Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Sommario

In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l'affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.

Abstract

I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d'argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

Introduzione

Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l'estensione e la retrazione 1,^2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi^4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall'analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica^6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in....

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di RIKEN Wako.

1. Cultura dei neuroni ippocampali

1. Preparazione del mezzo culturale
   1. Preparazione del mix di vitamine 200x. Sciogliere 100 mg di sale di emicalcio acido Pantotenico, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di i-inositolo, 100 mg di niacinamide, 100 mg di HCl piruridossiale e 100 mg di tiamina HCl in 500 mL di acqua ultrapura. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.
   2. P....

Risultati

Nei neuroni ippocampali coltivati, TLCN è stato abbondantemente localizzato alla filopodia dendritica, albero, e soma e colocalizzato con F-actin (Figura 1A, B). Quando le microsfere di polistirolo sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati, le perline sono state automaticamente rivestite con vitronectina (VN) derivata dal siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di coltura; erano principalmente legati ai dendriti, e indotto la formazion.......

Discussione

Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione PSD.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1,7 mLl MCT a basso legame	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutammina	Gibco	2530149
35 mm piastre per colture cellulari	in plastica Corning	430165
Anti-actina	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alfa-actina	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alfa-tubulina	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo	23227
Blu di bromofenolo	Merck	1.08122.0005
Crolide di calcio, idrato	Wako	038-19735
Raschietto cellulare	Falcon	353085
Filtro cellulare	Falcon	352350
Cloruro di colina	Sigma-Aldrich	C7527
Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	11873580001
Citosina beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Acido pantotenico sale emicalcico	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnete	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Reagente di rilevamento	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gel gradiente	ATTO	E-T520L
Acido folico	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-coniugato anti-coniglio IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositolo	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	Per il rilevamento della luminescenza dalla membrana WB
Microsfere magnetiche di polistirene	Sperotech	PM-20-10
MEM soluzione di amminoacidi	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginina cloridrato, 5 mM L-Cistina, 10 mM L-Istidina cloridrato-H2O, 20 mM L-Isoleucina, 20 mM L-Leucina, 19,8 mM L-Lisina cloridrato, 5,1 mM L-Metionina, 10 mM L-Fenilalanina, 20 mM L-Treonina, 2,5 mM L-Triptofano, 10 mM L-Tirosina e 20 mM L-Valina
Sistema di elettroforesi di dimensioni mini-lastra	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilina / Streptomicina	Gibco	15070063
Cocktail di inibitori della fosfatasi PhosSTOP	Roche	4906845001
Idrobromuro di poli-L-lisina	Nacali	28360-14
Piridossale HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavina	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako		Wako 291-5031
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Cella di trasferimento semi-secca	Bio-rad	1703940JA
Acqua ultra pura	MilliQ		Per la produzione di acqua ultra pura