. Applicare 1 µ l di S1-S4 e un controllo non modello (acqua priva di nucleasi) ad una piastra a 96 pozzetti qPCR. Aggiungere 5 µ l di mix master RT, 0,1 µ l di ogni primer forward e reverse di µM 100, 3,7 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,1 µ l di miscela di RT per bene.
    4. Eseguire RT-PCR quantitativa (trascrizione inversa: 50 ° C per 10 min, denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 40 cicli di fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).
    5. Trama log10 di unità relative per S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (asse x) contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare e determinare la pendenza della curva standard. Calcolare l'efficienza e: E = 10-(1/slope). 20
      Nota: Una pendenza di -3.32 indica condizioni di reazione ideale e l'efficienza di primer di E = 2.00. Ciò significa: la quantità di prodotto di PCR si raddoppia durante ogni ciclo.
  3. Uso 100 ng di RNA digerito (100 ng / µ l) come modello per la RT-PCR. Reagenti mix RT-PCR e RT-PCR esecuzione come accennato nella sezione 6.2. Misurare tutti i campioni di batteri e DPBS amministrati con coppia di primer di pulizie sia coppie di primer di destinazione. Sempre eseguire le diluizioni S1-S4 con la coppia di primer di pulizie e S1-S4 con la coppia di primer di destinazione nello stesso piatto per la determinazione di efficienza.
  4. Calcolare il rapporto (R) dell'espressione genica RNA secondo la formula seguente utilizzando l'efficienza di primer determinato per via sperimentale sia la pulizia che la coppia di primer di destinazione. Normalizzare i batteri stimolato campioni a deridere controlli20.
    figure-protocol-1
    R: rapporto
    Edestinazione: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di destinazione
    Eservizio di pulizie: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di pulizie
    Δctdestinazione(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di destinazione
    Δctdelle pulizie(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di pulizie

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Risultati

Il modello di infezione g. mellonella emolinfa in ampiamente usato per analizzare i fattori di virulenza di una grande varietà di agenti patogeni. Maggior parte delle misure comprendono l'analisi della mortalità di larve, che è un metodo abbastanza facile. Tuttavia, questo metodo non consentono conclusioni sulle risposte immunitarie in generale e collegare i risultati delle risposte immunitarie mellonella g. con meccanismi immuni vertebrati. Il modello di somministrazion...

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Discussione

Il modello g. mellonella è un modello frequentemente usato per valutare i fattori di virulenza batterici in un approccio di infezione sistemica21. Poiché molti patogeni e batteri immettere l'host via orale colonizzazione o infezione, nuove intuizioni devono essere trovati per valutare mellonella g. come un modello per colonizzazione orale e l'infezione.

La possibilità di posteriore g. mellonella tra 15-37 ° C è un grande vantaggio poiché model...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SPP1656), il gruppo di formazione di ricerca DFG 1708, il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) e il centro tedesco per ricerca di infezione (DZIF).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 1,5 mLEppendorf0030120086
100 bp DNA ladder Thermo Fisher Scientific 15628019
1-Bromo-3-Cloropropano (BCP)Sigma-AldrichB9673
2 provette da 2 mLEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 mL provetteGreiner Bio-One210 261
AgarosioBiozym840004
Cerad'apiMixed-Store.de-Cervello
cuore infusione brodoThermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR Kit di clonazioneThermo Fisher ScientificK1232Vettore di clonazione per frammenti 16S
Semola di maisOstermü hle Naturkost GmbH306Coltivazione biologica
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
Kit di rimozione del DNA senza DNA Thermo Fisher Scientific244510  Digestione Dnase
Lievito seccoRapunzel -Coltivazione biologica
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
EtanoloVWR20821.330
GliceroloSigma-AldrichW252506
MieleOstermü hle Naturkost GmbH487
Isopropanol VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, biancoRoche Molecular Systems4729692001
Pompa manuale per microsiringhe con display digitaleWorld Precision Instruments
Micro-Fine+ U-100 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Mortaio per somministrazione orale
, non smaltatoVWR410-9327 
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Acqua senza nucleasi Thermo Fisher Scientific10977035
bustine Oxoid AnaeroGen Thermo Fisher Scientific AN0025AQualità e quantità di strisce RNA
PCRBiozym710970
Pestello, superficie di macinazione non smaltataVWR410-9324 
Enzima di correzione bozze Phusion Thermo Fisher ScientificF553S
PrimerBiomeri -
PureYield Plasmide Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit Qiagen204056qPCR per la misurazione del numero di copie batteriche
Kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR Qiagen204156qRT-PCR per misure di espressione genica
Kit di trascrizione inversa QuantiTectQiagen205311sintesi del cDNA
Qubit Provette per saggiThermo Fisher ScientificQ32856
Kit Qubit dsHS DNA Thermo Fisher ScientificQ32851Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA
Fluorimetro QubitThermo Fisher ScientificQ33226Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Inibitore della ribonucleasi RnasinaPromegaN2511
Latte scremato in polvereSucofin -
SYBR sicuro DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI reagente Sigma-AldrichT9424
PesatriceVWR10803-148
Farina di granoOstermü hle Naturkost GmbH6462Coltivazione biologica
Siringa per insulina DMP

Riferimenti

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