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Articolo metodologico

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

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DOI:

10.3791/59297

⸱

18 aprile 2019

 , 
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In questo articolo

Sommario

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Abstract

La pelle è il più grande organo del corpo e ha molte funzioni. La pelle agisce come una barriera fisica e protettore del corpo e regola le funzioni corporee. Biomimetica è l'imitazione dei modelli, sistemi e gli elementi della natura allo scopo di risolvere complessi problemi umani1. Pelle biomimetica è uno strumento utile per la ricerca di malattia in vitro e in vivo della medicina rigenerativa. Cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) hanno la caratteristica di proliferazione illimitata e la capacità di differenziazione di tre strati di germe. IPSCs umane vengono generati da varie cellule primarie, quali le cellule del sangue, cheratinociti e fibroblasti. Fra loro, cellule mononucleari del sangue ombelicale (CBMC) sono emersi come una fonte alternativa cellulare dal punto di vista della medicina rigenerativa allogenica. CBMC sono utili nella medicina rigenerativa perché umano del leucocita (HLA) l'antigene digitando è essenziale alla cella sistema bancario. Mettiamo a disposizione un metodo per la differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibroblasti e per la generazione di un 3D pelle organoid. Fibroblasti e cheratinociti CBMC-iPSC-derivati hanno caratteristiche simili ad una linea cellulare primaria. Il organoids pelle 3D vengono generati mediante la sovrapposizione di uno strato epidermico su uno strato dermico. Trapiantando questo organoid pelle 3D, viene generato un modello di topi umanizzati. Questo studio indica che un organoid 3D pelle umana iPSC-derivato può essere uno strumento di romanzo, alternativo per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

Introduzione

Pelle copre la superficie più esterna del corpo e protegge gli organi interni. La pelle ha diverse funzioni, tra cui la protezione contro gli agenti patogeni, assorbire e immagazzinare l'acqua, regolazione della temperatura corporea ed espellendo corpo rifiuti2. Gli innesti di pelle possono essere classificati a seconda dell'origine della pelle; gli innesti usando la pelle da un altro donatore sono denominati allotrapianti, e gli innesti usando la pelle del paziente sono gli autoinnesti. Anche se un autoinnesto è il trattamento preferito a causa del suo rischio basso rifiuto, le biopsie della pelle sono difficili da eseguire su pazienti con lesioni gravi o di un numero insufficiente di cellule della pelle. In pazienti con gravi ustioni, tre volte il numero delle cellule della pelle è necessario per coprire vaste aree. La disponibilità limitata delle cellule della pelle dal corpo di un paziente si traduce in situazioni dove è necessario il trapianto di allogenous. Un documento non autografo è temporaneamente utilizzato fino a trapianto autologo può essere eseguito poiché è rifiutata solitamente dal sistema immunitario dell'ospite dopo circa 1 settimana3. Per superare il rifiuto dal sistema immunitario del paziente, gli innesti devono provenire da una fonte con la stessa identità immune del paziente4.

IPSCs umane sono un emergenti fonte di cellule staminali terapia5. IPSCs umane vengono generati dalle cellule somatiche, utilizzando fattori di riprogrammazione come OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Utilizzando iPSCs umane supera le questioni etiche e immunologiche delle cellule staminali embrionali (ESCs)7,8. IPSCs umane hanno pluripotenza e possono differenziarsi in tre strati germinativi9. La presenza di HLA, un fattore critico nella medicina rigenerativa, determina la risposta immunitaria e la possibilità di rifiuto10. L'uso di derivati paziente iPSCs risolve i problemi di rigetto di limitazione e sistema immunitario cellulare-fonte. CBMC sono emerse anche come fonte alternativa cellulare per la medicina rigenerativa11. Obbligatorio HLA tipizzazione, che si verifica durante operazioni bancarie CBMC, facilmente utilizzabile per la ricerca e trapianto. Più ulteriormente, omozigoti iPSCs HLA-tipo può ampiamente applichi a vari pazienti12. Una banca CBMC-iPSC è un romanzo e una strategia efficace per la terapia cellulare e trapianto allogenico medicina rigenerativa12,13,14. In questo studio, usiamo CBMC-iPSCs, differenziate in cheratinociti e fibroblasti e generare strati della pelle 3D stratificato. Risultati da questo studio indicano che un organoid CBMC-iPSC-derivati della pelle di 3D è un nuovo strumento per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state eseguite in conformità con il laboratorio animali Welfare Act, la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e le linee guida e criteri per la sperimentazione di roditore forniti dalla cura istituzionale degli animali e Utilizzare il Comitato (IACUC) della scuola di medicina dell'Università cattolica della Corea del sud. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Università Cattolica di Corea (CUMC-2018-0191-01). Il IACUC e il dipartimento di animali di laboratorio (DOLA) della Università Cattolica di Corea, Songeui Campus accreditato presso il laboratorio di Corea eccellenza animale la Korea Food and Drug Administration nel 2017 e acquisita l'associazione di valutazione e Accreditamento di accreditamento completo internazionale laboratorio Animal Care International (AAALAC) nel 2018.

1. pelle di differenziazione delle cellule da cellule staminali pluripotenti indotte

  1. Preparazione media
    Nota: Conservare tutte le medie a 4 ° C in un ambiente buio per fino a 3 mesi. Filtrare tutte le medie, utilizzando un sistema di filtro di 0,22 μm in polietersulfone prima dell'uso per la sterilizzazione. Tutte le medie erano disponibile in un volume totale di 500 mL.
    1. Preparare KDM1 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 1). Medium (DMEM dell'Aquila per volta di mix Dulbecco) / F12 medium (3:1) con 2% siero bovino fetale (FBS), 0,3 mmol/L di acido L-ascorbico, 5 μg/mL insulina e 24 adenina µ g/mL.
    2. Preparare KDM2 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 2). Mix definito del keratinocyte privo di siero medio (Vedi la Tabella materiali) con 0,3 mmol/l di acido L-ascorbico, 5 μg/mL insulina e adenina 10 μg/mL.
      Nota: Medium senza siero del keratinocyte definito è ottimizzata per supportare la crescita e l'espansione dei cheratinociti.
    3. Preparare KDM3 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 3). Mix definito medium senza siero del keratinocyte e medium senza siero del keratinocyte (1:1) vedere la Tabella materiali particolari.
      Nota: Medium senza siero del Keratinocyte è ottimizzata per la crescita e il mantenimento dei cheratinociti.
    4. Preparare FDM1 (mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1). Media mix DMEM/F12 (3:1) con 5% FBS, 5 μg/mL insulina, adenina 0.18 mM e 10 ng/mL il fattore di crescita epidermico (EGF).
    5. Preparare FDM2 (mezzo di differenziazione del fibroblasto 2). Mix DMEM/F12 medium (1:1) con 5% FBS e 1% aminoacidi non essenziali.
    6. Preparare EP1 (epiteliali medie 1). Mix DMEM/F12 (3:1) con 4 mM L-Glutammina, 40 μM adenina, 10 della transferrina μg/mL, insulina 10 μg/mL e 0,1% FBS.
    7. Preparare EP2 (epiteliale medio 2). Mescolare EP1 e cloruro di calcio di 1,8 mM.
    8. Preparare EP3 (epiteliale medio 3, corneificazione medio). Media mix F12 con 4 mM L-Glutammina, 40 μM adenina, transferrina di 10 μg/mL, insulina 10 μg/mL, 2% FBS e cloruro di calcio di 1,8 mM.
  2. Generazione del corpo embrionale
    1. Generare il CBMC-iPSCs utilizzando il protocollo indicato in un precedente studio12.
    2. Cappotto piastre di coltura, utilizzando vitronectina. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm.
      1. Scongelare e risospendere 50 μL di vitronectin 0,5 mg/mL (concentrazione finale: 5 µ g/mL) con 5 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a temperatura ambiente (TA) per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare).
    3. Mantenere il CBMC-derivato iPSCs al 100 mm rivestite con vitronectina piastra e cambiare il mezzo di iPSC (E8) tutti i giorni a 37 ° C con 10% CO2.
    4. Generare corpi embrionali (EBs) utilizzando il protocollo indicato in un precedente studio15 (descritti brevemente di seguito). Espandere iPSCs modificando il mezzo fino a quando le cellule hanno raggiunto la confluenza di 80%. 80% confluenza, rimuovere il supporto e lavare con PBS.
    5. Trattare le cellule con 1 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min e raccogliere le celle utilizzando 3 mL di terreno E8. Centrifugare le cellule a 250 x g per 2 min.
    6. Aspirare il supernatante e applicare 5 mL di terreno E8 alle celle. Contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferimento di 1 x 106 cellule in una nuova provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule a 250 x g per 2 min.
    7. Risospendere le cellule trasferite con 2,5 mL di mezzo di formazione di EB con inibitore di chinasi Rho-collegata (ROCK) 10 μM. Goccia 1 x 104 celle (25 µ l/goccia) su un coperchio di cultura noncoated usando una pipetta multicanale di 10 – 100 μL. Modulo 100 EBs da 1 x 106 celle (1 x 104 cellule/1 EB). Girare il piatto e aspetta la goccia al coperchio.
      Nota: Inibitore di roccia è necessaria durante la fase di attaccamento nel processo di differenziazione e di manutenzione. Aggiungere l'inibitore di roccia soltanto in fase di aggregazione EB.
    8. Incubare le goccioline a 37 ° C con 5% CO2 per 1 giorni.
    9. Il giorno successivo, raccolto il 100 EBs e utilizzarli per la differenziazione. Lavare il coperchio della piastra con iPSC medio (medio E8) o PBS e raccolta del contenuto in una provetta conica da 50 mL. Mantenere l'EBs presso RT per 1 min di stabilirsi li. Aspirare il supernatante e risospendere il EBs con il mezzo di E8 mantenerle in una capsula di Petri di 90 mm fino la differenziazione.
  3. Differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti
    Nota: Per un regime della differenziazione del keratinocyte dal CBMC-iPSCs, Vedi Figura 1A.
    1. Raccolto il 100 EBs in una provetta conica 50 mL con iPSC medium o PBS. Mantenere a temperatura ambiente per 1 min per sistemarsi la EBs. Assicurarsi che si depositano nella parte inferiore del tubo conico. Aspirare il supernatante e risospendere il EBs con E8 medio con 1 proteina morfogenetica dell'osso ng/mL 4 (BMP4). Trasferire l'EBs a una capsula di Petri di 90 mm e mantenerli a 37 ° C con 5% CO2 per 1 giorni.
    2. Cappotto in piastre di coltura, utilizzando il tipo collageno di IV. Preparare 5 mL di collagene di tipo IV per rivestire un piatto di 100 mm.
      1. Scongelare e risospendere il tipo di soluzione di collagene IV (concentrazione finale: 50 µ g/mL) con 0,05 N HCl. aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a temperatura ambiente per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare).
        Nota: Prima di utilizzare le piastre, lavare i piatti 3 x con PBS per rimuovere qualsiasi acido.
    3. Raccogliere l'EBs (punto 1.3.1) in una provetta conica da 50 mL e mantenerle a temperatura ambiente per 1 min di loro stabilirsi. Assicurarsi che si depositano sul fondo del tubo conico, aspirare il supernatante e risospendere il EBs in 6 mL di KDM1 con inibitore ROCK 10 µM. Trasferire l'EBs per il piatto di 100mm rivestite con collagene di tipo IV.
      Nota: Aggiungere l'inibitore di roccia soltanto in fase di attacco di EB.
    4. Tra 0 – 8 giorni, cambiare il mezzo ogni altro giorno per KDM1 con acido di 3 µM retinoico (RA) e 25 ng/mL ciascuno di BMP4 ed EGF. Mantenere l'EBs a 37 ° C con 5% CO2.
    5. Tra i giorni 9 – 12, modificare il mezzo ogni altro giorno KDM2 con 3 µM RA, BMP4 25 ng/mL e 20 ng/mL EGF.
    6. Tra i giorni 13 – 30, cambiare il mezzo ogni altro giorno a KDM3 con 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.
  4. Differenziazione del CBMC-iPSC in fibroblasti
    Nota: Per un regime della differenziazione dei fibroblasti dal CBMC-iPSCs, vedere Figura 2A.
    1. Cappotto piastre di coltura, utilizzando la matrice della membrana basale. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm.
      1. Scongelare la matrice della membrana basale (concentrazione finale: 600 ng/mL) e diluirla con DMEM/F12 medio. Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a 37 ° C per 30 min. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare).
    2. Raccolto il 100 EBs in una provetta conica 50 mL utilizzando una pipetta con iPSC medium o PBS. Mantenere a temperatura ambiente per 1 min per sistemarsi la EBs. Assicurarsi che si depositano nella parte inferiore del tubo conico. Eliminare il surnatante.
    3. Risospendere il EBs utilizzando una pipetta di 1.000 µ l in 6 mL di FDM1 con inibitore ROCK 10 µM. Trasferire l'EBs (con medie) per un piatto di 100mm rivestite con matrice della membrana dello scantinato e incubare a 37 ° C con 5% CO2. Aggiorna il FDM1 ogni altro giorno per 3 giorni.
      Nota: Aggiungere solo l'inibitore di roccia presso la fase di collegamento di EB.
    4. Aggiungere 0,5 nM ossea morfogenetica (BMP 4) 4 FDM1 tra 4 e 6 giorni.
    5. Al giorno 7, cambiare il mezzo di FDM2 ogni altro giorno per 1 settimana.
    6. Al giorno 14, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM2 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1.
    7. Contare le celle utilizzando un emocitometro, risospendere le 2 x 106 cellule con il mezzo di FDM1 e trasferire le cellule al piatto noncoated. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno.
    8. Cappotto di piastre di coltura, utilizzando collagene di tipo I. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm. Diluire la soluzione di collagene di tipo I (concentrazione finale: 50 µ g/mL) in 0.02 N di acido acetico. Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve asciugarsi) a RT.
      Nota: Prima di utilizzare le piastre, lavare i piatti 3 x con PBS per rimuovere l'acido.
    9. Il giorno 21, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM1 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1. Conteggio celle utilizzando un emocitometro e trasferimento 2 x 106 celle al tipo ho piatto rivestite con collagene 100 mm con FDM1 medio. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno.
    10. Il giorno 28, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM1 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1. Contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferire 2 x 106 cellule per un piatto di noncoated con FDM1 medio. Mantenere la cella a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno.
      Nota: iPSC-derivato fibroblasti proliferano come una cellula primaria del fibroblasto e passaggio fino a 10 passaggi. In questo studio, abbiamo utilizzato fibroblasti iPSC-derivato di due a cinque passaggi per ulteriori analisi.

2. applicazione di cellule differenziate derivate hiPSC

  1. Generazione di pelle 3D organoid
    1. Preparare tipo neutralizzato ho collagene sul ghiaccio, seguendo le raccomandazioni del produttore. Come concentrazione finale, utilizzare 3 mg/mL di collagene di tipo I (concentrazione stock di tipo I collagene è 3,47 mg/mL) e assicurarsi che il volume finale della miscela è di 5 mL. Calcolare il volume di 10 x PBS (volume finale/10 = 0,5 mL). Calcolare il volume di collagene da utilizzare tipo I (volume finale x concentrazione finale collagene / stock concentrazione di collagene = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calcolare il volume di 1 N NaOH (volume di collagene per essere utilizzato x 0,023 mL = 0,1 mL). Calcolare il volume di dH2O (finale volume - volume di collagene - il volume di PBS 10X - volume di 1 N NaOH = 4,32 5 mL mL-mL 0,5 mL-0,1 mL = 0,08). Mescolare il contenuto del tubo e tenerlo sul ghiaccio fino all'uso.
    2. Aggiungere 1 mL di EDTA per i fibroblasti iPSC-derivato dal passaggio 1.4.10 e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule indipendente, contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferire 2 x 105 cellule ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifugare a 250 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule dei fibroblasti derivati iPSC in 1,5 mL di FDM1 e neutralizzato il tipo ho soluzione di collagene (1:1).
      Nota: Mescolare la soluzione delicatamente per evitare bolle.
    3. Collocare l'inserto di membrana su una micropiastra 6-pozzetti, trasferire la miscela all'inserto e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
      Nota: Non spostare le piastre.
    4. Dopo aver confermato la gelificazione, aggiungere 2 mL di terreno nella parte superiore dell'inserto e 3 mL per il fondo del pozzo. Incubare la matrice di fibroblasti e collagene a 37 ° C con 5% CO2 per 5-7 giorni, fino a quando la gelificazione è completa e non più contratti.
    5. Dopo la gelificazione completa, staccare i keratinocytes iPSC-derivato (dal punto 1.3.6) con EDTA. Aggiungere 1 mL di EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule indipendente, contarli utilizzando un emocitometro e 1 x 106 cellule di trasferimento ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 250 x g per 2 min.
    6. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule di 1 x 106 a 50-100 µ l di calcio basso epiteliali terreno 1 (EP. 1).
    7. Aspirare la matrice di tutte le medie (Vedi punto 2.1.5) e 1 x 106 cellule dei keratinocytes iPSC-derivati su ogni strato di fibroblasti di seme. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% CO2 per 30 min.
      Nota: Non spostare la piastra e non aggiungere qualsiasi supporto per il fissaggio del keratinocyte.
    8. Aggiungere 2 mL di EP1 alla parte superiore dell'inserto e 3 mL di EP1 sul fondo del pozzo.
    9. Dopo 2 giorni, aspirare tutto il mezzo della piastra di inserimento della membrana e modificare il mezzo normale del calcio EP2 per 2 giorni.
    10. Dopo 2 giorni, aspirare tutto il mezzo e aggiungere 3 mL di terreno corneificazione solo verso il basso per generare un'interfaccia aria-liquido.
    11. Mantenere la pelle 3D organoid fino a 14 giorni a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno. Raccogliere la pelle 3D organoid tagliando il bordo dell'inserto e utilizzarlo per un ulteriore studio di colorazione e di innesto di pelle.
  2. Innesto di pelle
    1. Eseguire l'anestesia per inalazione in topi NOD/scid (maschile, vecchio 6 settimane), utilizzando un metodo standard, approvato dall'istituzione. Per innesto di pelle, radere il pelo della pelle dorsale di ogni mouse.
    2. Rimuovere una sezione di 1 cm x 2 cm di pelle del mouse, utilizzando forbici curve con il forcipe.
    3. Posto il CBMC-iPSC-derivati 3D pelle organoid sul sito difetto e sutura utilizzando un metodo di medicazione tie-over con i suturare di seta.
    4. Osservare i topi per 2 settimane e sacrificarli per l'analisi istologica. Il protocollo di colorazione è stato verificato in precedenti studi16.

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Risultati

Pelle è composta, per la maggior parte, dell'epidermide e del derma. Cheratinociti sono il tipo principale delle cellule dell'epidermide, e fibroblasti sono il tipo principale delle cellule del derma. Lo schema di differenziazione del keratinocyte è riportato in Figura 1A. CBMC-iPCSc sono state mantenute in un piatto di vitronectin-rivestito (Figura 1B). In questo studio, abbiamo differenziato CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibro...

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Discussione

IPSCs umane sono stati suggeriti come una nuova alternativa per la medicina rigenerativa personalizzata17. Paziente-derivato personalizzato iPSCs riflettono le caratteristiche dei pazienti che possono essere utilizzate per la modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e di trapianto autologo18,19. L'uso di derivati paziente iPSCs può anche superare problemi per quanto riguarda le cellule primarie, una mancanza di numeri di cell...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione la Corea Healthcare Technology R & D Project, Ministero della sanità, Welfare e famiglia, Repubblica di Corea (H16C2177, H18C1178).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdeninaSigmaA2786Componente del terreno di differenziazione per i fibroblasti
AggreWell Medium (terreno di formazione EB)STEMCELL05893Formazione di EB
Anticorpo anti-fibronectinaabcamab23750Marker dei fibroblasti
Anticorpo anti-KRT14abcamab7800Marker dei cheratinociti
Anticorpo anti-Loricrinaabcamab85679Marcatore dello strato corneo
Anticorpo anti-p63 abcamab124762Marcatore dei cheratinociti
Anticorpo anti-vimentinaSanta cruzsc-7558Marcatore di fibroblasti
BAND AID TESSUTO FLESSIBILEJohnson & Johnson-Bendage
Matrice della membrana basale (Matrigel)BD354277Componente del terreno di differenziazione per fibroblasti
Sutura BLACK SILKAILEEESK617Innesto cutaneo
CaCl2SigmaC5670Componente del terreno epiteliale per organoide cutaneo 3D
Collagene di tipo IBD354236organoide
cutaneo 3DCollagene di tipo IVSanta-cruzsc-29010Componente del terreno di differenziazione per cheratinociti
Definito terreno libero da siero per cheratinocitiGibco10744-019Componente del mezzo di differenziazione per cheratinociti
DMEM, alto glucosioGibco11995065Componente del mezzo di differenziazione
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Componente di mezzo di differenziazione
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, qualificatoCorning35-015-CVComponente del terreno di differenziazione per fibroblasti e cheratinociti
Glutamax Supplement Gibco35050061Componente del terreno di differenziazione per fibroblasti
InsulinaInvtrogen12585-014Componente del mezzo di differenziazione per fibroblasti e cheratinociti
Forbice curva standard IrisProfessionalPC-02.10Strumento chirurgico
Cheratinocita Siero libero MediumGibco17005-042Componente del mezzo di differenziazione per cheratinocita
acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idratoSigmaA8960Componente del terreno di differenziazione per cheratinociti
MEM Aminoacido non essenzialeGibco1140050Componente del mezzo di differenziazione per fibroblasti
Pinze Meriam Pollice 16 cmHIROSEHC 2265-1Strumento chirurgico
NOD. CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Ceppo di topi per innesto cutaneo
Piastra di Petri 90 mmHyundai MicroH10090Articoli in plastica
Ricombinante umano BMP-4R& D314-BPComponente del terreno di differenziazione per cheratinociti
Proteina EGF umana ricombinanteR& D236-EGComponente del terreno di differenziazione per cheratinocita
Acido retinoicoSigmaR2625Componente del mezzo di differenziazione per cheratinocita
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Articoli in plastica
TransferrinSigmaT3705Componente del terreno epiteliale per organoide cutaneo 3D
Inserti di membrana rivestiti di collagene Transwell-COL nbsp;CorningCLS3492Articoli in plastica per organoidi cutanei 3D 
VitronectinLife technologiesA14700coltura iPSC
Y-27632 Dicloridratopeprotech1293823coltura iPSC

Riferimenti

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071(2014).

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