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Articolo metodologico

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

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DOI:

10.3791/59273

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25 agosto 2019

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1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, introduciamo un metodo di sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneeuploidy (PGT-A) con i vantaggi di tempi di consegna brevi, bassi costi e alta produttività.

Abstract

L'aneuploidia cromosomica, una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza, è stata ben documentata negli embrioni umani. Il test genetico preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) è un test genetico che migliora significativamente i risultati riproduttivi rilevando anomalie cromosomiche degli embrioni. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) fornisce un approccio ad alto valore avanzato ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A. Qui, presentiamo un metodo NGS a base di semiconduttori rapido e a basso costo per lo screening dell'aneeuploidia negli embrioni. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, seguita dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori. Generalmente, per un'applicazione PGT-A, 24 campioni possono essere caricati e sequenziati su ogni chip generando 60-80 milioni di letture ad una lunghezza di lettura media di 150 coppie di base. Il metodo fornisce un protocollo raffinato per l'esecuzione di amplificazione del modello e l'arricchimento della libreria di sequenziamento, rendendo il rilevamento PGT-A riproducibile, ad alta produttività, conveniente e risparmio di tempo. Il tempo di esecuzione di questo sequencer a semiconduttore è di sole 2 o 4 ore, riducendo il tempo di consegna dalla ricezione di campioni all'emissione di rapporti in 5 giorni. Tutti questi vantaggi rendono questo saggio un metodo ideale per rilevare aneuploidi cromosomici da embrioni e quindi facilitare la sua ampia applicazione in PGT-A.

Introduzione

La scelta di embrioni vitali di buona qualità con numeri di copia cromosomica normale (euploide) per il trasferimento nella riproduzione assistita aiuta a migliorare gli esiti della gravidanza. Tradizionalmente, il sistema di classificazione morfologica ben consolidato è ampiamente utilizzato per la valutazione degli embrioni a causa della sua facile disponibilità e della natura non invasiva. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica può fornire solo informazioni limitate sulla qualità dell'embrione1 e sul potenziale di impianto2. Una ragione fondamentale è la sua incapacità di valutare la composizione cromosomica degli embrioni.

L'aneuploidia cromosomica (numero di copie anomale di cromosomi) è una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza. L'insorgenza di aneuploidia è stata ben documentata negli embrioni umani, che rappresentail 60%,70% negli embrioni in fase di scissione 3,4 e 50%-60% nelle blastocisti5. Questo, in una certa misura, ha contribuito al collo di bottiglia nel miglioramento del tasso di gravidanza del trattamento di fecondazione in vitro (IVF), che ha mantenuto a circa il 35%,40%6,7. Pertanto, la selezione di embrioni euploidi per il trasferimento è creduta per essere utile per migliorare gli esiti della gravidanza. A tal fine, sono stati ulteriormente sviluppati test genetici preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) per studiare la vitalità degli embrioni utilizzando approcci genetici. Ci sono un numero crescente di studi controllati randomizzati e studi di coorte che supportano il ruolo cruciale di PGT-A. È stato dimostrato che l'applicazione di PGT-A riduce il tasso di aborto spontaneo e aumenta il tasso di gravidanza clinica e il tasso di impianto8, tasso di gravidanza in corso e tasso di natalità vivo9.

Storicamente, diversi metodi sono stati applicati in PGT-A, come la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), la cGH di array e il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP)-microarray. Studi precedenti hanno indicato che PGT-A per gli embrioni in fase di scissione di FISH produce risultati scarsamente coerenti con quelli ottenuti dallo screening cromosomico completo (CCS) delle blastocisti corrispondenti utilizzando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Queste discrepanze possono essere attribuite al mosaicismo cromosomico, ai manufatti tecnici FISH o all'autocorrezione embrionale degli errori di segregazione cromosomica durante lo sviluppo11. È stato ampiamente riconosciuto che l'utilizzo di biopsie del trophectoderm blastocistico (TE) per PGT-A basati su array come array-CGH o SNP-microarray è efficace per identificare lo squilibrio cromosomico negli embrioni10,12. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione a cella singola (NGS) fornisce un approccio ad alta produttività ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A13,14,15, che lo rendono un approccio promettente alternativa ai metodi attualmente disponibili.

Qui, presentiamo un metodo NGS basato su semiconduttori veloce, robusto e a basso costo per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni umani. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, utilizzando un kit WGA a cella singola, seguito dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori.

Attraverso il rilevamento degliioni H che vengono rilasciati da ogni incorporazione di triplofosfato deossiribonucleoside durante la sintesi del filamento di DNA, il sistema trasferisce i segnali chimici (pH change) catturati dagli elementi semiconduttori ai dati digitali diretti , che vengono ulteriormente interpretati nelle informazioni sulla sequenza del DNA. Eliminando la necessità di costosi rilevamenti ottici e reazioni di sequenziamento complesse, questa semplice chimica di sequenziamento riduce il costo totale del reagente e riduce il tempo di esecuzione del sequenziamento in 2 o 4 ore16. Ancora più importante, in base alle specifiche delle prestazioni del produttore, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori può generare fino a 15 GB di dati di sequenziamento (dipende dalla qualità della libreria) per corsa, che è significativamente superiore rispetto ad alcuni degli altri sequencer producendo solo circa 3-4 GB di dati (con 2 x 75 bp di lunghezza di lettura)17. Nelle applicazioni cliniche di PGT-A, questa piattaforma può ottenere 24 campioni per chip generando fino a 80 milioni di letture17 e almeno un milione di letture univoche di ogni campione. La profondità di lettura può garantire che ogni campione abbia una copertura dell'intero genoma di 0,05x. I vantaggi di cui sopra di questa piattaforma lo rendono un metodo di screening ideale e quindi, facilitare le sue ampie applicazioni in PGT-A18.

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Protocollo

L'approvazione etica è stata concessa dalla Joint Chinese University of Hong Kong - Comitato etico per la ricerca clinica dei nuovi territori (numero di riferimento: 2010.432). La licenza di ricerca è stata approvata dal Council on Human Reproductive Technology di Hong Kong (Numero R3004).

1. Amplificazione dell'intero genoma

  1. Prima di iniziare, controllare il volume delle perline magnetiche (Tabella dei materiali) per assicurarsi che ci sia non meno di 135 l (con un eccesso del 20%) per ogni campione. Mantenere le perline magnetiche a temperatura ambiente (RT) per almeno 30 min. Preparare 720 l (con un eccesso del 20%) del 70% di etanolo per ogni campione. Equipaggiare un ciclore termico (Tabella dei materiali) con coperchio riscaldato a 105 gradi centigradi.
    NOTA: il 70% di etanolo appena preparato (Tabella dei materiali) deve essere utilizzato entro 3 giorni.
  2. Preparazione del campione
    NOTA: Nella pratica di routine, da 5 a 10 cellule di troectodermi della blastocisti vengono biopsied secondo la linea guida pratica19.
    1. Sospendere le biopsie in 2 - L di 1x di salina tamponella di fosfato (PBS) in un singolo tubo di reazione a catena di polimerasi da 0,2 mL (PCR).
    2. Ruotare brevemente il tubo su una mini centrifuga per 3 s per raccogliere le goccioline.
  3. Lisi e estrazione delle cellule
    1. Scongelare il buffer di estrazione cellulare (Tabella dei materiali) e il buffer di diluizione dell'enzima di estrazione ( Tabella deimateriali) su ghiaccio, vortice e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s prima dell'uso.
    2. Aggiungere 3 - L di buffer di estrazione cellulare a ogni tubo dal passo 1.2.2.
    3. Preparare per ogni campione una miscela master di lisi a 5 celle lla aggiungendo 4,8 gradi di tampone di diluizione enzimatica di estrazione e 0,2 enzimi di estrazione cellulare (Tabella dei materiali). Mescolare bene e aliquota in ogni tubo dal punto 1.3.2. Capovolgere il tubo delicatamente e ruotare brevemente su una mini centrifuga per 3 s.
      NOTA: le punte non devono toccare il liquido contenente i campioni di cellule quando si aggiunge il mix master.
    4. Incubare il tubo dal punto 1.3.3 nel ciclore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 10 min a 75 , 4 min a 95 gradi C, tenere premuto a 4 gradi centigradi.
  4. Preamplificazione
    1. Scongelare il buffer di preamplificazione (Tabella dei Materiali) su ghiaccio, vortice e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s prima dell'uso.
    2. Preparare per ogni campione una miscela master di preamplificazione 5-L aggiungendo 4,8 gradi di tampone di preamplificazione e 0,2 litri di enzima di preamplificazione (Tabella dei materiali). Mescolare bene e aliquota in ogni tubo dal punto 1.3.4. Capovolgere il tubo delicatamente e ruotare brevemente su una mini centrifuga per 3 s.
      NOTA: Le mance non devono toccare il liquido contenente i campioni di DNA quando si aggiunge il mix master.
    3. Incubare il tubo nel ciclore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le impostazioni fluide: 2 min a 95 gradi centigradi; 12 cicli per 15 s a 95 gradi centigradi, 50 s a 15 s, 40 s a 25 gradi centigradi, 30 s a 35 s, 40 s a 65 gradi centigradi, 40 s a 75 o C; tenere a 4 gradi centigradi.
  5. Amplificazione
    1. Scongelare il bufferdiamplificazione ( Tabella dei Materiali ) su ghiaccio, vortice e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s prima dell'uso.
    2. Preparare una miscela master di amplificazione da 60 l'n. per ogni campione aggiungendo 25 litri di buffer di amplificazione, 0,8 litri di enzima di amplificazione (Tabella dei materiali) e 34,2 litri di acqua priva di nuclea per WGA ( Tabella deimateriali). Mescolare bene e aliquota in ogni tubo dal passo 1.4.3. Capovolgere il tubo delicatamente e ruotare brevemente su una mini centrifuga per 3 s.
    3. Incubare il tubo nel ciclore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 2 min a 95 gradi centigradi; 14 cicli per 15 s a 95 gradi centigradi, 1 min a 65 gradi centigradi, 1 min a 75 gradi centigradi; tenere a 4 gradi centigradi.
  6. Purificazione dei il Prodotti WGA
    1. Trasferire ogni prodotto WGA dal passaggio 1.5.3 in nuovi tubi da 1,5 mL. Aggiungere 112,5 l di perline magnetiche in ogni tubo. Vortice e incubare a RT per 5 min.
      NOTA: Mescolare completamente le perline magnetiche prima dell'uso.
    2. Posizionare i tubi su un supporto magnetico (Tabella dei materiali) per 3 min fino a quando il supernatante è chiaro. Scarta tutti i supernatali senza disturbare le perline.
    3. Aggiungere 300 l del 70% di etanolo ad ogni tubo. Ruotare ogni tubo di 180 gradi per far scorrere le perline attraverso l'etanolo e ruotare di nuovo alla posizione originale. Scartare tutti i supernatali dopo che le perline si sono depositate senza disturbare le perline. Ripetere questo passaggio una volta.
      NOTA: Tenere il tubo sul supporto magnetico mentre si ruota il tubo orizzontalmente.
    4. Ruotare brevemente ogni tubo su una mini centrifuga per 3 s. Posizionare i tubi sul supporto magnetico fino a quando il supernatante residuo è chiaro. Scartare tutti i supernatali residui senza disturbare le perline. Asciugare all'aria le perline a RT per circa 3 min.
    5. Togliere i tubi dal supporto magnetico e risospendere le perline essiccate aggiungendo 35 -L di tampone Tris-EDTA (TE) basso (Tabella dei materiali). Incubare a RT per 5 min.
    6. Posizionare i tubi sul supporto magnetico per 3 min fino a quando il supernatante è chiaro. Trasferire tutti i supernatali contenenti DNA eluito in nuovi tubi da 1,5 mL senza disturbare le perline.

2. Controllo di qualità dei prodotti WGA

  1. Quantificare ogni prodotto WGA purificato dal punto 1.6.6 da un asdetto fluorometro (Tabella dei materiali) secondo il manuale del produttore utilizzando 1 -L di prodotto WGA come materiale di partenza.
    NOTA: La concentrazione accettata del prodotto WGA è di 10 ng/L. Qualsiasi prodotto al di sotto di questa soglia non è raccomandato per procedere con i passaggi successivi.

3. Frammentazione dei prodotti WGA

  1. Prima dell'inizio, preriscaldare un riscaldatore a blocchi a secco a 37 gradi centigradi. Preparare 6 ol (con un eccesso del 20%) di 0,5 M EDTA per ogni campione. In base alla concentrazione, aliquote 300 ng di DNA da ogni prodotto WGA purificato al passo 1.6.6 ai nuovi tubi PCR da 0,2 mL e portare il volume a 16 gradi con acqua priva di nuclenonsi per ogni tubo.
  2. frammentazione f
    1. Preparare per ogni campione un mix di reazione di frammentazione a doppio filamento a 4 LEG (dsDNA) aggiungendo 2 - L di buffer di reazione di frammentazione della frammentazione dsDNA (Tabella dei materiali) e 2 l di enzimi di frammentazione dsDNA ( Tabella deimateriali). Mescolare bene e aliquota in ogni tubo dal punto 3.1. Vortice e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s. Incubare i tubi per 25 min a 37 gradi centigradi in un ciclore termico con coperchio riscaldato.
    2. Aggiungere immediatamente 5 -L l di 0,5 M edTA ad ogni tubo. Mescolare bene vorticendo e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s.
  3. Purificazione e sospensione
    1. Trasferire ogni prodotto dal passaggio 3.2.2 in nuovi tubi da 1,5 mL. Aggiungere 37,5 l'ora di perline magnetiche ad ogni tubo. Mescolare vertexing e incubare a RT per 5 min.
    2. Purificare i prodotti come descritto dal passaggio 1.6.2 al passaggio 1.6.4.
    3. Elute ogni prodotto purificato come descritto nei passaggi 1.6.5 e 1.6.6 aggiungendo 32 L di buffer low-TE.

4. Costruzione della biblioteca

  1. Blunt- e nd r eaccoppiamento, selezione delle dimensioni e purificazione
    1. Preparare per ogni campione un mix di riparazione con un'estremità smussata di 20 gradi aggiungendo 9,5 gradi di acqua priva di nucleera, 10 loffingi di 5 volte buffer di riparazione finale (Tabelladei materialidal punto 3.3.3. Vortice e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s.
    2. Aggiungere 50 - L di perline magnetiche ad ogni tubo dal punto 4.1.1. Vortice e incubare a RT per 5 min.
      NOTA: Mescolare completamente le perline magnetiche prima dell'uso.
    3. Posizionare ogni tubo sul supporto magnetico per 3 min fino a quando il supernatante è chiaro. Trasferire tutti i supernatali in nuovi tubi da 1,5 mL in cui vengono aggiunti perline magnetiche per ciascuno di essi. Vorticare i tubi con il supernatante trasferito e incubare a RT per 5 min.
    4. Purificare i prodotti nei tubi incubati come descritto dal passaggio 1.6.2 al passaggio 1.6.4.
    5. Elute ogni prodotto purificato come descritto nei passaggi 1.6.5 e 1.6.6 aggiungendo 32 L di buffer low-TE.
      NOTA: si tratta di un punto di arresto sicuro; il DNA purificato da questo passaggio è stabile a 4 gradi centigradi per non più di 24 h.
  2. Adattatore l igazione e p urificazione
    1. Preparare una miscela di legatura dell'adattatore 17 per ogni campione aggiungendo 10 L di acqua priva di nucleatosi, 5 lecc di 10 x buffer di ligase (Tabella dei materiali), 1 l'adattatore P1 ( Tabella deimateriali) e 1 LL di DNA ligase ( Tabelladei materiali). Mescolare bene vorticendo per 5 s e girare su una mini centrifuga per 15 s, e aliquota in ogni tubo dal passo 4.1.5.
    2. Aggiungete 1 - L di adattatori (Tabella dei materiali) a ciascun tubo dal passo 4.2.1 in base al foglio di esempio ( File supplementare: Foglio di esempio per legaturadell'adattatore ). Vortex e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s. Incubare i tubi a RT (20-25 gradi) per 20 min.
    3. Aggiungere 75 -L di perline magnetiche ad ogni tubo dal punto 4.2.2. Mescolare vertexing e incubare a RT per 5 min. Quindi, purificare i prodotti come descritto dal passaggio 1.6.2 al passaggio 1.6.4.
    4. Elute ogni prodotto purificato come descritto nei passaggi 1.6.5 e 1.6.6 aggiungendo 15 L di buffer low-TE. Trasferire tutti i supernatali contenenti DNA eluito su nuove strisce a 8 tubi da 0,2 mL.
      NOTA: si tratta di un punto di arresto sicuro; il DNA purificato da questo passaggio è stabile a 4 gradi centigradi per non più di 24 h.
  3. Amplificazione e purificazione
    1. Preparare per ogni campione un composto master di amplificazione da 50 gradi per ogni campione aggiungendo 47,5 gradi di super mix (Table of Materials) e 2,5 l di miscela di primer ( Tabella deimateriali). Mescolare bene vorticendo e ruotando brevemente su una mini centrifuga, e nelle strisce da 8 tubi da 0,2 mL dal passo 4.2.4.
    2. Vorticare le strisce per 30 s e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s. Incubare le strisce nel ciclore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 20 min a 72 gradi centigradi; 5 min a 95 gradi centigradi; 10 cicli per 15 s a 95 s, 15 s a 62 gradi centigradi, 1 min a 70 gradi centigradi; 5 min a 70 gradi centigradi; tenere a 4 gradi centigradi.
    3. Trasferire ogni prodotto dal passaggio 4.3.2 ai nuovi tubi da 1,5 mL. Aggiungere 97,5 l'ora di perline magnetiche ad ogni tubo. Mescolare vortice e incubare a RT per 5 min.
    4. Purificare i prodotti come descritto dal passaggio 1.6.2 al passaggio 1.6.4.
    5. Elute ogni prodotto purificato come descritto nei passaggi 1.6.5 e 1.6.6 aggiungendo 25 L di buffer low-TE.

5. Controllo della qualità e diluizione della libreria del DNA

  1. Quantificare ogni libreria di DNA preparata dal punto 4.3.5 dal test del fluorometro secondo il manuale del produttore utilizzando 2 -L di libreria di DNA come materiale di partenza.
  2. La concentrazione accettata della libreria del DNA è di 0,5 ng/L e quella del controllo positivo (Tabella dei materiali) è di 15 ng/L. Se la concentrazione del controllo positivo varia troppo da 15 ng/L, ripetere la quantificazione del controllo positivo fino a quando la concentrazione non è vicina a 15 ng/L. Se la concentrazione della libreria è inferiore a 0,5 ng/l, riavviare dalla frammentazione (sezione 3).
    NOTA: Assicurarsi che la concentrazione del controllo positivo raggiunga il valore accettato prima di quantificare la libreria del DNA.
  3. Diluire ogni biblioteca a 100 pmol con l'aggiunta di acqua priva di nuclesi. Aggiungere 1 -L di biblioteca a n. l di acqua priva di nuclenonazione; calcolare n utilizzando l'equazione seguente:
    figure-protocol-1
    dove Q è la concentrazione di ogni libreria misurata dall'andetto fluorometro e C è la concentrazione del controllo positivo misurato dall'assaggio fluorometro.

6. Sequenziamento

  1. Prima di iniziare, preparare 48 L (con un eccesso del 20%) di 1 M NaOH per ogni campione e un tubo senza nucleato. Scongelare il buffer PCR master mix (Tabella dei materiali) (2000 -L in volume) a RT. Portare le particelle di sfera ( Tabella deimateriali) in RT.
  2. Pool di librerie
    1. Vorticare ogni libreria diluita dal passo 5.3 e brevemente girare 4x su una mini centrifuga per 3 s ogni volta. Prendere 5 -L di ogni biblioteca per piscina nel tubo senza nuclesino 1,5 mL. Vorticare la libreria mista e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s.
  3. PCR di emulsione con un sistema di emulsione
    1. Aggiungere 150 gradi di soluzione di rottura a 2 nuovi tubi di recupero (Tabella dei materiali). Installare i nuovi tubi di recupero, router di ripristino e piastra di amplificazione.
    2. Mescolare invertendo la bottiglia d'olio (Tabella dei Materiali) 3 volte. Assicurarsi che sia la soluzione di petrolio che quella di recupero (Tabella dei materiali) siano almeno 2/3 piene.
    3. Vorticare il buffer PCR master mix per 30 s e girare brevemente su una mini centrifuga per 3 s. Vortex le particelle di sfera e la libreria mista dal passo 6.2.1 per 1 min e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s.
    4. Preparare una miscela di ligazione di 2400 luna aggiungendo 172 l'l di acqua priva di nuclesiera, 8 l' di libreria mista dal passo 6.3.3, 120 L di mix enzimatico (Tabella dei materiali) e 100L di particelle di sfera al tubo contenente 2000 .
    5. Impostare una pipetta su 800 . Caricare la miscela di legatura dal passaggio 6.3.4 al filtro di reazione (Tabella dei materiali) attraverso la porta campione. Utilizzare una pipetta da 1000P per aggiungere 200 l'olio di reazione al filtro di reazione.
    6. Selezionare il programma Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit, quindi selezionare il pulsante Assistito per assicurarsi che il dispositivo sia stato configurato correttamente seguendo le istruzioni sul monitor. Quindi, fare clic su Avanti per avviare il programma.
  4. Arricchimento mediante un sistema di arricchimento automatico
    1. Una volta completato il programma PCR di emulsione, fare clic su Avantie quindi su Rotazione finale per ruotare per 10 min. Estrarre i 2 tubi di recupero dopo aver fatto clic su Apri coperchio.
    2. Eliminare il supernatante dai 2 tubi di recupero fino a 100 , rimane in ogni tubo ed etichettare di conseguenza. Mescolare bene la soluzione e trasferirla in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 200 l di acqua priva di nuclenonazione ad ogni tubo di recupero, lavare con voglia su e giù più volte e trasferire tutta la soluzione al tubo da 1,5 mL al punto 6.4.2. Ripetere il passaggio di lavaggio una volta.
    4. Aggiungere 200 l di acqua priva di nucleata a uno dei tubi di recupero e lavare coniando su e giù più volte. Trasferire tutta la soluzione all'altro tubo di recupero e lavare pipetting su e giù più volte. Quindi, trasferire tutta la soluzione allo stesso tubo da 1,5 mL dal passaggio 6.4.3. Vortice il tubo da 1,5 mL per 30 s e centrifuga per 8 min a 15.500 x g.
      NOTA: il volume totale finale del prodotto PCR di emulsione in questo passaggio dovrebbe essere di circa 1200.
    5. Scartare il supernatante nel tubo e tenere 20 ll del prodotto PCR di emulsione. Aggiungere al tubo 80 - L di soluzione di sospensione (Table of Materials). Mescolare pipetting su e giù.
    6. Preparare per ogni chip una soluzione di fusione a 320 gradi aggiungendo 280 gradi di soluzione monolaurata in polietilene glicole sorbitano (Tabella deimateriali) e 40 -L di 1 M NaOH.
      NOTA: 1 M NaOH deve essere conservato a 4 gradi centigradi o appena preparato. Vortice prima dell'uso.
    7. Vorticare il tubo contenente perline C1 (Tabella dei materiali) per 30 s. Portare 100 l di perline C1 su un nuovo tubo da 1,5 mL. Posizionare il tubo da 1,5 mL sul supporto magnetico per 2 min a RT. Scartare tutti i supernatali dopo che le perline si sono depositate senza disturbare le perline.
    8. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavaggio C1 (Tavolo dei materiali) al tubo dal punto 6.4.7. Vortice per 30 s. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 2 min a RT. Scartare tutti i supernatali dopo che le perline si sono depositate senza disturbare le perline. Risospendere le perline aggiungendo 130 l di soluzione di cattura del tallone (Tabella dei materiali).
    9. Sistema di arricchimento (ES) configurazione
      1. Caricare il campione (1000 -l emulsione PCR prodotto) dal passo 6.4.5, le perline lavate (130 l) dal passo 6.4.8, soluzione di lavaggio ES (300 ) (Tavolo di materiali) e soluzione di fusione (300 ) dal passo 6.4.6 nella striscia a 8 tubi. L'ordine di layout è: campione (tubo 1), perline lavate (tubo 2), soluzione di lavaggio ES (tubi 3, 4, 5) e soluzione di melt-off (tubo 7). Tenere vuoti i tubi 6 e 8.
      2. Posizionare la striscia a 8 tubi dal gradino 6.4.9.1 sulla ES. Installare una punta di pipetta e un nuovo tubo da 0,2 mL e avviare il programma.
        NOTA: Assicurarsi che la pipettaggio funzioni normalmente.
    10. Lavare le particelle di sfera dopo aver completato l'arricchimento.
      1. Centrifugare il tubo da 0,2 mL dal passo 6.4.9.2 per 5 min a 15.500 x g. Scartare il supernatante e tenere 10 l del prodotto di arricchimento. Aggiungere al tubo 200 - L di acqua priva di nuclesio. Mescolare vortice.
      2. Centrifugare il tubo da 0,2 mL per 5 min a 15.500 x g. Scartare il supernatante e tenere 10 l del prodotto di arricchimento. Aggiungere al tubo 90 - L di acqua priva di nucleata. Mescolare vortice.
  5. Preparazione del modello
    1. Vorticare il controllo positivo e girare brevemente. Aggiungete 5 -L di controllo positivo al modello 100 -L (il prodotto di arricchimento dal passaggio 6.4.10.2). Vortice e centrifugazione per 5 min a 15.500 x g. Scartare il supernatante e mantenere 10 l del modello.
    2. Aggiungere 20 - L di primer di sequenziamento (Tabella dei materiali) e 15 -L di tampone di nesso ( Tabella deimateriali) al tubo modello dal passo 6.5.1. Vorticare il tubo e brevemente girare su una mini centrifuga per 3 s.
    3. Incubare il tubo dalla fase 6.5.2 nel ciclore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 2 min a 95 gradi centigradi, 2 min a 37 gradi centigradi, tenere a 4 gradi centigradi.
    4. Aggiungere 10 l di buffer di carico (Tabella dei materiali) al tubo dal punto 6.5.3. Mescolare pipetting su e giù.
  6. Inizializzazione del sequencerSequencer initialization
    1. Controllare la pressione del serbatoio del gas di azoto (pressione totale 500 psi, pressione di uscita: 10 psi, ottimale 20-30 psi). Ricaricare 100 mL di acqua dionizzata (18,2 M) a tubi C1 e C2 (Table of Materials) e installarli nelle posizioni C1 e C2 corrispondenti sul sequencer.
    2. Preparare le soluzioni W1 (32 -L di 1 M NaOH) e W3 (40-50 mL di buffer W3 [Tabella dei materiali]). Preparate la soluzione W2 aggiungendo 1920 mL di acqua deionizzata (18,2 M), un'intera bottiglia di tampone W2 (Table of Materials) e 8-12 L di 1 M NaOH, e invertite di 4-8 volte da mescolare.
      NOTA: Poiché la qualità dell'acqua varia geologicamente, regolare il volume di 1 M NaOH in base alle esigenze. Il pH iniziale di W2 è di 5,9,6,1, e l'intervallo ottimale dopo la regolazione è di 7,4,7,6. Cambiare e installare nuovi tubi reagenti e utilizzare chip utilizzati di recente per il lavaggio.
    3. Preparare i 4 nuovi tubi vuoti dal kit di supplemento di sequenziamento (Tabella dei Materiali). Etichettare i 4 tubi come dGTP, dCTP, dATP e dTTP e aggiungere 70 -L di dGTP, dCTP, dATP o dTTP (Tabella dei materiali) al tubo corrispondente (cioè 70-L dGTP al tubo etichettato come dGTP, ecc.). Vorticare i tubi prima dell'uso. Installare i tubi nelle posizioni corrispondenti designate sul sequencer (Tabella dei materiali).
  7. Lavaggio truciolo
    1. Lavare il chip (Tabella dei Materiali) una volta iniettando 100 l' di isopropanolo nel pozzo di carico del chip. Rimuovere il liquido espulso dal pozzo opposto.
    2. Lavare il chip due volte iniettando 100 l'acqua senza nuclesinella nel pozzo di carico del chip. Rimuovere il liquido espulso dal pozzo opposto.
    3. Lavare il chip una volta iniettando 100 L di 0,1 M NaOH nel pozzo di carico del chip. Rimuovere il liquido espulso dal pozzo opposto. Incubare a RT per 1 min.
    4. Lavare il chip una volta iniettando 100 l'acqua senza nuclesinella nel pozzo di carico del chip. Rimuovere il liquido espulso dal pozzo opposto.
    5. Lavare il chip due volte iniettando 100 l di isopropanolo nel pozzo di carico del chip. Rimuovere il liquido espulso dal pozzo opposto. Asciugare soffiando azoto sul chip. Tenere lontano dalla luce.
  8. Caricamento e sequenziamento dei campioni
    1. Mescolare il campione di 55 -L dal passo 6.5.4 pipetting su e giù e caricare il campione al pozzo di carico del chip.
      NOTA: Tenere la punta della pipetta e il tubo PCR da 0,2 mL utilizzato in questo passaggio.
    2. Posizionare il chip sul chip mini centrifuga (Tabella dei materiali) quando
    3. Preparare due nuovi tubi da 1,5 mL per il tampone di analizzamento e la soluzione di lavaggio. Preparare il buffer di analing 50% aggiungendo 500 l di tampone di fissaggio e 500 lofanti di acqua priva di nuclea. Preparare la soluzione di lavaggio aggiungendo 500 l di tampone di analizzamento e 500 L di 100 % 2-propanol.
    4. Preparare due nuovi tubi da 1,5 mL e preparare la miscela di schiumatura mescolando 49 luna del 50% di tampone di analing e 1 -L di soluzione di schiuma (Tabella dei materiali) in entrambi i tubi.
    5. Impostare una pipetta a 100. Fai il > 120 - L di bolle e continua a pipettare fino a quando non si vedono bolle visibili eccezionali. Caricare 120 l di bolle nel pozzo di carico.
      NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle visibili in sospeso. Altrimenti, ricomincia da capo.
    6. Trasferire bene l'eccessivo liquido espulso dall'uscita dal passaggio 6.8.5 al pozzo di carico mediante pipettaggio. Non pipette bolle. Centrifugare il chip per 30 s sul chip mini centrifuga.
    7. Ripetere il passaggio 6.8.5 utilizzando il secondo tubo contenente la miscela di schiuma dal passaggio 6.8.4.
    8. Aggiungere 55 l del buffer di analismo 50% al tubo da 0,2 mL conservato al punto 6,8,1. Utilizzare la punta della pipetta conservata al punto 6.8.1 per pipettare su e giù. Caricare tutti i buffer di annessione 55 L l sul pozzo di carico. Centrifugare il chip per 30 s sul chip mini centrifuga designato.
    9. Caricare 100 l di soluzione di lavaggio nel pozzo di carico del chip e scartare bene il liquido espulso dall'uscita. Ripetere questo passaggio di caricamento una sola volta.
      NOTA: Se ci sono bolle nel chip, espellere piccole bolle da grandi bolle e lavare la soluzione di lavaggio. Ciò può essere ottenuto con il pipettaggio di 100 ,l di soluzione di lavaggio e lasciando 5 l'acqua sotto la soluzione di lavaggio. Pertanto, durante il pipettaggio del 105 L nel chip, l'aria formerà una grande bolla che può espellere le piccole bolle, e poi, la grande bolla può essere espulsa dalla seguente soluzione di lavaggio.
    10. Caricare 100 l del 50% di annaaling buffer nel pozzo di caricamento del chip. Ripetere questo passaggio di caricamento per un totale di 3 volte.
    11. Aggiungere 6 l'enzima di sequenziamento in 60 litri del tampone di analamento del 50% in un nuovo tubo da 1,5 mL. Mescolare pipetting su e giù. Caricare 65 l di questa soluzione mista nel pozzo di caricamento del chip. Pipette lentamente per evitare schiuma.
    12. Tenere il chip lontano dalla luce e incubare a RT per 5 min.
    13. Dopo l'incubazione, caricare immediatamente il chip sul sequencer e fare clic su Avvia l'esecuzione della sequenza sullo schermo per avviare la sequenza.
      NOTA: i dati grezzi di sequenziamento e i file di controllo qualità verranno caricati automaticamente nell'azienda per l'analisi dei dati.

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Risultati

Sulla base di questo protocollo modificato, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori è stata per la prima volta, applicata per PGT-A. Abbiamo testato sulle biopsie sia da blastomeri in fase di scissione che da embrioni dello stadio di blastocisti. Si suggerisce che le cellule biopsied subiscono WGA il più presto possibile per prevenire qualsiasi degradazione del DNA. Uno studio precedente ha confrontato le prestazioni di diversi metodi WGA e ha indicato che il metodo che abbiam...

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Discussione

Diverso da altre chimiche di sequenziamento, il sequencer qui descritto usa il semiconduttore per il rilevamento dei nucleotidi. Il chip stesso è un dispositivo elettronico che rileva gli ionidi idrogeno mediante l'incorporazione di base 17, basata sulla polimerasi, che consente il tempo di sequenziamento di 2,4 h del programma Proton. Inoltre, il chip è un chip di microwell che permette la localizzazione di una molecola bersaglio, che è diversa dalla chimica di sequenziamento delle celle di fluss...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo generale di ricerca (Ref n. 14162417) di Hong Kong, dalla National Natural Science Foundation of China (Ref. n. 81860272), il principale piano di ricerca della Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref No. AB16380219) e il China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) dalla Cina.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per PCR, 0,2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7,4, Ca2+ e Mg2+ senzaThermoFisher10010023
1,0 M NaOH (1,0N)SIGMA-ALDRICHS2567Per soluzione di fusione. Provette Eppendorf LoBind di grado molecolare
, 1,5 mLFisher Scientific13-698-791
Ion PlusThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Sistema di purificazione dell'acqua o
Equivalente 18 MΩ sistema di libreria di		ThermoFisher4474524
Ion Plus ThermoFisher4471252
PicoPLEX WGA Tampone di amplificazioneRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Enzima di amplificazioneRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
di amplificazione Ion OneTouchNel kit: Alimentatori Ion OneTouch 2 (codice A26367). Componente del kit esteso nel foglio 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (tappo nero)Nel kit: Ion PI Hi? Q Soluzioni OT2 200 (codice A26429). Componente del kit esteso nel foglio 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA Tampone di estrazione cellulareRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Enzima di estrazione cellulareRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
Kit chip Ion PI v3ThermoFisherA26771
Minifuga chip ionico, 230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Ion Plus Kit libreriaThermoFisher4471252
Kit libreria frammenti Ion PlusThermoFisher4471252
ThermoQ– Temperatura Bagno a seccoTAMARHB-T2-A
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher Numero di catalogo: 4474778.
Kit libreria frammenti Ion PlusThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher Codice prodotto: 4469495. Componente del kit esteso nel foglio 5
EtanoloSIGMA-ALDRICH51976Questo può essere sostituito da etanolo assoluto di grado molecolare di qualsiasi marca.
PicoPLEX WGA Tampone di diluizione enzimatica per l'estrazioneRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Tampone di diluizione enzimatica per l'estrazioneRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-02.
Fluorimetro Qubit 3.0ThermoFisherQ33216Questo modello è stato sostituito dal fluorimetro Qubit 4, numero di catalogo: Q33226.
Kit di analisi Qubit ds DNA HSThermoFisherM2002-02
Provette per saggi QubitThermoFisherQ32856
Soluzione schiumogena PI ionicaThermoFisherA26772
Indice per la codifica a barre delle librerieBaseCareQuesto è un indice preparato internamente. Gli utenti possono acquistare prodotti commerciali dai kit di adattatori per codici a barre ThermoFisher Ion Xpress (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading BufferThermoFisherA26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE BufferThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
DynaMag-2 magnete (rack magnetico)ThermoFisher12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugaMicro 1775002430
Ion Plus Kit libreriaThermoFisher4471252
Acqua priva di nucleasiThermoFisherAM9922Questo può essere sostituito da un'altra marca.
PicoPLEX WGA Acqua senza nucleasiRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Bottigliadi olio Ion PI Hi? Q Soluzioni OT2 200 (codice A26429). Componente del kit esteso nel Foglio 5
Kit libreria di frammenti Ion PlusThermoFisher4471252Componente del kit esteso nel Foglio 3
DNA a doppio filamentoSi tratta di uno standard di DNA preparato internamente per la calibrazione di Qubit prima della quantificazione della libreria.
Tampone di preamplificazione PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Enzima di preamplificazioneRubicon GenomicsR30050Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.
Libreria Amplification Primer MixThermoFisher4471252Componente del kit esteso nel foglio 3
Ion OneTouch Reaction FilterComponente del kit esteso nel foglio 5
RouterComponente del kit esteso nel foglio 5
TubiComponente del kit esteso nel foglio 5
Soluzionedi risospensione ISP
Ion ProtonThermoFisherDA8600Questo modello è importato da Da An Gene Co., LTD. della Sun Yat-Sen University da ThermoFisher ed è stato certificato dalla China Food and Drug Administration per applicazioni cliniche. Il numero di catalogo di ThermoFisher è 4476610.
Ion PI Ciao? Q Sequenziamento PolimerasiThermoFisherA26772
Ion PI Sequencing Primer
server per sequenziatoreLenovoT260
Ion PI Sphere Particles Platinum
PCR SuperMix High FidelityThermoFisher4471252
Nalgene 25mm Filtri per siringaThermoFisher724-2045Dimensione dei pori: 0,45 m. Specifico per fluidi acquosi.
Ion PI Ciao? Q W2 SoluzioneThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 SoluzioneThermoFisherA26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Ciao? Q View Kit di sequenziamentoThermoFisherA30044Componente del kit esteso nel foglio 2
Kit libreria di frammenti Ion PlusThermoFisher4471252Componente del kit esteso nel foglio 3
Kit Ion PI Hi-Q Sequencing 200 (1 ciclo di sequenziamento per inizializzazione)ThermoFisherA26772Componente del kit esteso nel foglio 4
Ion PI Hi? Q OT2 200 KitThermoFisherA26434Kit esteso componente in Foglio 5
Kit libreria di frammenti frammenti Piastra frammenti frammenti Standard di di recupero di recupero

Riferimenti

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