Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

Summary

Questo protocollo consente la conversione rapida ed efficiente delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni motori con un'identità spinale o cranica, mediante l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione dai vettori inducibili piggyBac.

Abstract

Descriviamo qui un metodo per ottenere funzionali neuroni motori spinale e craniale da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La conversione diretta in motore neurone è ottenuta per espressione ectopica di moduli alternativi di fattori di trascrizione, vale a dire Ngn2, Isl1 e Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). NIL e NIP specificano, rispettivamente, l'identità del motore neuronale spinale e craniale. Il nostro protocollo inizia con la generazione di linee iPSC modificate in cui NIL o NIP sono stabilmente integrati nel genoma tramite un vettore di trasposizione piggyBac. L'espressione dei transgeni viene quindi indotta dalla doxiciclina e conduce, in 5 giorni, alla conversione degli iPSCs in progenitori MN. La successiva maturazione, per 7 giorni, conduce a popolazioni omogenee di MNs spinale o craniale. Il nostro metodo contiene diversi vantaggi rispetto ai protocolli precedenti: è estremamente rapido e semplificato; non richiede infezione virale o ulteriore isolamento MN; permette di generare diverse sottopopolazioni MN (spinali e craniche) con un notevole grado di maturazione, come dimostrato dalla capacità di sparare i treni dei potenziali d'azione. Inoltre, un gran numero di motoneuroni può essere ottenuto senza purificazione da popolazioni miste. i neuroni del motore spinale e craniale derivati da iPSC possono essere utilizzati per la modellazione in vitro della sclerosi laterale amiotrofico e di altre malattie neurodegenerative del Neuron motorio. Le popolazioni di neuroni omogenei del motore potrebbero rappresentare una risorsa importante per proiezioni di farmaci specifici per tipo di cellula.

Introduction

La degenerazione del motoneurico (MN) svolge un ruolo causale nelle malattie umane come la sclerosi laterale amiotrofico (ALS) e l'atrofia muscolare spinale (SMA). La creazione di sistemi di modelli cellulari idonei in vitro che ricapitolano la complessità del MN umano è un passo importante verso lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che sono dotate di notevoli proprietà di differenziazione plurilineage, sono state ora derivate da un numero di pazienti affetti da malattie motoneuriche^1,2. Ulteriori linee iPSC che trasportano mutazioni patogene associate a malattie MN sono state generate dall'editing genico, partendo dal controllo delle cellule staminali pluripotenti "sane"³. Queste linee rappresentano strumenti utili per la modellazione delle malattie in vitro e lo screening dei farmaci, purché siano disponibili metodi appropriati per la differenziazione iPSC in MNs. La logica alla base dello sviluppo di questo metodo è quella di fornire alla comunità scientifica interessata alle malattie MN un protocollo di differenziazione veloce ed efficiente che dà origine a MNs funzionali maturi. Il primo vantaggio di questo metodo è il suo lasso di tempo di esecuzione. Un altro punto di forza rilevante deriva dall'eliminazione di qualsiasi fase di purificazione. Infine, il protocollo può essere utilizzato per generare due distinte popolazioni di motoneuroni.

La possibilità di generare diversi sottotipi di MNs è particolarmente rilevante per la modellazione delle malattie MN. Non tutti i sottotipi MN sono ugualmente vulnerabili in ALS e SMA e l'insorgenza dei sintomi in diverse unità motoria influisce notevolmente sulla prognosi. Nella SLA, l'esordio spinale con sintomi che iniziano negli arti superiori e inferiori conduce alla morte in circa 3-5 anni⁴. Al contrario, l'insorgenza di bulbare, a cominciare dalla degenerazione di MNs craniali, ha una prognosi peggiore. Inoltre, la percentuale di insorgenza di bulbare è significativamente più alta nei pazienti con mutazioni nelle proteine leganti l'RNA FUS e TDP-43 rispetto agli individui con mutazioni SOD1⁵. Quasi la totalità dei protocolli alternativi di differenziazione MN si basa sull'attività dell'acido retinoico (RA), che conferisce un carattere spinale per differenziare iPSCs^6,7,8. Ciò limita la possibilità di studiare fattori intrinseci, che potrebbero essere protettivi in specifici sottotipi di MN^9,10.

Coerentemente con un precedente lavoro in cellule staminali embrionali di topo¹¹, abbiamo recentemente dimostrato che nell'espressione ectopica iPSCs umana di Ngn2, Isl1 e LHX3 (Nil) induce un'identità spinale MN, mentre Ngn2 e Isl1 più PHOX2A (NIP) specificano MNS craniali¹². Abbiamo quindi sviluppato un protocollo efficiente, che porta alla produzione di MNs umani dotati di proprietà funzionali in un turnaround di 12 giorni. Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere, in un breve lasso di tempo e senza la necessità di purificazione (ad esempio, da FACS), popolazioni di cellule altamente arricchite per gli MNs con identità spinale o craniale.

Protocol

1. manutenzione degli IPSC umani

1. Preparazione di piastre rivestite in matrice
   1. Scongelare un flaconcino da 5 mL di matrice (vedere tabella dei materiali) a 4 ° c durante la notte. Le scorte di matrici originali sono disponibili in diverse concentrazioni di scorte e le aliquote sono effettuate in base al fattore di diluizione indicato sulla scheda tecnica, specifica per il lotto individuale. È importante tenere il flaconcino e i tubi ghiacciati per evitare la gelificante prematura della matrice. Distribuire la matrice in aliquote in criotubi pre-refrigerati sul ghiaccio. Congelare le aliquote inutilizzate a-20 ° c.
   2. Mettere una aliquota sul ghiaccio per circa 2 h per scongelare.
   3. Diluire l'aliquota della matrice con 20 mL di DMEM/F12 freddo in un tubo conico 50 mL.
   4. Miscelare bene e erogare 1 mL di matrice diluita in piatti da 35 mm (quantità equivalenti per superficie di altri piatti).
   5. Tenere i piatti contenenti la matrice diluita per 1 h a temperatura ambiente per consentire il rivestimento.
      Nota: I piatti, sigillati con parafilm, possono essere conservati a 4 ° c per un massimo di 2 settimane.
2. Preparazione della soluzione di riserva (20 ml) e 1x aliquote di lavoro del reagente di dissociazione delicata delle cellule (vedere tabella dei materiali).
   1. Sciogliere la polvere a 10 mg/mL in PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} free).
   2. Filtrare sterilizzare attraverso una membrana filtrante di 0,22 μm.
   3. Preparare 20 aliquote (1 mL ciascuna) e conservare a-20 ° c.
   4. Prima dell'uso, diluire un'aliquota in PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} free) a 1 mg/ml (1x aliquote di lavoro).
      Nota: 1x le aliquote di lavoro possono essere conservate a 4 ° c per un massimo di 2 settimane.
3. Passeggio iPSCs umani.
   1. Prima di iniziare: se conservato a 4 ° c, piastre pre-calde rivestite con matrice nell'incubatore a 37 ° c per 20-30 min. preriscaldamento a temperatura ambiente la quantità di supporto iPSC umano (vedere tabella dei materiali) necessaria. Preriscaldare il DMEM/F12.
   2. Mezzo di coltura aspirato.
   3. Sciacquare gli IPSC con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} free).
   4. Aggiungere 1x soluzione di dissociazione delicata (0,5 mL per un piatto da 35 mm). Incubare a 37 ° c fino a quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi dalla piastra, di solito 3-5 min.
   5. Aspirare la soluzione di dissociazione delicata, facendo attenzione a non staccare le colonie di iPSC.
   6. Lavare le cellule con DMEM/F12 (2 mL per un piatto 35 mm) e aspirare facendo attenzione a non staccare le cellule. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
   7. Aggiungere un supporto iPSC umano (1 mL per un piatto da 35 mm).
   8. Staccare delicatamente le colonie con un sollevatore cellulare e trasferirla in un tubo da 15 mL.
   9. Rompere delicatamente i grumi delle cellule pipettando su e giù con un P1000 pipettatore 3-4 volte.
   10. Aspirare il surnatante dalla piastra (e) rivestita con matrici.
   11. Semina le cellule nel volume di coltura appropriato del medium iPSC umano. Il rapporto di divisione può variare da linea a linea ed è di circa 1:4-1:8. Cambiare il mezzo ogni giorno.

2. generazione di linee iPSC di NIL e NIP inducible

1. Trasfezione cellulare.
   1. Sciacquare le cellule con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} free).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione delle cellule (vedere tabella dei materiali) (0,35 ml per un piatto da 35 mm) e incubare a 37 ° c fino a separare le singole cellule (5-10 min).
   3. Completare delicatamente la separazione delle cellule pipettando su e giù con un P1000 pipettatore 3-4 volte.
   4. Raccogliere in un tubo da 15 mL e aggiungere PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} libero) a 10 ml. Conta le celle.
   5. Pellet 10⁶ cellule e risospendere in 100 μl di tampone R (incluso nel kit elettroporazione cellulare, vedere tabella dei materiali).
   6. Aggiungere il DNA plasmide per la trasfezione: 4,5 μg di vettore traimabile (epB-BSD-TT-NIL o epB-BSD-TT-NIP¹²) e 0,5 μg del piggyBac trailamento plasmide¹³.
   7. Transfect con il sistema di elettroporazione delle cellule (Vedi tabella dei materiali) secondo le istruzioni del fabbricante e come descritto in precedenza³ con i seguenti parametri: 1.200 tensione di V, 30 ms di larghezza, 1 impulso. Seminare le cellule nel mezzo umano iPSC integrato con 10 μM Y-27632 (inibitore di roccia, vedere la tabella dei materiali) in un 6 mm piatto rivestito di matrice.
2. Selezione con antibiotici.
   1. Due giorni dopo la trasfezione, aggiungere 5 μg/ml di alla blasticina al mezzo di coltura.
   2. La maggior parte delle cellule non trasfite morirà entro 48 h di selezione blasticidina. Tenere le cellule in alla blasticina per almeno 7-10 giorni per contrastare-selezionare le cellule che non hanno integrato i transgeni nel genoma.
   3. Mantenere stabilmente le cellule trasfected come una popolazione mista, composto da cellule con diversi numero di transgeni e siti di integrazione diversi, o isolare singoli cloni.
   4. Preparare un piatto aggiuntivo per verificare l'effettiva espressione dei transgeni, su 1 μg/mL di induzione della doxiciclina, da RT-PCR con primer specifici per il Ngn2 (forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Inverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), come descritto in precedenza¹².
   5. In questa fase, congelare le scorte delle nuove linee NIL-e NIP-iPSC nel mezzo di congelamento per gli iPSCs umani (vedere la tabella dei materiali).

3. differenziazione del motore Neuron

1. Dissociare le cellule con il reagente di dissociazione cellulare come descritto (passi 2.1.1.-2.1.3.). Raccogli le cellule dissociate in un tubo da 15 mL e Diluisci con 5 volumi di DMEM/F12. Pellet le cellule e risospendere in umano iPSC medio integrato con 10 μM inibitore di roccia. Contare le cellule e il seme su piatti con rivestimento a matrice a una densità di 62.500 cellule/cm².
2. Il giorno dopo, sostituire il mezzo con DMEM/F12, integrato con 1x L-Glutammina stabile analogico, 1x aminoacido non essenziale (NEAA) integratore culturale cellulare e 0.5 x penicillina/streptomicina, e contenente 1 μg/mL doxiciclina. Questo è considerato come giorno 0 di differenziazione. Il giorno 1, aggiornare il mezzo e doxiciclina.
3. Il giorno 2, cambiare il medium a Neurobasal/B27 Medium (mezzo Neurobasale integrato con 1x B27, 1x stabile di L-Glutammina analogico, 1x NEAA e 0.5 x penicillina/streptomicina), contenente 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 e 1 μg/mL doxiciclina (vedere tabella dei materiali ). Rinfrescare il fluido e la doxiciclina ogni giorno fino al giorno 5.
4. Giorno 5: dissociazione delle cellule con reagente di dissociazione delle cellule (vedere tabella dei materiali).
   1. Sciacquare le cellule con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} free).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione delle cellule (0,35 mL per un piatto da 35 mm) e incubare a 37 ° c fino a quando l'intero monostrato cellulare si separa dal piatto. Si noti che le singole celle non saranno separate durante l'incubazione.
   3. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL.
   4. Completare delicatamente la separazione delle cellule pipettando su e giù con un P1000 pipettatore 10-15 volte.
   5. Aggiungere 4 mL di DMEM/F12 e contare le celle.
   6. In questa fase, congelare i progenitori dei neuroni del motore nel mezzo di congelamento delle cellule (vedere tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore.
   7. Pellet le cellule e risospendere in mezzo neuronale (Neurobasal/B27 Medium integrato con 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF e 200 ng/mL acido L-ascorbico, vedere tabella dei materialis) completato con inibitore di roccia 10 μm.
   8. Semina le cellule su poli-ornitina/laminina-o in alternativa su supporti con rivestimento a matrice alla densità di 100.000 cellule/cm². Utilizzare supporti in plastica μ-slide con coprioggetti in polimero (vedere tabella dei materiali) per l'analisi immunocolorazione.
5. Il giorno 6, cambiare il mezzo con fresco neuronale medium privo di inibitore di roccia. Nei prossimi giorni, aggiornare metà del mezzo ogni 3 giorni. Il mezzo di coltura deve essere modificato con molta attenzione al fine di evitare il distacco dalla superficie.

4. analisi immunostaining

1. Fissazione delle cellule. Sciacquare le cellule con PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) e incubare per 15 minuti in 4% paraformaldeide in PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) a temperatura ambiente.
   Attenzione: La paraformaldeide è tossica e sospetta di causare il cancro. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e maneggiare sotto una cappa chimica.
2. Permeabilizzare con PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) contenente 0,1% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in soluzione di blocco degli anticorpi (ABS: 3% BSA in PBS con CA^{2 +}/mg^{2 +}).
4. Incubare per 1 h a temperatura ambiente con anticorpi primari in ABS: anti-TUJ1 (1:1000; coniglio) e anti-Oct4 (1:200; topo) o anti-CHAT (anti-colina acetiltransferasi; 1:150; capra). Vedere la tabella dei materiali.
5. Incubare per 45 min a temperatura ambiente con appropriata coppia di anticorpi secondari in ABS: anti-topo Alexa Fluor 647 (1:250), anti-coniglio Alexa Fluor 594 (1:250) e anti-capra Alexa Fluor 488 (1:250). Vedere la tabella dei materiali.
6. Incubare in 0,4 μg/mL DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente per etichettare i nuclei.
7. Montare le celle con il supporto di montaggio (vedere la tabella dei materiali) per l'imaging a un microscopio a fluorescenza.

5. caratterizzazione funzionale tramite patch-registrazioni morsetto

1. Preparare la soluzione esterna HEPES-equilibrated (NES) come segue: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm MgCl₂, 10 mm HEPES e 10 mm di glucosio. Impostare l'osmolarità tra 290-300 mΩ. Regolare il pH a 7,3 utilizzando 1N NaOH e conservare la soluzione a 4 ° c.
2. Preparare la soluzione interna: 140 mM K-gluconato, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl₂, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Regolate il pH a 7,3 con 1M KOH e verificate che l'osmolarità sia fissata a circa 290 mΩ. Congelare la soluzione a-20 ° c in piccole aliquote.
3. Prima di eseguire gli esperimenti, preriscaldare la soluzione NES in un bagno d'acqua a circa 28-30 ° c.
4. Estrarre alcune Micropipette in borosilicato (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) con una resistenza alla punta: 5-6 MΩ e riempire con la soluzione intracellulare prima di montare nel supporto della pipetta.
   Nota: Ricordarsi di legare i fili d'argento dell'elettrodo di registrazione e dell'elettrodo di riferimento in candeggina per almeno 30 minuti in modo da formare uno strato uniforme di AgCl sulla superficie del filo.
5. Trasferire la capsula di Petri nella camera di registrazione e lasciare che la camera con la soluzione NES a 1-2 mL/min. Lasciare che il flusso passa attraverso un riscaldatore in linea impostato a temperatura di 30 ° c al fine di mantenere la soluzione calda.
6. Collocare la camera di registrazione elettrofisiologica sotto un microscopio verticale. Registra le correnti della membrana con l'amplificatore patch-clamp e Acquisisci i dati con un software appropriato.
7. Aprire il software di controllo dell'amplificatore e impostare il guadagno del segnale al valore 1 e il filtro di Bessel a 10 kHz. Assicurarsi che il filtro di Bessel sia 2,5 volte inferiore alla frequenza di campionamento.
8. Impostare i protocolli sperimentali per gli esperimenti di tensione-morsetto e corrente-Clamp nel software di registrazione.
9. Nell'impostazione del protocollo, selezionare la modalità di stimolazione episodica e impostare la frequenza di campionamento a 25 kHz. Quindi, passare alla scheda forma d'onda e digitare la tensione o l'ampiezza e la lunghezza del passo corrente come segue.
10. Per le correnti di sodio con Gate di tensione, utilizzare 15 gradini di tensione (50 ms di durata ciascuno) da-100 mV a + 40 mV (incrementi di 10 mV). Eseguire il protocollo dopo aver imposto alla cella patchato un potenziale di detenzione di-60 mV attraverso l'amplificatore. Analogamente, le correnti di potassio in tensione sono evocate da passi di tensione (250 ms di durata ciascuno) da-30 mV a + 50 mV (incrementi di 10 mV) che tengono la cella registrata a-40 mV.
11. Per indagare le proprietà di cottura degli MNs craniali e spinali di iPSC, le celle di serraggio, in modalità di corrente-pinza, ad un potenziale di membrana di-70 mV e utilizzare 4 impulsi di corrente (1 s durata ciascuno) di aumentare l'ampiezza (da + 20 pA a + 80 PA; 20 pA incremento).
12. Acquisisci per ogni corrente attivata dalla tensione delle celle, attività di cottura evocata e tre proprietà passive come capacità dell'intera cellula (cm), resistenza della membrana cellulare (RM) e potenziale di membrana di riposo (RMP).

Results

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione è illustrata nella Figura 1. Gli iPSCs umani (WT I linea³) sono stati trasfusati con EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP, generando, dopo la selezione di blasticidina, linee cellulari stabili e inducibili¹², di seguito denominate IPSC-nil e IPSC-NIP, rispettivamente. Differenziando le cellule sono state caratterizzate per l'espressione del marcatore pluripotenza Oct4 e il marcatore Pan-neuro...

Discussion

Questo protocollo consente di convertire efficacemente gli IPSC umani in neuroni motori spinali e cranici grazie all'espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per lignaggio. Questi transgeni sono inducibili dalla doxiciclina e stabilmente integrati nel genoma grazie a un vettore basato su trasposti piggyBac. In una popolazione mista, una o più copie del vettore piggyBac saranno integrate in modo casuale nel genoma delle singole cellule, aumentando il rischio di alterazioni dell'integrità del genoma. Inolt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reagente per dissociazione cellulare
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-colina acetiltransferasi. Anticorpi primari utilizzati nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_2079751; Numero di lotto: 2971003
anti-capra Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza. RRID: AB_2534102; Numero di lotto: 1915848
anti-topo Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza. RRID: AB_162542; Numero di lotto: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Anticorpi primari utilizzati nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_398736; Numero di lotto: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Anticorpo primario utilizzato nei saggi di immunocolorazione. Numero di lotto: E0117
anti-coniglio Alexa Fluor 594	Scienze immunologiche	IS-20152-1	Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Anticorpo primario utilizzato nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Integratore senza siero per il mantenimento delle cellule neuronali
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Mezzo di congelamento cellulare, utilizzato qui per i progenitori dei motoneuroni
BDNF	PreproTech	450-02	Fattore neurotrofico derivato dal cervello
Blasticidina	Sigma-Aldrich	203350	Antibiotico nucleosidico che inibisce la sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Albumina sierica bovina. Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche
Software Clampex 10	Molecular Devices	Clampex 10	Sistema di registrazione delle correnti di membrana
Corning Matrigel hESC qualificato Matrix	Corning	354277	Preparato ricostituito della membrana basale dal sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Utilizzato per l'adesione di iPSC su supporti in plastica e vetro
CRYOSTEM ACF MEZZI DI CONGELAMENTO	Biological Industries	05-710-1E	Mezzo di congelamento per iPSC umane
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G5146	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Polvere DAPI	Roche	10236276001	4&primo;,6-diamidino-2-fenilidolo. Macchia fluorescente che si lega all'adenina... regioni ricche di timina nel DNA utilizzate per la colorazione dei nuclei in saggi di immonofluorescenza
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inibitore della gamma secretasi
Dispasi	Gibco	17105-041	Reagente per la dissociazione delicata delle iPSC umane
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Terreno basale per colture cellulari
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G& nbsp;	Utilizzato per indurre l'espressione di transgeni da vettori epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linea commerciale di iPSC umane
Kit di RNA totale EZNA	Omega bio-tek	R6834-02	Kit per l'estrazione totale di RNA da cellule eucariotiche in coltura
GDNF	PreproTech	450-10	Fattore neurotrofico di derivazione gliale
Gibco Linea hiPSC episomiale	Thermo Fisher Scientific	A18945	Linea iPSC umana commerciale
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Un'alternativa alla L-glutammina con maggiore stabilità. Migliora la salute delle cellule.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
iScript Supermix a trascrizione inversa per RT-qPCR	Bio-Rad	per l'analisi dell'espressione genica mediante qPCR in tempo reale
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Master mix di reazione pronto all'uso ottimizzato per la PCR quantitativa a base di coloranti (qPCR) su qualsiasi strumento di PCR in tempo reale
K-Gluconato	Sigma-Aldrich	G4500	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
acido L-ascorbico	LKT Laboratories	A7210	Utilizzato in colture cellulari come antiossidante
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
Microscopio confocale a scansione laser	Olimpo	iX83 FluoView1200	Microscopio confocale per l'acquisizione di immagini di immunocolorazione
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche
Mezzo di montaggio	Ibidi	50001	Soluzione di montaggio utilizzata per saggi di microscopia confocale e immunofluorescenza
Amplificatore patch-clamp Multiclamp	Molecular Devices	700B	Sistema di registrazione delle correnti di membrana
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	non essenziali. Utilizzato come integratore per terreni di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare.
Neon 100 μ L Kit	Thermo Fisher Scientific Kit	di elettroporazione cellulare	MPK10096
di trasfezione Neon	Thermo Fisher Scientific	di elettroporazione cellulare
MPK5000 Neurobasal Medium Thermo	Fisher Scientific	21103049	Terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di popolazioni cellulari neuronali senza la necessità di uno strato di alimentazione degli astrociti
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Terreno di coltura iPSC umano
Microscopia elettronica Paraformaldeide	Scienze	157-8	Utilizzato per la fissazione cellulare nei saggi di immunocolorazione
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco, con calcio, con magnesio
PBS Ca2+/Mg2+ senza	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	salina tampone fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza
magnesio penicillina/streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Soluzione di penicillina/streptomicina utilizzata per prevenire la contaminazione da colture cellulari da batteri.
poli-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inibitore selettivo del recettore del fattore di crescita dell'endotelio vascolare 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole,  t-Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole Tert-ottilfeniletere. Utilizzato per la permeabilizzazione cellulare nei saggi di immunocolorazione
Microscopio verticale	Microscopio Olympus	BX51VI	per la registrazione elettrofisiologica dotato di fotocamera CoolSnap Myo
Y-27632  (Inibitore ROCK)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Inibitore selettivo permeabile alle cellule della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho-spirale, contenente bobina arrotolata. Aumenta la sopravvivenza delle iPSC
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Supporto per high– analisi microscopica finale di cellule fissate