Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Abstract

Questioni bioetiche relazionati alla manipolazione delle cellule staminali embrionali hanno ostacolato i progressi nel campo della ricerca medica. Per questo motivo, è molto importante ottenere cellule staminali adulte da diversi tessuti quali adiposo, cordone ombelicale, midollo osseo e del sangue. Tra le possibili fonti, polpa dentale è particolarmente interessante perché è facile da ottenere per quanto riguarda considerazioni bioetiche. Infatti, le cellule staminali dentarie polpa umana (hDPSCs) sono un tipo di cellule staminali adulte in grado di differenziare in cellule di un neurone-come e può essere ottenuta dal terzo molare di pazienti sani (età 13-19). In particolare, la polpa dentale è stato rimosso con un escavatore, tagliata a fette piccole, trattata con collagenasi IV e coltivata in un matraccio da. Per indurre il differenziamento neuronale, hDPSCs sono stati stimolati con EGF/bFGF per 2 settimane. Precedentemente, abbiamo dimostrato che durante il processo di differenziazione il contenuto cellulare prion proteina (PrP^C) in hDPSCs aumentato. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato un'espressione precoce di PrP^C che aumentato dopo il processo di differenziamento neuronale. Ablazione di PrP^C di siRNA PrP ha impedito il differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF. In questa carta, illustriamo come abbiamo migliorato l'isolamento, separazione e metodi di coltivazione in vitro di hDPSCs con diverse procedure di facile, più efficienti cloni a cellula sono stato ottenuto e su larga scala l'espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) è stato osservato. Indichiamo anche come hDPSCs, ottenuti con metodi dettagliati nel protocollo, sono un eccellente modello sperimentale per studiare il processo di differenziamento di cellule staminali mesenchimali e successivi processi cellulari e molecolari.

Introduzione

Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da diversi tessuti, compreso il midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, polpa dentaria umana, tessuto adiposo e sangue^{1,2,3,4,5 , 6}. come riportato da diversi autori, hDPSCs Visualizza plastica aderenza, una tipica morfologia di fibroblasto-come. Questi rappresentano una popolazione altamente eterogenea con cloni distinti e le differenze nella capacità proliferativa e differenziante^7,

Protocollo

Terzi molari utilizzati nello studio sono stati asportati dai pazienti (13-19 anni) con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con una adeguata igiene orale. Il giorno della spiegazione, presso il dipartimento di scienza odontoiatria e maxillo-facciale dell'Università "Sapienza" di Roma, il consenso informato è stato ottenuto da pazienti o i genitori. Il consenso informato è stato ottenuto basato su considerazioni etiche e approvazione del comitato etico.

1. dente ed estrazione della polpa dentale

1. Preparazione del mezzo appropriato per la conservazione o il trasporto.
   1. Preparare medi....

Risultati

Le procedure di isolamento e la separazione di hDPSCs da polpa dentaria, ottenuta dal terzo molare, sono processi complessi, in cui piccoli cambiamenti possono portare un risultato rovinoso. In questa carta, utilizziamo il protocollo di Arthur et al.. ¹² con molti nuovi miglioramenti. Uno schema rappresentativo delle procedure è illustrato nella Figura 1.

hDPSCs rapp.......

Discussione

In questo lavoro, ci siamo concentrati sulla metodologia per l'isolamento e la differenziazione di un neurone di hDPSCs; Inoltre, abbiamo valutato il ruolo di PrP^C in questo processo. Esistono diversi metodi per isolare e differenziare hDPSCs nel neurone-come le cellule e passaggi critici durante il processo. hDPSCs sono in grado di differenziare in diversi lignaggi quali condroblasti, adipociti, osteoblasti e neuroni. Nella nostra carta, abbiamo studiato i meccanismi di differenziamento neuronale e la presenz.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di amfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942	Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare, è un antibiotico antimicotico polienico della
anti-B3tubulina		#4466	Una delle sei isoforme della B-tubulina, è altamente espressa durante lo sviluppo fetale e postnatale, rimanendo alta nel sistema nervoso periferico
Anti-CD105	BD Biosciences	611314	Endoglin (CD105), una delle principali glicoproteine dell'endotelio vascolare umano, è una proteina integrale di membrana di tipo I con una grande regione extracellulare, una regione transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica corta
Anti-CD44	Millipore	CBL154-20ul	Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
Anti-CD73	Tecnologia di segnalazione cellulare	13160	CD73 è una glicoproteina legata alla membrana ancorata al glicosil fosfatidilinositolo da 70 kDa che catalizza l'idrolisi dei monofosfati nucleosidici extracellulari in nucleosidi bioattivi
Anti-CD90	Millipore	CBL415-20ul	Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
Anti-GAP43	Tecnologia di segnalazione cellulare	#8945	È una proteina specifica del sistema nervoso, associata alla crescita nei coni di crescita e nelle aree ad alta plasticità
	Abcam	ab7003	è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS
Anti-NFH	Tecnologia di segnalazione cellulare	#2836	È un anticorpo che rileva i livelli endogeni della proteina totale Neurofilamento-H
Anti-PrP mAb EP1802Y	Abcam	ab52604	Coniglio monoclonale [EP 1802Y] a proteina prionica PrP
Anti-coniglio CY5	Abcam	ab6564	è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS
Anti-STRO 1	Millipore	MAB4315-20ul	Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali
B27 Supp XF CTS	Gibco di life technologies	A14867-01	B-27  può essere utilizzato per supportare l'induzione di cellule staminali neurali umane (hNSC) da cellule staminali pluripotenti (PSC), l'espansione di hNSC, differenziazione delle hNSCs e mantenimento di neuroni differenziati maturi in coltura
Citometro a flusso BD Accuri C6	BD Biosciences	AC6531180187	Citometro a flusso dotato di un laser blu (488 nm) e di un laser rosso (640 nm)
Software BD Accuri C6.	BD Biosciences		Controlla il sistema di citometro a flusso BD Accuri C6 al fine di acquisire dati, generare statistiche e analizzare i risultati
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	Fattore di crescita dei fibroblasti di base
Centrifuga CL30R	Termo fisher Scientific	11210908	è un dispositivo che viene utilizzato per la separazione di fluidi, gas o liquidi, a base di densità
CO2 Incubatore 3541	Termo fisher Scientific	317527-185	assicura condizioni di crescita ottimali e riproducibili per colture cellulari
Collagenasi, tipo IV	Life Technologies	17104019	Collagenase è una proteasi che scinde il legame tra un amminoacido neutro (X) e la glicina nella sequenza Pro-X-Glyc-Pro, che si trova con alta frequenza nel collagene
Bisturi usa e getta	Swann-Morton	501	Viene utilizzato per tagliare i tessuti
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutammina con Sodium Pyruvato
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15	Epidermal Growth Factor
Il siero fetale bovino	Gibco di life technologies	10270-106	FBS è un popolare integratore multimediale perché fornisce un'ampia gamma di funzioni nella coltura cellulare. FBS fornisce nutrienti, fattori di crescita e di attaccamento e protegge le cellule dal danno ossidativo e dall'apoptosi grazie a meccanismi difficili da riprodurre nei sistemi di terreni privi di siero (SFM)
Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro per flaconi	Sarstedt	831.823.101	è un dispositivo che viene utilizzato per la filtrazione di soluzioni
Flexitube GeneSolution per PRNP	Qiagen	GS5621	4 siRNA per il gene Entrez 5621. Sequenza target N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  La
soluzione di Hank 1x	Gibco by life technologies	240200083	La funzione essenziale di Hanks′ La soluzione salina bilanciata serve a mantenere il pH e l'equilibrio osmotico. Fornisce inoltre acqua e ioni inorganici essenziali alle cellule
Reagente di trasfezione HiPerFect		reagente di trasfezione HiPerFect di Qiagen 301705 è una miscela unica di lipidi cationici e neutri che consente un efficace assorbimento di siRNA e un rilascio efficiente di siRNA all'interno delle cellule, con conseguente elevato knockdown genico anche quando si utilizzano basse concentrazioni di siRNA
	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A Medium è un terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di neuroni cerebrali puri post-natali e adulti.
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	30525-89-4	La paraformaldeide è stata utilizzata per il fissaggio di cellule e sezioni di tessuto durante le procedure di colorazione
penicillina/streptomicina	Euroclone	ECB3001D	Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare per controllare la contaminazione batterica
Soluzione salina tamponata con fosfato  (PBS)	Euroclone	ECB4004LX10	Il PBS è una soluzione salina bilanciata utilizzata per la manipolazione e la coltura di cellule di mammifero. La PBS è usata per irrigare, lavare e diluire le cellule dei mammiferi. Il tampone fosfato mantiene il pH nell'intervallo fisiologico
TC-Platte 6 pozzetto, Cell+,F	Sarstedt	833,920,300	È una superficie di crescita per cellule aderenti
Pallone per colture tissutali T-25,Cell+,Tappo ventilato	Sarstedt	833,910,302	Pallone per colture tissutali T-25, polistirene, superficie di crescita Cell+ per cellule aderenti sensibili, ad es. cellule primarie, collo inclinato, cappuccio di ventilazione, giallo, sterile, apirogeno, non citotossico, 10 pz./borsa
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Tensioattivo non ionico ampiamente usato per il recupero di componenti di membrana in condizioni lievi non denaturanti
Tripsina-EDTA	Euroclone	ECB3052D	La tripsina scinde i peptidi sul lato C-terminale dei residui di aminoacidi di lisina e arginina. La tripsina viene utilizzata per rimuovere le cellule aderenti da una superficie di coltura
Provetta	Sarstedt	62.554.502	Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	Offre una protezione totale per l'ambiente e il lavoratore
ZEISS Axio Vert.A1 Invertito  Microscopio	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1 offre un prezzo base unico e può fornire tutte le tecniche di contrasto, tra cui campo chiaro, contrasto di fase, PlasDIC, VAREL, contrasto di modulazione Hoffman migliorato (iHMC), DIC e fluorescenza. Incorpora l'illuminazione a LED per un imaging delicato per le cellule marcate in fluorescenza. Axio Vert.A1 è progettato ergonomicamente per il lavoro di routine e abbastanza compatto da poter essere posizionato all'interno di cappe per colture tissutali.