Articolo metodologico

In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

DOI:

10.3791/59322

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23 agosto 2019

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive i modelli murini xenoinpito e ortotopici della tumorigenesi tiroidea umana come piattaforma per testare i trattamenti inibitori basati su microRNA. Questo approccio è ideale per studiare la funzione degli RNA non codificanti e il loro potenziale come nuovi obiettivi terapeutici.

Abstract

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I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica attraverso la loro capacità di destabilizzare l'mRNA e inibire la traduzione degli mRNA bersaglio. Un numero sempre crescente di studi ha identificato i miRNA come potenziali biomarcatori per la diagnosi e la prognosi del cancro, nonché come obiettivi terapeutici, aggiungendo una dimensione aggiuntiva alla valutazione e al trattamento del cancro. Nel contesto del cancro della tiroide, la tumorigenesi deriva non solo da mutazioni in geni importanti, ma anche dalla sovraespressione di molti miRNA. Di conseguenza, il ruolo dei miRNA nel controllo dell'espressione genica della tiroide si sta evolvendo come un importante meccanismo nel cancro. Qui, presentiamo un protocollo per esaminare gli effetti della somministrazione di miRNA-inibitori come modalità terapeutica nel cancro della tiroide utilizzando modelli di xenotrapianto del tumore umano e modelli murini ortotopici. Dopo aver engineering cellule tumorali della tiroide stabili che esprimono GFP e luciferasi, le cellule vengono iniettate nei topi nudi per sviluppare tumori, che possono essere seguiti da bioluminescenza. L'inibizione in vivo di un miRNA può ridurre la crescita del tumore e upregulate bersagli genici genici del miRNA. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'importanza di un miRNA determinato in vivo, oltre a identificare nuovi bersagli terapeutici.

Introduzione

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Il cancro della tiroide è una malignità endocrina con un'incidenza crescente, anche se in termini generali ha un buon risultato1. Tuttavia, alcuni pazienti sviluppano forme aggressive della malattia che non sono curabili e le basi molecolari sono poco comprese2.

I miRNA sono RNA non codificanti lunghi 22 nucleotidi che regolano l'espressione genica in molti tessuti, in genere legandosi di coppie di base alla regione non traslazionale 3' (3'UTR) di RNA messaggeri bersaglio (mRNA), innescando la degradazione dell'mRNA o la repressione traslazionale 3 (COM del nome ,<....

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Protocollo

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La sperimentazione animale è stata effettuata in conformità con il Diritto comunitario (86/609/CEE) e la legge spagnola (R.D. 1201/2005), con l'approvazione del Comitato Etico del Superiore del Consejo di Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Spagna).

1. Inoculazione del fianco delle cellule e trattamento dell'antagomiR intratutuale

  1. Preparazione cellulare
    1. Ingegnere una linea cellulare del cancro della tiroide umana Cal62 (mutazioni KRASG12R e p53A161D) per sovraesprimere un costrutto transgenico che esprime in modo stitutivo GFP e luciferasi (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selezionare le ....

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Risultati

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Abbiamo usato due diversi modelli di topi per determinare se la neutralizzazione di un miRNA potrebbe sopprimere la crescita tumorale. Di conseguenza, le cellule tiroide del tumore umano Cal62-luc sono state iniettate sottocutaneamente nei fianchi dei topi nudi per generare un modello di xenografo. Dopo due settimane, i tumori sono stati stabiliti e potrebbero essere misurati con pinze. A quel punto, i topi sono stati iniettati intratumoralmente con l'inibitore miR-146b, o un controllo appropriato, e il volume del tumore.......

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Discussione

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Questo documento descrive un metodo per studiare la funzione in vivo di un miRNA al fine di comprendere meglio il suo ruolo nell'avvio e nella progressione del tumore, e il suo potenziale come bersaglio terapeutico nel cancro della tiroide. I modelli di xenotrapianto tumorale qui descritti si basano sull'uso di cellule che possono essere monitorate dal loro segnale di bioluminescenza, permettendo la misurazione della crescita del tumore in vivo sotto l'influenza di un trattamento. Inoltre, descriviamo l'uso di un trattam.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati a Raquel Arocha Riesco per la sua assistenza con il trattamento e la cura dei topi. Ringraziamo il Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) e il Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcellona (Spagna) per aver donato rispettivamente le cellule CMV-Firefly luc- IRES-EGFP e Cal62-Luc.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AntagomiR: mirVana miRNA inibitoreThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Membrana basale Matrice : Matrigel Membrana basale Matrice Alta concentrazioneCorning#354248
DICER AnticorpoAbcamab14601IHQ: 1/100
In vivo reagente di consegna: Invivofectamine 3.0 ReagenteThermo FisherIVF3005
Software di imaging In vivo: Sistema di imaging IVIS-Lumina IICalibro Life Sciences
Controllo negativo: mirVana miRNA Inhibitor, Controllo negativo #1Thermo Fisher4464077Anticorpo PCNA pronto in vivo
Abcamab92552WB: 1/2.000
PTEN anticorpoSanta Cruzsc-7974WB: 1/1.000
XenoLight D-luciferina - Substrato bioluminescente al sale K+PerkinElmer122799diluito in PBS

Riferimenti

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  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al.

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Inibizione del microRNAModello di cancro alla tiroideIniezione tumorale ortotopicaImaging a bioluminescenzaTrattamento con antagomiRAnalisi della crescita tumoraleLinea cellulare CAL 62Modello di topo nudoIniezione retro orbitaleSubstrato D luciferina

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