Questo protocollo consente la conversione rapida ed efficiente delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni motori con un'identità spinale o cranica, mediante l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione dai vettori inducibili piggyBac.
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Articolo metodologico
Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo qui un metodo per ottenere funzionali neuroni motori spinale e craniale da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La conversione diretta in motore neurone è ottenuta per espressione ectopica di moduli alternativi di fattori di trascrizione, vale a dire Ngn2, Isl1 e Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). NIL e NIP specificano, rispettivamente, l'identità del motore neuronale spinale e craniale. Il nostro protocollo inizia con la generazione di linee iPSC modificate in cui NIL o NIP sono stabilmente integrati nel genoma tramite un vettore di trasposizione piggyBac. L'espressione dei transgeni viene quindi indotta dalla doxiciclina e conduce, in 5 giorni, alla conversione degli iPSCs in progenitori MN. La successiva maturazione, per 7 giorni, conduce a popolazioni omogenee di MNs spinale o craniale. Il nostro metodo contiene diversi vantaggi rispetto ai protocolli precedenti: è estremamente rapido e semplificato; non richiede infezione virale o ulteriore isolamento MN; permette di generare diverse sottopopolazioni MN (spinali e craniche) con un notevole grado di maturazione, come dimostrato dalla capacità di sparare i treni dei potenziali d'azione. Inoltre, un gran numero di motoneuroni può essere ottenuto senza purificazione da popolazioni miste. i neuroni del motore spinale e craniale derivati da iPSC possono essere utilizzati per la modellazione in vitro della sclerosi laterale amiotrofico e di altre malattie neurodegenerative del Neuron motorio. Le popolazioni di neuroni omogenei del motore potrebbero rappresentare una risorsa importante per proiezioni di farmaci specifici per tipo di cellula.
Introduzione
La degenerazione del motoneurico (MN) svolge un ruolo causale nelle malattie umane come la sclerosi laterale amiotrofico (ALS) e l'atrofia muscolare spinale (SMA). La creazione di sistemi di modelli cellulari idonei in vitro che ricapitolano la complessità del MN umano è un passo importante verso lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che sono dotate di notevoli proprietà di differenziazione plurilineage, sono state ora derivate da un numero di pazienti affetti da malattie motoneuriche1,2. Ulteriori linee iPSC che trasportano mutazioni patogene associate a....
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Protocollo
1. manutenzione degli IPSC umani
-
Preparazione di piastre rivestite in matrice
- Scongelare un flaconcino da 5 mL di matrice (vedere tabella dei materiali) a 4 ° c durante la notte. Le scorte di matrici originali sono disponibili in diverse concentrazioni di scorte e le aliquote sono effettuate in base al fattore di diluizione indicato sulla scheda tecnica, specifica per il lotto individuale. È importante tenere il flaconcino e i tubi ghiacciati per evitare la gelificante prematura della matrice. Distribuire la matrice in aliquote in criotubi pre-refrigerati sul ghiaccio. Congelare le aliquote inutilizzate a-20 ° c.<....
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Risultati
Una descrizione schematica del metodo di differenziazione è illustrata nella Figura 1. Gli iPSCs umani (WT I linea3) sono stati trasfusati con EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP, generando, dopo la selezione di blasticidina, linee cellulari stabili e inducibili12, di seguito denominate IPSC-nil e IPSC-NIP, rispettivamente. Differenziando le cellule sono state caratterizzate per l'espressione del marcatore pluripotenza Oct4 e il marcatore Pan-neuro.......
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Discussione
Questo protocollo consente di convertire efficacemente gli IPSC umani in neuroni motori spinali e cranici grazie all'espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per lignaggio. Questi transgeni sono inducibili dalla doxiciclina e stabilmente integrati nel genoma grazie a un vettore basato su trasposti piggyBac. In una popolazione mista, una o più copie del vettore piggyBac saranno integrate in modo casuale nel genoma delle singole cellule, aumentando il rischio di alterazioni dell'integrità del genoma. Inolt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare l'imaging Facility presso Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, per il supporto e la consulenza tecnica. Siamo grati ai membri del centro per la vita Nano Science per una discussione utile. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di AriSLA (Pilot Grant 2016 "StressFUS") all'AR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Reagente per dissociazione cellulare |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-colina acetiltransferasi. Anticorpi primari utilizzati nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_2079751; Numero di lotto: 2971003 |
| anti-capra Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza. RRID: AB_2534102; Numero di lotto: 1915848 |
| anti-topo Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza. RRID: AB_162542; Numero di lotto: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Anticorpi primari utilizzati nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_398736; Numero di lotto: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Anticorpo primario utilizzato nei saggi di immunocolorazione. Numero di lotto: E0117 |
| anti-coniglio Alexa Fluor 594 | Scienze immunologiche | IS-20152-1 | Anticorpo secondario utilizzato per saggi di immonofluorescenza |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Anticorpo primario utilizzato nei saggi di immunocolorazione. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Integratore senza siero per il mantenimento delle cellule neuronali |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Mezzo di congelamento cellulare, utilizzato qui per i progenitori dei motoneuroni |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Fattore neurotrofico derivato dal cervello |
| Blasticidina | Sigma-Aldrich | 203350 | Antibiotico nucleosidico che inibisce la sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Albumina sierica bovina. Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche |
| Software Clampex 10 | Molecular Devices | Clampex 10 | Sistema di registrazione delle correnti di membrana |
| Corning Matrigel hESC qualificato Matrix | Corning | 354277 | Preparato ricostituito della membrana basale dal sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Utilizzato per l'adesione di iPSC su supporti in plastica e vetro |
| CRYOSTEM ACF MEZZI DI CONGELAMENTO | Biological Industries | 05-710-1E | Mezzo di congelamento per iPSC umane |
| D-Glucosio | Sigma-Aldrich | G5146 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| Polvere DAPI | Roche | 10236276001 | 4&primo;,6-diamidino-2-fenilidolo. Macchia fluorescente che si lega all'adenina... regioni ricche di timina nel DNA utilizzate per la colorazione dei nuclei in saggi di immonofluorescenza |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Inibitore della gamma secretasi |
| Dispasi | Gibco | 17105-041 | Reagente per la dissociazione delicata delle iPSC umane |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Terreno basale per colture cellulari |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891-1G& nbsp; | Utilizzato per indurre l'espressione di transgeni da vettori epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Linea commerciale di iPSC umane |
| Kit di RNA totale EZNA | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit per l'estrazione totale di RNA da cellule eucariotiche in coltura |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Fattore neurotrofico di derivazione gliale |
| Gibco Linea hiPSC episomiale | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Linea iPSC umana commerciale |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Un'alternativa alla L-glutammina con maggiore stabilità. Migliora la salute delle cellule. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| iScript Supermix a trascrizione inversa per RT-qPCR | Bio-Rad | per l'analisi dell'espressione genica mediante qPCR in tempo reale | |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Master mix di reazione pronto all'uso ottimizzato per la PCR quantitativa a base di coloranti (qPCR) su qualsiasi strumento di PCR in tempo reale |
| K-Gluconato | Sigma-Aldrich | G4500 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| acido L-ascorbico | LKT Laboratories | A7210 | Utilizzato in colture cellulari come antiossidante |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro |
| Microscopio confocale a scansione laser | Olimpo | iX83 FluoView1200 | Microscopio confocale per l'acquisizione di immagini di immunocolorazione |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | sostanze chimiche per soluzioni elettrofisiologiche |
| Mezzo di montaggio | Ibidi | 50001 | Soluzione di montaggio utilizzata per saggi di microscopia confocale e immunofluorescenza |
| Amplificatore patch-clamp Multiclamp | Molecular Devices | 700B | Sistema di registrazione delle correnti di membrana |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | non essenziali. Utilizzato come integratore per terreni di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare. |
| Neon 100 μ L Kit | Thermo Fisher Scientific Kit | di elettroporazione cellulare | MPK10096 |
| di trasfezione Neon | Thermo Fisher Scientific | di elettroporazione cellulare | |
| MPK5000 Neurobasal Medium Thermo | Fisher Scientific | 21103049 | Terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di popolazioni cellulari neuronali senza la necessità di uno strato di alimentazione degli astrociti |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Terreno di coltura iPSC umano |
| Microscopia elettronica Paraformaldeide | Scienze | 157-8 | Utilizzato per la fissazione cellulare nei saggi di immunocolorazione |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco, con calcio, con magnesio |
| PBS Ca2+/Mg2+ senza | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | salina tampone fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza |
| magnesio penicillina/streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Soluzione di penicillina/streptomicina utilizzata per prevenire la contaminazione da colture cellulari da batteri. |
| poli-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Inibitore selettivo del recettore del fattore di crescita dell'endotelio vascolare 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole, t-Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole Tert-ottilfeniletere. Utilizzato per la permeabilizzazione cellulare nei saggi di immunocolorazione |
| Microscopio verticale | Microscopio Olympus | BX51VI | per la registrazione elettrofisiologica dotato di fotocamera CoolSnap Myo |
| Y-27632 (Inibitore ROCK) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Inibitore selettivo permeabile alle cellule della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho-spirale, contenente bobina arrotolata. Aumenta la sopravvivenza delle iPSC |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Supporto per high– analisi microscopica finale di cellule fissate |
Riferimenti
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent ....
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Ristampe e permessi
