Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.
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Articolo metodologico
Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti ragni producono sette tipi di sete. Sei dei sete sono fibre in forma quando prodotte dai ragni. Queste fibre non sono solubili in acqua. Al fine di riprodurre le notevoli proprietà meccaniche delle sete di ragno, devono essere prodotte in padroni eterolodi come i ragni sono sia territoriali che cannibali. Anche gli analoghi sintetici della seta di ragno tendono ad essere insolubili in soluzioni acquose. Così, una grande percentuale di ricerca in sete di ragno ricombinante si basano su solventi organici che sono dannosi per la produzione su larga scala di materiali. Il metodo del nostro gruppo costringe la solvazione di questi sete di ragno ricombinanti in acqua. Sorprendentemente, quando queste proteine sono preparate utilizzando questo metodo di calore e pressione, una vasta gamma di forme di materiale può essere preparata dalla stessa soluzione di proteine di seta ragno ricombinante (rSSp) tra cui: film, fibre, spugna, hydrogel, lyogel, e adesivi. Questo articolo illustra la produzione di RSSP e forme di materiale solvatato in un modo che è più facilmente comprensibile che da solo materiali e metodi scritti.
Introduzione
I sete ragno hanno raccolto l'interesse degli scienziati materiali per la loro impressionante combinazione di forza, elasticità e biocompatibilità. Ricreare le fibre è stata tradizionalmente la spinta della ricerca. Questo sforzo è stato ostacolato dall'insolubilità di proteina di seta del ragno ricombinante (rSSp) in acqua, nonché dall'incapacità delle tecniche di solvazione tradizionali (agenti chaotropici e detergenti) di raggiungere la solvazione acquosa. Inoltre, le tecniche sviluppate per le versioni solvatanti di RSSP non funzionano su tutte le varianti RSSP e richiedono anche una manipolazione e un tempo sostanziali che spesso si traduce in perdita di proteine....
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Protocollo
1. preparazione della miscela di seta di ragno ricombinante da scorte proteiche liofilizzate
- Determinare la formulazione e il volume necessari per le formazioni di materiale previste. Le formulazioni tipiche vanno dal 3% (w/v) fino al 15% (p/v). Utilizzando questa selezione, calcolare l'rSSp, le concentrazioni e i rapporti appropriati.
- Utilizzare le seguenti formulazioni per preparare ogni materiale descritto nel presente protocollo: idrogel/spugne/lyogel, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/rivestimenti, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adesivi, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
Nota: anche se la maggior parte delle f....
- Utilizzare le seguenti formulazioni per preparare ogni materiale descritto nel presente protocollo: idrogel/spugne/lyogel, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/rivestimenti, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adesivi, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
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Risultati
Dal metodo descritto di solubilizzazione di rSSp, una varietà di forme di materiale può essere ottenuta come si vede nella Figura 1. Il metodo di solubilizzazione è quello di applicare calore e pressione, generata da un forno a microonde convenzionale, ad una sospensione di rSSp e acqua. Quando si raggiungono temperature e pressioni critiche, la proteina si solubilizza. Da questa soluzione di rSSp solubilizzata, le condizioni richieste sono presentate per set.......
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Discussione
Dopo che le proteine di seta del ragno ricombinante vengono purificate, devono essere preparate in una soluzione che può essere utilizzata per la formazione del materiale. Mescolando proteina di seta di ragno liofilizzata con acqua ed esponendo questa miscela all'irraggiamento a microonde, per generare calore e pressione, è possibile preparare una soluzione rSSp. Una vasta gamma di forme di materiale può essere prodotta da questo metodo semplice ed efficiente di solubilizzazione rSSp. Ogni materiale deve essere preparato.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero ringraziare con gratitudine i finanziamenti dell'iniziativa Utah Science and Technology Research (USTAR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 3 ml con punta Luer-Lok | BD | 309657 | possibile utilizzare siringhe di altre dimensioni, ma per mantenere le punte, si consiglia di utilizzare puntali luer-lok |
| Fiala di coltura da 4 ml, trasparente con tappo rivestito in gomma | Wheaton | 225142 | Il volume minimo della droga è 1 ml, il massimo è 2 ml |
| Fiala di coltura da 8 ml, trasparente con tappo rivestito in gomma | Wheaton | 225144 | Il volume minimo della droga è 2 ml, max è 4mL |
| 99% Alcol Isopropilico, Reagente ACS/USP Grado | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Liofilizzatore Luer |
| Adattatore Luer Femmina Luer x 10-32 Femmina, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microonde | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watt; 1,1 cu. ft. capacità; con piatto |
| girevole in vetroTubo in PEEK monopezzo a tenuta stagna 10-32, per tubi in PEEK da 1/16" | OD IDEX | F-120X | |
| 1/16" OD x 0,010" ID | IDEX | 1531B | |
| Spruzzatore: Aerografo Master Aerografo | Master | TC-60 |
Riferimenti
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spid....
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Ristampe e permessi
