Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Roberta Imperatore; Livia D'Angelo; Paolo De Girolamo; Luigia Cristino; Marina Paolucci

doi:10.3791/59308

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Articolo metodologico

Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

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DOI:

10.3791/59308

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25 giugno 2019

Roberta Imperatore¹^,² , Livia D'Angelo³ , Paolo De Girolamo³ , Luigia Cristino² , Marina Paolucci¹

¹Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, ²Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, ³Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

In questo articolo

Sommario

Sono presentati qui i protocolli per la caratterizzazione immunohistochimica e la localizzazione di peptidi orexin, recettori dell'orexina e recettori endocannabinoidi nell'intestino e nel cervello dei modelli di obesità adulta (DIO) normali e indotta dalla dieta immunoperissiasi e metodi di doppia immunofluorescenza.

Abstract

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica altamente sensibile e specifica coinvolta nella rilevazione di antigeni bersaglio nelle sezioni tissutali con anticorpi etichettati. Si tratta di un processo multifase in cui l'ottimizzazione di ogni passo è fondamentale per ottenere il segnale specifico ottimale. Attraverso l'IHC, è possibile rilevare la distribuzione e la localizzazione di biomarcatori specifici, rivelando informazioni sulla conservazione evolutiva. Inoltre, L'IHC consente di comprendere i cambiamenti di espressione e distribuzione dei biomarcatori in condizioni patologiche, come l'obesità. L'IHC, principalmente la tecnica dell'immunofluorescenza, può essere utilizzato nel pesce zebra adulto per rilevare l'organizzazione e la distribuzione di molecole conserve filogeneticamente conservate, ma un protocollo IHC standard non è estasblished. Orexin ed endocannabinoidi sono due sistemi altamente conservati coinvolti nel controllo dell'assunzione di cibo e patologia dell'obesità. Riportati qui sono protocolli utilizzati per ottenere informazioni sul peptide orexin (OXA), recettore dell'orexin (OX-2R), e il recettore cannabinoide (CB1R) localizzazione e distribuzione nell'intestino e nel cervello di normali e indotti dalla dieta obeso (DIO) modelli di pesce zebra adulti. Sono inoltre descritti i metodi per l'immunoperossiasi e la doppia immunofluorescenza, nonché la preparazione di reagenti, la fissazione, l'incorporazione di paraffina e la crioprotezione del tessuto del pesce zebra e la preparazione per una fase endogena di blocco dell'attività e controstatura. L'insieme completo dei parametri è ottenuto da precedenti esperimenti IHC, attraverso i quali abbiamo dimostrato come l'immunofluorescenza può aiutare con la comprensione di OX, OX-2R, e distribuzione CB1R, localizzazione, e conservazione dell'espressione nel pesce zebra adulto Tessuti. Le immagini risultanti con intensità del segnale altamente specifico hanno portato alla conferma che i pesci zebra sono modelli animali adatti per studi immunohistochimici di distribuzione, localizzazione e conservazione evolutiva di biomarcatori specifici condizioni fisiologiche e patologiche. I protocolli qui presentati sono consigliati per gli esperimenti IHC nel pesce zebra adulto.

Introduzione

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica classica ben consolidata utilizzata per identificare i componenti cellulari o tissutali (antigeni) dall'interazione antigene-anticorpo¹^,². Può essere utilizzato per identificare la localizzazione e la distribuzione di biomolecole bersaglio all'interno di un tessuto. L'IHC utilizza reazioni immunologiche e chimiche per rilevare gli antigeni nelle sezioni tissutali³. I principali marcatori utilizzati per la visualizzazione delle interazioni antigene-anticorpo includono coloranti fluorescenti (immunofluorescenza) e reazioni di colore enzimatico-subs....