Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.
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Articolo metodologico
Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questioni bioetiche relazionati alla manipolazione delle cellule staminali embrionali hanno ostacolato i progressi nel campo della ricerca medica. Per questo motivo, è molto importante ottenere cellule staminali adulte da diversi tessuti quali adiposo, cordone ombelicale, midollo osseo e del sangue. Tra le possibili fonti, polpa dentale è particolarmente interessante perché è facile da ottenere per quanto riguarda considerazioni bioetiche. Infatti, le cellule staminali dentarie polpa umana (hDPSCs) sono un tipo di cellule staminali adulte in grado di differenziare in cellule di un neurone-come e può essere ottenuta dal terzo molare di pazienti sani (età 13-19). In particolare, la polpa dentale è stato rimosso con un escavatore, tagliata a fette piccole, trattata con collagenasi IV e coltivata in un matraccio da. Per indurre il differenziamento neuronale, hDPSCs sono stati stimolati con EGF/bFGF per 2 settimane. Precedentemente, abbiamo dimostrato che durante il processo di differenziazione il contenuto cellulare prion proteina (PrPC) in hDPSCs aumentato. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato un'espressione precoce di PrPC che aumentato dopo il processo di differenziamento neuronale. Ablazione di PrPC di siRNA PrP ha impedito il differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF. In questa carta, illustriamo come abbiamo migliorato l'isolamento, separazione e metodi di coltivazione in vitro di hDPSCs con diverse procedure di facile, più efficienti cloni a cellula sono stato ottenuto e su larga scala l'espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) è stato osservato. Indichiamo anche come hDPSCs, ottenuti con metodi dettagliati nel protocollo, sono un eccellente modello sperimentale per studiare il processo di differenziamento di cellule staminali mesenchimali e successivi processi cellulari e molecolari.
Introduzione
Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da diversi tessuti, compreso il midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, polpa dentaria umana, tessuto adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. come riportato da diversi autori, hDPSCs Visualizza plastica aderenza, una tipica morfologia di fibroblasto-come. Questi rappresentano una popolazione altamente eterogenea con cloni distinti e le differenze nella capacità proliferativa e differenziante7,
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Protocollo
Terzi molari utilizzati nello studio sono stati asportati dai pazienti (13-19 anni) con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con una adeguata igiene orale. Il giorno della spiegazione, presso il dipartimento di scienza odontoiatria e maxillo-facciale dell'Università "Sapienza" di Roma, il consenso informato è stato ottenuto da pazienti o i genitori. Il consenso informato è stato ottenuto basato su considerazioni etiche e approvazione del comitato etico.
1. dente ed estrazione della polpa dentale
-
Preparazione del mezzo appropriato per la conservazione o il trasporto.
- Preparare medi....
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Risultati
Le procedure di isolamento e la separazione di hDPSCs da polpa dentaria, ottenuta dal terzo molare, sono processi complessi, in cui piccoli cambiamenti possono portare un risultato rovinoso. In questa carta, utilizziamo il protocollo di Arthur et al.. 12 con molti nuovi miglioramenti. Uno schema rappresentativo delle procedure è illustrato nella Figura 1.
hDPSCs rapp.......
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Discussione
In questo lavoro, ci siamo concentrati sulla metodologia per l'isolamento e la differenziazione di un neurone di hDPSCs; Inoltre, abbiamo valutato il ruolo di PrPC in questo processo. Esistono diversi metodi per isolare e differenziare hDPSCs nel neurone-come le cellule e passaggi critici durante il processo. hDPSCs sono in grado di differenziare in diversi lignaggi quali condroblasti, adipociti, osteoblasti e neuroni. Nella nostra carta, abbiamo studiato i meccanismi di differenziamento neuronale e la presenz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Varrone" e Hub di Università di Rieti "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) ristampato con il permesso dell'editore Taylor & Francis Ltd da: complesso multimolecolare di ruolo del Prion protein-EGFR durante il differenziamento neuronale della polpa dentale umane cellule staminali. Martellucci, S., Manganelli V., C. Santacroce, F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di amfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare, è un antibiotico antimicotico polienico della |
| anti-B3tubulina | #4466 | Una delle sei isoforme della B-tubulina, è altamente espressa durante lo sviluppo fetale e postnatale, rimanendo alta nel sistema nervoso periferico | |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), una delle principali glicoproteine dell'endotelio vascolare umano, è una proteina integrale di membrana di tipo I con una grande regione extracellulare, una regione transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica corta |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali |
| Anti-CD73 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 13160 | CD73 è una glicoproteina legata alla membrana ancorata al glicosil fosfatidilinositolo da 70 kDa che catalizza l'idrolisi dei monofosfati nucleosidici extracellulari in nucleosidi bioattivi |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali |
| Anti-GAP43 | Tecnologia di segnalazione cellulare | #8945 | È una proteina specifica del sistema nervoso, associata alla crescita nei coni di crescita e nelle aree ad alta plasticità |
| Abcam | ab7003 | è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS | |
| Anti-NFH | Tecnologia di segnalazione cellulare | #2836 | È un anticorpo che rileva i livelli endogeni della proteina totale Neurofilamento-H |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Coniglio monoclonale [EP 1802Y] a proteina prionica PrP |
| Anti-coniglio CY5 | Abcam | ab6564 | è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali |
| B27 Supp XF CTS | Gibco di life technologies | A14867-01 | B-27 può essere utilizzato per supportare l'induzione di cellule staminali neurali umane (hNSC) da cellule staminali pluripotenti (PSC), l'espansione di hNSC, differenziazione delle hNSCs e mantenimento di neuroni differenziati maturi in coltura |
| Citometro a flusso BD Accuri C6 | BD Biosciences | AC6531180187 | Citometro a flusso dotato di un laser blu (488 nm) e di un laser rosso (640 nm) |
| Software BD Accuri C6. | BD Biosciences | Controlla il sistema di citometro a flusso BD Accuri C6 al fine di acquisire dati, generare statistiche e analizzare i risultati | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | Fattore di crescita dei fibroblasti di base |
| Centrifuga CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | è un dispositivo che viene utilizzato per la separazione di fluidi, gas o liquidi, a base di densità |
| CO2 Incubatore 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | assicura condizioni di crescita ottimali e riproducibili per colture cellulari |
| Collagenasi, tipo IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase è una proteasi che scinde il legame tra un amminoacido neutro (X) e la glicina nella sequenza Pro-X-Glyc-Pro, che si trova con alta frequenza nel collagene |
| Bisturi usa e getta | Swann-Morton | 501 | Viene utilizzato per tagliare i tessuti |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutammina con Sodium Pyruvato |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Il siero fetale bovino | Gibco di life technologies | 10270-106 | FBS è un popolare integratore multimediale perché fornisce un'ampia gamma di funzioni nella coltura cellulare. FBS fornisce nutrienti, fattori di crescita e di attaccamento e protegge le cellule dal danno ossidativo e dall'apoptosi grazie a meccanismi difficili da riprodurre nei sistemi di terreni privi di siero (SFM) |
| Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro per flaconi | Sarstedt | 831.823.101 | è un dispositivo che viene utilizzato per la filtrazione di soluzioni |
| Flexitube GeneSolution per PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNA per il gene Entrez 5621. Sequenza target N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 La |
| soluzione di Hank 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | La funzione essenziale di Hanks′ La soluzione salina bilanciata serve a mantenere il pH e l'equilibrio osmotico. Fornisce inoltre acqua e ioni inorganici essenziali alle cellule |
| Reagente di trasfezione HiPerFect | reagente di trasfezione HiPerFect di Qiagen 301705 è una miscela unica di lipidi cationici e neutri che consente un efficace assorbimento di siRNA e un rilascio efficiente di siRNA all'interno delle cellule, con conseguente elevato knockdown genico anche quando si utilizzano basse concentrazioni di siRNA | ||
| Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium è un terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di neuroni cerebrali puri post-natali e adulti. | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | La paraformaldeide è stata utilizzata per il fissaggio di cellule e sezioni di tessuto durante le procedure di colorazione |
| penicillina/streptomicina | Euroclone | ECB3001D | Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare per controllare la contaminazione batterica |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | Il PBS è una soluzione salina bilanciata utilizzata per la manipolazione e la coltura di cellule di mammifero. La PBS è usata per irrigare, lavare e diluire le cellule dei mammiferi. Il tampone fosfato mantiene il pH nell'intervallo fisiologico |
| TC-Platte 6 pozzetto, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | È una superficie di crescita per cellule aderenti |
| Pallone per colture tissutali T-25,Cell+,Tappo ventilato | Sarstedt | 833,910,302 | Pallone per colture tissutali T-25, polistirene, superficie di crescita Cell+ per cellule aderenti sensibili, ad es. cellule primarie, collo inclinato, cappuccio di ventilazione, giallo, sterile, apirogeno, non citotossico, 10 pz./borsa |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Tensioattivo non ionico ampiamente usato per il recupero di componenti di membrana in condizioni lievi non denaturanti |
| Tripsina-EDTA | Euroclone | ECB3052D | La tripsina scinde i peptidi sul lato C-terminale dei residui di aminoacidi di lisina e arginina. La tripsina viene utilizzata per rimuovere le cellule aderenti da una superficie di coltura |
| Provetta | Sarstedt | 62.554.502 | Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offre una protezione totale per l'ambiente e il lavoratore |
| ZEISS Axio Vert.A1 Invertito Microscopio | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 offre un prezzo base unico e può fornire tutte le tecniche di contrasto, tra cui campo chiaro, contrasto di fase, PlasDIC, VAREL, contrasto di modulazione Hoffman migliorato (iHMC), DIC e fluorescenza. Incorpora l'illuminazione a LED per un imaging delicato per le cellule marcate in fluorescenza. Axio Vert.A1 è progettato ergonomicamente per il lavoro di routine e abbastanza compatto da poter essere posizionato all'interno di cappe per colture tissutali. |
Riferimenti
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 4....
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Ristampe e permessi
