Articolo metodologico

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

DOI:

10.3791/59282

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18 marzo 2019

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1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Abstract

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Questioni bioetiche relazionati alla manipolazione delle cellule staminali embrionali hanno ostacolato i progressi nel campo della ricerca medica. Per questo motivo, è molto importante ottenere cellule staminali adulte da diversi tessuti quali adiposo, cordone ombelicale, midollo osseo e del sangue. Tra le possibili fonti, polpa dentale è particolarmente interessante perché è facile da ottenere per quanto riguarda considerazioni bioetiche. Infatti, le cellule staminali dentarie polpa umana (hDPSCs) sono un tipo di cellule staminali adulte in grado di differenziare in cellule di un neurone-come e può essere ottenuta dal terzo molare di pazienti sani (età 13-19). In particolare, la polpa dentale è stato rimosso con un escavatore, tagliata a fette piccole, trattata con collagenasi IV e coltivata in un matraccio da. Per indurre il differenziamento neuronale, hDPSCs sono stati stimolati con EGF/bFGF per 2 settimane. Precedentemente, abbiamo dimostrato che durante il processo di differenziazione il contenuto cellulare prion proteina (PrPC) in hDPSCs aumentato. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato un'espressione precoce di PrPC che aumentato dopo il processo di differenziamento neuronale. Ablazione di PrPC di siRNA PrP ha impedito il differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF. In questa carta, illustriamo come abbiamo migliorato l'isolamento, separazione e metodi di coltivazione in vitro di hDPSCs con diverse procedure di facile, più efficienti cloni a cellula sono stato ottenuto e su larga scala l'espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) è stato osservato. Indichiamo anche come hDPSCs, ottenuti con metodi dettagliati nel protocollo, sono un eccellente modello sperimentale per studiare il processo di differenziamento di cellule staminali mesenchimali e successivi processi cellulari e molecolari.

Introduzione

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Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da diversi tessuti, compreso il midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, polpa dentaria umana, tessuto adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. come riportato da diversi autori, hDPSCs Visualizza plastica aderenza, una tipica morfologia di fibroblasto-come. Questi rappresentano una popolazione altamente eterogenea con cloni distinti e le differenze nella capacità proliferativa e differenziante7,8. hDPSCs express markers specifici per le cellule staminali mesenchimali (cioè CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), esse sono negativi per alcuni marcatori ematopoietici (quali CD14 e CD19) e sono capaci di differenziazione in vitro di multilineage9, 10,11.

Diversi autori hanno dimostrato che queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del neurone-come utilizzando protocolli diversi, che includono l'aggiunta di NGF, bFGF, EGF in combinazione con la specifica media e integratori7,12. Inoltre, molte proteine sono coinvolti durante il processo di differenziamento neuronale e, tra queste, parecchie carte mostrano un ruolo rilevante e significativa espressione della proteina prionica cellulare PrP (C), sia in cellule staminali embrionali ed adulte13, 14. PrPC rappresenta una molecola pleiotropica capace di svolgere diverse funzioni all'interno delle cellule come metabolismo del rame, apoptosi, e resistenza a ossidativo stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

Nel nostro precedente carta23, abbiamo studiato il ruolo della PrPC nel processo di differenziazione di un neurone di hDPSCs. Infatti, hDPSCs express precocemente PrPC e, dopo il differenziamento neuronale, è stato possibile osservare un aumento supplementare. Altri autori hanno supposto un ruolo possibile di PrPC nei processi di differenziamento delle cellule staminali. Infatti, PrPC spinge la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in neuroni, oligodendrociti e astrociti24. Lo scopo di questo studio era quello di sottolineare la metodologia per ottenere cellule staminali da polpa dentaria, il processo di differenziazione e il ruolo di PrPC durante il differenziamento neuronale.

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Protocollo

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Terzi molari utilizzati nello studio sono stati asportati dai pazienti (13-19 anni) con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con una adeguata igiene orale. Il giorno della spiegazione, presso il dipartimento di scienza odontoiatria e maxillo-facciale dell'Università "Sapienza" di Roma, il consenso informato è stato ottenuto da pazienti o i genitori. Il consenso informato è stato ottenuto basato su considerazioni etiche e approvazione del comitato etico.

1. dente ed estrazione della polpa dentale

  1. Preparazione del mezzo appropriato per la conservazione o il trasporto.
    1. Preparare medio bassa concentrazione per volta dell'Aquila di Dulbecco di glucosio (DMEM-L) con L-Glutammina (494,5 mL).
    2. Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) e 0,5 mL di amfotericina (0,1%).
  2. Estrarre il terzo molare dal paziente, rapidamente sciacquare con PBS, messo in una provetta da 15 mL con il mezzo e trasferirlo al laboratorio in meno di 2 ore.
  3. Sotto una cappa biohazard, aprire il dente con una fresa di passata di taglio coronale parallelo e tangente attraverso il tetto della camera pulpare.
  4. Rimuovere la polpa con un piccolo escavatore delicatamente e metterlo in una provetta.
  5. Lavare le tre volte con PBS e centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a TA.

2. trattamento della polpa dentale e rilascio di cellule staminali

  1. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in soluzione di Hank e metterlo in una capsula di Petri. Incubare per 2 ore a 37 ° C in 5% CO2.
  2. Digitare preparazione soluzione della collagenosi di IV.
    1. Preparare 0,8 mL di DMEM-L.
    2. Sciogliere 1 mg di collagenosi di IV tipo in 0,8 mL di DMEM-L e vortexare per diversi minuti.
    3. Aggiungere DMEM-L fino a 1 mL per avere una concentrazione finale di 1 mg/mL.
    4. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 µM.
  3. Rimuovere la soluzione di Hank mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a RT e dividere la polpa in fettine di circa 1 mm ciascuno con un bisturi monouso.
  4. Mettere le fettine di polpa in una capsula di Petri e incubare con 1 mL di collagenasi di tipo IV per 15 min a 37 ° C in 5% CO2.
  5. Preparazione di coltura media (500 mL).
    1. A 445 mL di DMEM-L con L-glutammina.
    2. Aggiungere 50 mL di siero bovino fetale (FBS) (10%).
    3. Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%).
  6. Centrifugare il campione a 2.500 x g per 10 min a RT, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in mezzo (punto 2.5) e cultura nella beuta T25 specifico di cellule staminali a 37 ° C in 5% CO2.

3. propagazione e coltura della cellula formativa di

  1. Ogni giorno controllare la cultura e, dopo 3 giorni di crescita, osservare diversi cloni di cellule aderenti all'interno della beuta.
  2. Ogni 3 giorni cambiare il terreno di coltura.
  3. Tra 7 e 12 giorni, una volta che le celle aderenti hanno portata confluenza, staccarli trattando le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente utilizzando un raschietto di cella.
  4. Aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) nel terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g, rimuovere il supernatante e inserire le celle in una boccetta di T25 di propagare.
    Nota: Ogni 3 giorni le cellule raggiungono la confluenza.
  6. Propagare le cellule fino a 21 o 28 giorni (circa 6-8 passaggi) per evitare la presenza di non-staminali come le cellule nella cultura.
  7. Staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o raschiare delicatamente. Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g.
  8. Rimuovere il supernatante e testare le cellule per analisi citofluorimetrica (passaggio 6).

4. transitoria PrPC tacitazione di siRNA

  1. Coltura del hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5) per 24 h.
  2. Il giorno dopo, preparare siRNA PrP medie (400 µ l).
    1. In una provetta sterile, µ l 384 DMEM-L.
    2. Aggiungere 1 µ l per ogni tipo di siRNA PrP in DMEM-L per avere una concentrazione finale di 5 nM (4 siRNA PrP sono stati utilizzati e verificati dal fornitore per garantire un atterramento efficienza ≥ 70%).
    3. Aggiungere 12 µ l di transfectionreagent in DMEM-L.
    4. Vortice la miscela e incubare per 10 min a RT per consentire la formazione di complessi di transfezione.
  3. Aggiungere 400 μL di siRNA PrP medio per ogni campione e incubare per 6 h a 37 ° C.
  4. Senza scartare siRNA PrP medio, aggiungere 1,6 mL (rapporto di 1 a 5) di terreno di coltura (punto 2.5).
  5. Lasciare le cellule per 72 h a 37 ° C.
  6. Eliminare il surnatante e lavare 3 volte con 2 mL di PBS a TA.
  7. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura neuronale per 7 o 14 giorni (punto 5.1).
  8. Cambiare il terreno di coltura neuronale ogni 3 giorni.
    Nota: Sostituire il siRNA PrP soluzione sostituire ogni volta il terreno di coltura neuronale.
  9. Alla fine del tempo, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e test per gli antigeni di superficie neuronali mediante analisi Western Blot.

5. un neurone processo di induzione di hDPSCs

  1. Preparazione del terreno di coltura neuronale (500 mL).
    1. Preparare 444,7 mL di media basale formulato di cellule neuronali.
    2. Sul supporto di aggiungere 50 mL di supplemento privo di siero utilizzato per sostenere la redditività a lungo termine delle cellule staminali embrionali ed adulte neuronale (10%).
    3. Aggiungere 200 µ l di basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentrazione finale 40 ng/mL) e 100 µ l di fattore di crescita epidermico (EGF) al mezzo (concentrazione finale 20 ng/mL).
    4. Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) al mezzo.
  2. Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) fino a 28 giorni dalla separazione della polpa e stimolarli con 2 mL di terreno di coltura neuronale.
  3. Ogni 3 giorni scartare il surnatante, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e sostituire 2 mL di terreno di coltura neuronale.
  4. Dopo 7 o 14 giorni, staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente con un raschietto.
  5. Aggiungere 4 mL (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.
  6. Verificare la presenza di antigeni di superficie neuronali (passaggio 6) o l'espressione della proteina prionica (passaggio 7) analisi di citometria a flusso.

6. caratterizzazione di hDPSCs tramite flusso Cytometry

  1. Selezionare stromali mesenchimali (MSC)-neuronali o specifici antigeni di superficie.
  2. Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).
  3. Staccare hDPSCs a 28 giorni dalla separazione della polpa dentale o dopo 14 giorni di un neurone di coltura (passaggio 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente un raschietto.
  4. aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina e centrifugato a 259 x g per 6 minuti a TA. altro lavare 2 volte con 2 mL di PBS a TA.
  5. Difficoltà il hDPSCs non trattata o trattata con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS con tensioattivi non ionici 0.1% (v/v) in PBS per altri 10 min a TA.
  7. Eseguire il blocco con 5% latte scremato in polvere in 1 mL di PBS per 1 h a TA.
  8. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS e incubare le cellule con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 cellule) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 cellule) mAb per 1 h a TA.
  9. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS e incubare con PE anti-topo (01:50 / 5 x 105 cellule) o anti-coniglio CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 celle) per ulteriore 1 h a TA.
  10. Utilizzare gli anticorpi secondari per gating le cellule immunopositive (anti-topo PE o anti-coniglio CY5 mAb) e analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.

7. valutazione dell'espressione di PrPC in hDPSCs di analisi di citometria a flusso

  1. Cultura la hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).
  2. Staccare hDPSCs alle 21 e 28 giorni dalla separazione della polpa dentale e dopo 7 o 14 giorni con terreno di coltura neuronale (azione 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA e fermare l'azione di tripsina, come descritto al punto 6.4. Difficoltà gli esemplari con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.
  3. Permeabilize con 0.1% (v/v) non ionici surfactantin PBS per 10 min a RT. rimuovere il surnatante e macchia le celle con coniglio anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per 1h a RT. Incubare con anti-coniglio CY5 (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per ulteriore 1 h a TA.
  4. Analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.

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Risultati

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Le procedure di isolamento e la separazione di hDPSCs da polpa dentaria, ottenuta dal terzo molare, sono processi complessi, in cui piccoli cambiamenti possono portare un risultato rovinoso. In questa carta, utilizziamo il protocollo di Arthur et al.. 12 con molti nuovi miglioramenti. Uno schema rappresentativo delle procedure è illustrato nella Figura 1.

hDPSCs rapp...

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Discussione

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In questo lavoro, ci siamo concentrati sulla metodologia per l'isolamento e la differenziazione di un neurone di hDPSCs; Inoltre, abbiamo valutato il ruolo di PrPC in questo processo. Esistono diversi metodi per isolare e differenziare hDPSCs nel neurone-come le cellule e passaggi critici durante il processo. hDPSCs sono in grado di differenziare in diversi lignaggi quali condroblasti, adipociti, osteoblasti e neuroni. Nella nostra carta, abbiamo studiato i meccanismi di differenziamento neuronale e la presenz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Varrone" e Hub di Università di Rieti "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.

Figura 5 (A, B) ristampato con il permesso dell'editore Taylor & Francis Ltd da: complesso multimolecolare di ruolo del Prion protein-EGFR durante il differenziamento neuronale della polpa dentale umane cellule staminali. Martellucci, S., Manganelli V., C. Santacroce, F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di amfotericina BSigma-AldrichA2942Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare, è un antibiotico antimicotico polienico della
anti-B3tubulina #4466Una delle sei isoforme della B-tubulina, è altamente espressa durante lo sviluppo fetale e postnatale, rimanendo alta nel sistema nervoso periferico
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), una delle principali glicoproteine dell'endotelio vascolare umano, è una proteina integrale di membrana di tipo I con una grande regione extracellulare, una regione transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica corta
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulAnticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
Anti-CD73 Tecnologia di segnalazione cellulare 13160CD73 è una glicoproteina legata alla membrana ancorata al glicosil fosfatidilinositolo da 70 kDa che catalizza l'idrolisi dei monofosfati nucleosidici extracellulari in nucleosidi bioattivi
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulAnticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
Anti-GAP43 Tecnologia di segnalazione cellulare #8945È una proteina specifica del sistema nervoso, associata alla crescita nei coni di crescita e nelle aree ad alta plasticità
Abcamab7003è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS
Anti-NFH Tecnologia di segnalazione cellulare #2836È un anticorpo che rileva i livelli endogeni della proteina totale Neurofilamento-H
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Coniglio monoclonale [EP 1802Y] a proteina prionica PrP
Anti-coniglio CY5 Abcamab6564è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulAnticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
B27 Supp XF CTSGibco di life technologiesA14867-01B-27  può essere utilizzato per supportare l'induzione di cellule staminali neurali umane (hNSC) da cellule staminali pluripotenti (PSC), l'espansione di hNSC, differenziazione delle hNSCs e mantenimento di neuroni differenziati maturi in coltura
Citometro a flusso BD Accuri C6BD BiosciencesAC6531180187Citometro a flusso dotato di un laser blu (488 nm) e di un laser rosso (640 nm)
Software BD Accuri C6.BD BiosciencesControlla il sistema di citometro a flusso BD Accuri C6 al fine di acquisire dati, generare statistiche e analizzare i risultati
bFGFPeproThec, DBA100-18BFattore di crescita dei fibroblasti di base
Centrifuga CL30RTermo fisher Scientific11210908è un dispositivo che viene utilizzato per la separazione di fluidi, gas o liquidi, a base di densità
CO2 Incubatore 3541Termo fisher Scientific317527-185assicura condizioni di crescita ottimali e riproducibili per colture cellulari
Collagenasi, tipo IV Life Technologies17104019Collagenase è una proteasi che scinde il legame tra un amminoacido neutro (X) e la glicina nella sequenza Pro-X-Glyc-Pro, che si trova con alta frequenza nel collagene
Bisturi usa e gettaSwann-Morton501Viene utilizzato per tagliare i tessuti
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutammina con Sodium Pyruvato
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermal Growth Factor 
Il siero fetale bovinoGibco di life technologies10270-106FBS è un popolare integratore multimediale perché fornisce un'ampia gamma di funzioni nella coltura cellulare. FBS fornisce nutrienti, fattori di crescita e di attaccamento e protegge le cellule dal danno ossidativo e dall'apoptosi grazie a meccanismi difficili da riprodurre nei sistemi di terreni privi di siero (SFM)
Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro per flaconiSarstedt831.823.101è un dispositivo che viene utilizzato per la filtrazione di soluzioni
Flexitube GeneSolution per PRNPQiagenGS56214 siRNA per il gene Entrez 5621. Sequenza target N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  La
soluzione di Hank 1xGibco by life technologies240200083La funzione essenziale di Hanks′ La soluzione salina bilanciata serve a mantenere il pH e l'equilibrio osmotico. Fornisce inoltre acqua e ioni inorganici essenziali alle cellule
Reagente di trasfezione HiPerFect reagente di trasfezione HiPerFect di Qiagen 301705 è una miscela unica di lipidi cationici e neutri che consente un efficace assorbimento di siRNA e un rilascio efficiente di siRNA all'interno delle cellule, con conseguente elevato knockdown genico anche quando si utilizzano basse concentrazioni di siRNA
Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium è un terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di neuroni cerebrali puri post-natali e adulti.
ParaformaldeideSigma-Aldrich30525-89-4La paraformaldeide è stata utilizzata per il fissaggio di cellule e sezioni di tessuto durante le procedure di colorazione
penicillina/streptomicina EurocloneECB3001D Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare per controllare la contaminazione batterica
Soluzione salina tamponata con fosfato  (PBS)EurocloneECB4004LX10 Il PBS è una soluzione salina bilanciata utilizzata per la manipolazione e la coltura di cellule di mammifero. La PBS è usata per irrigare, lavare e diluire le cellule dei mammiferi. Il tampone fosfato mantiene il pH nell'intervallo fisiologico
TC-Platte 6 pozzetto, Cell+,FSarstedt833,920,300È una superficie di crescita per cellule aderenti
Pallone per colture tissutali T-25,Cell+,Tappo ventilatoSarstedt833,910,302Pallone per colture tissutali T-25, polistirene, superficie di crescita Cell+ per cellule aderenti sensibili, ad es. cellule primarie, collo inclinato, cappuccio di ventilazione, giallo, sterile, apirogeno, non citotossico, 10 pz./borsa
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Tensioattivo non ionico ampiamente usato per il recupero di componenti di membrana in condizioni lievi non denaturanti
Tripsina-EDTA EurocloneECB3052D La tripsina scinde i peptidi sul lato C-terminale dei residui di aminoacidi di lisina e arginina. La tripsina viene utilizzata per rimuovere le cellule aderenti da una superficie di coltura
ProvettaSarstedt62.554.502Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Offre una protezione totale per l'ambiente e il lavoratore
ZEISS Axio Vert.A1 Invertito  MicroscopioZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 offre un prezzo base unico e può fornire tutte le tecniche di contrasto, tra cui campo chiaro, contrasto di fase, PlasDIC, VAREL, contrasto di modulazione Hoffman migliorato (iHMC), DIC e fluorescenza. Incorpora l'illuminazione a LED per un imaging delicato per le cellule marcate in fluorescenza. Axio Vert.A1 è progettato ergonomicamente per il lavoro di routine e abbastanza compatto da poter essere posizionato all'interno di cappe per colture tissutali.
tecnologia di segnalazione cellulare di StreptomyceIl

Riferimenti

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