Colorimetrico analisi di alcalino fosfatasi attività in Biofilm di S. aureus

Sommario

In questo manoscritto, abbiamo stabilito un metodo di alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina nella coltura di biofilm di S. aureus dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti

Abstract

Fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima comune espresso in cellule sia procariote ed eucariote. Esso catalizza l'idrolisi di monoesteri di fosfato da molte molecole a base pH e svolge un ruolo indispensabile nel metabolismo del fosfato. In esseri umani, eucariotiche ALP è uno dei segnali enzimatici maggiormente utilizzati nella diagnosi di varie malattie, quali la colestasi ed il rachitismo. In S. aureus, ALP è rilevato esclusivamente sulla membrana cellulare; essa si esprime anche come una forma secretiva pure. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la sua funzione nella formazione del biofilm.

Lo scopo di questo manoscritto è quello di sviluppare un'analisi rapida e affidabile per misurare l'attività ALP nel biofilm di S. aureus che non richiedono l'isolamento di proteine. Utilizzando p-nitrofenil fosfato (pNPP) come substrato, abbiamo misurato ALP attività in biofilm di S. aureus formata in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Attività si basava sulla formazione del prodotto solubile reazione misurata di assorbanza di 405 nm. La natura elevato throughput del metodo della piastra di coltura del tessuto ben 96 fornisce un metodo sensibile e riproducibile per analisi di attività ALP. Lo stesso sperimentale istituito può essere esteso anche per misurare altri marcatori molecolari extracellulare legate alla formazione del biofilm.

Introduzione

Fosfatasi alcalina (ALP) è espressa ubiquitariamente in entrambe le cellule procariote ed eucariote¹. Esso può catalizzare l'idrolisi di monofosfato da diverse molecole come nucleotidi, proteine, alcaloidi, esteri fosforici e anidridi di acido fosforico. In esseri umani, ALP eucariotica è presente in molti tessuti compreso fegato, ossa, intestino e placenta². Svolge i ruoli importanti nella fosforilazione della proteina, crescita cellulare, apoptosi, i processi delle cellule staminali come pure normale mineralizzazione scheletrica. Eucariotiche ALP è anche un indicatore chiave del siero per la presenza di malattie in oss....

Protocollo

1. preparazione media

1. Preparare 1 L di brodo di soia triptico (TSB): in 1 L di acqua distillata, aggiungere 15 g di digerito pancreatico di caseina, 5 g di papaico di farina di soia, 3 g di cloruro di sodio, 2,5 g di destrosio e 2,5 g di fosfato dipotassico. Sterilizzare prima dell'uso.
2. Per Tryptic Soy Agar (TSA), aggiungere 15 g di agar a 1 L di TSB, autoclave. Poi lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente. Successivamente, versare in un rapporto di 20 mL per piastra di Petri (100 x 15 mm).
3. Terreno di coltura di biofilm: aggiungere 10 g di glucosio a 1 L di TSB in autoclave. Sterilizzare mediante filtrazione utilizzando un filtro ....

Risultati

La figura 1 Mostra un risultato rappresentativo dell'attività ALP da culture di biofilm di S. aureus in piastre di coltura tissutale ben 96. 75 μL di soluzione di pNPP commercialmente disponibile è stato aggiunto a ogni bene e incubate a temperatura ambiente. Dopo incubazione per diverse volte (0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min, rispettivamente) 75 μL di 5 M NaOH è stato aggiunto per arrestare la reazione. Il prodotto quindi è stato misurato.......

Discussione

Nella nostra analisi, abbiamo usato pNPP come il substrato ALP. Si tratta di una soluzione di lavoro progettata per ELISA e Nessuna diluizione è necessaria. Dopo l'idrolisi di ALP, un prodotto giallo si sviluppa e può essere misurato a 405 nm. Alla fine della reazione enzimatica, abbiamo brevemente centrifugato la piastra ben 96 e trasferito il surnatante in un piatto ben 96 fresco per misurare l'assorbanza utilizzando il lettore di piastra. Abbiamo trovato che questo passaggio di centrifugazione supplementare è fondamen.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuga	Thomas Scientific	5810
Gluosio	VWR	50-99-7
Pellet NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Le concentrazioni tipiche dei substrati liquidi pNPP, spesso utilizzati nei saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), variano tra 10 e 50 mM. Simile alla maggior parte dei substrati liquidi pNPP pronti all'uso come quello utilizzato qui, l'esatta concentrazione di pNPP non viene divulgata a causa della sua natura proprietaria.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Lettore di piastre	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Agar di soia trittico           15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Brodo di soia triptico:          g/L Digestato pancreatico della caseina............ 15.0 Digesto papaico della farina di soia......... 5,00 Cloruro di sodio.............................. 3,00 Destrosio........................................   2,50 fosfato dipotassico.................. 2.50	VWR	90006-098
Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti	BD	6902D09	Fondo a forma di U