Valutazione della proliferazione dei cheratinociti su bi - e tri - dimensionale substrati di collagene di tipo I

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di due forme differenti di substrati di coltura utilizzando collagene di tipo I. A seconda di come viene gestito il collagene, molecole del collagene o mantengono una forma bidimensionale, non fibrose o rimontare in forma tridimensionale, fibrilla. La proliferazione delle cellule il tipo I collagene è drasticamente influenzato dalla formazione della fibrilla.

Abstract

Tipo I collagene, utile come un substrato per la coltura cellulare, esiste in due forme: la forma bidimensionale, non fibrose e forma tridimensionale, fibrilla. Entrambe le forme possono essere preparate con lo stesso collagene di tipo I. In generale, la forma non fibrose promuove la proliferazione e l'adesione delle cellule. La forma della fibrilla (gel) fornisce ulteriori condizioni fisiologiche in molti tipi di cellule; di conseguenza, cultura gel è utile per esaminare i comportamenti fisiologici delle cellule, quali l'efficacia dei farmaci.

I ricercatori possono selezionare il modulo appropriato in base allo scopo del suo utilizzo. Ad esempio, nel caso di cheratinociti, cultura il gel è stato utilizzato come un modello di cicatrizzazione. FEPE1L-8, una linea cellulare dei cheratinociti coltivate sulla forma non fibrose di tipo I del collagene, promuovere l'adesione delle cellule. In particolare, proliferazione dei cheratinociti è più lento del form fibrilla di forma non fibrose. Protocolli per la preparazione di collagene di tipo I per coltura cellulare sono semplici e hanno ampie applicazioni a seconda delle esigenze sperimentali.

Introduzione

Tessuti connettivi interstiziali comprendono un tridimensionale reticolo proteico di composizione eterogenea, principalmente composta di tipo I di fibrille di collagene¹. Fibrille collagene giocano un ruolo chiave come impalcatura per celle^1,2,3 e interagiscono con altre proteine di matrice extracellulare (ECM)³. In vitro, diverse forme di tipo I collagene possa essere utilizzato come substrati per colture cellulari a seconda la gestione metodo^1,2,3,4. In condizioni acide, tipo I collagene mantiene la forma non fibrose⁵. Rivestimento della superficie delle piastre di coltura con la forma non fibrose promuove delle cellule adesione e proliferazione^6,7. A pH fisiologico e temperatura, le molecole di collagene di tipo I rimontare in fibrille che formano gel che possiede una struttura tridimensionale^{1,2,3,4, 5,6,7,8}. Ci sono diverse importanti con differenze tra le fibrille e forme non fibrose di tipo collagene, tra cui rigidità di matrice e le efficienze di ricostruzione dei componenti della ECM da parte delle cellule durante la coltura¹. Rigidità di Matrix è uno dei più studiati fattori normativi di cella cultura^{1, 9}. Tuttavia, rimangono da chiarire le complesse interazioni tra cellule e substrati. Per esaminare le complesse interazioni tra cellule e fattori ambientali, un sistema semplice è utile. Confronto tra il comportamento cellulare in due diverse forme di collagene può aiutare a semplificare l'effetto dei fattori ambientali. A seconda dello scopo del loro utilizzo, diverse forme di tipo I collagene può essere utilizzato in modo selettivo. Normalmente, cheratinociti sono a contatto con la membrana basale, ma non con collagene di tipo I. Tuttavia, durante la guarigione arrotolata, keratinocytes spostare al tessuto connettivo dermico, proliferare e guarire la ferita¹⁰.

Recentemente, abbiamo dimostrato che la concentrazione di calcio extracellulare è importante per la proliferazione dei cheratinociti cellule della linea utilizzando il sistema di cultura sulla forma della fibrilla di collagene che imita il tessuto connettivo cutaneo¹¹di tipo I. Quando la linea cellulare dei cheratinociti FEPE1L-8 è stato coltivato sulla forma della fibrilla di collagene di tipo I, la forma delle cellule era rotonda e loro proliferazioni sono state fermate ad una concentrazione di calcio extracellulare di 30 μM¹¹. Quando la concentrazione di calcio è stata aumentata a 1,8 mM, la crescita delle cellule è stato recuperato¹¹. Le cellule si sono sviluppate sotto entrambe le concentrazioni di calcio (30 μM e 1,8 mM) quando coltivate in forma non fibrose¹¹, considerando che erano più sensibili alla concentrazione di calcio esogeno quando coltivate sul modulo della fibrilla. FEPE1L-8 è stato generato mediante trasfezione con i tipo di papillomavirus trasformante 16 geni E6 ed E7 da carcinoma cervicale umano, non tumorigeniche, inibiscono la proliferazione illimitata con differenziazione limitata potenziale come keratinocytes normali ^12,13. FEPE1L-8 cellule possono essere mantenute utilizzando alcuni generi di mezzo specifico del keratinocyte, compreso K110 tipo-II con additivo supplemento K-1 (K110)⁶. Qui, descriviamo il protocollo di cultura della linea cellulare umana del keratinocyte su non fibrose e forme di fibrille di collagene di tipo I.

Protocollo

1. preparazione del terreno di coltura dei cheratinociti

Nota: Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.

1. Aggiungere 5 mL di penicillina-streptomicina e 10 mL di additivo supplemento K-1 a 500 mL di medium K110 tipo-II (K110) usando una pipetta.

2. preparazione della forma della fibrilla di collagene di tipo I

Nota: Eseguire procedure fino al passo 2.6 in condizioni asettiche.

1. Mantenere 10 x tampone fosfato salino (PBS (-)), acqua deionizzata, collagene, una piastra a 96 pozzetti cultura e una provetta 2 mL vuota sul ghiaccio.
   Nota: Non utilizzare la stessa piastra per preparare le fibrille e le forme non fibrose.
2. Aggiungere un tubo vuoto 2 mL utilizzando una pipetta 1,12 mL di acqua deionizzata. Aggiungere 200 µ l di PBS di x 10 (-) all'acqua deionizzata in tubo di 2 mL mediante una pipetta. Agitare delicatamente il tubo più volte.
3. Aggiungere 0,66 mL di collagene al tubo di 2 mL mediante una pipetta. Delicatamente e rapidamente agitare il tubo più volte.
   Nota: Evitare la formazione di bolle nella soluzione il più possibile. Preparare la soluzione di collagene immediatamente prima dell'uso.
4. Versare 100 µ l della soluzione collagene dal passaggio 2.3 in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti cultura. Agitare delicatamente la piastra di coltura in una da sinistra a destra movimento.
   Nota: Coprire tutta la superficie dei pozzetti con la soluzione di collagene. Se la soluzione non copre l'intera superficie, spargere la soluzione utilizzando un puntale. Evitare la formazione di bolle nella soluzione il più possibile.
5. Posizionare la piastra di coltura in incubatore a CO₂ e incubare a 37 ° C per 1 h. Check la gelificazione del collagene e spostare la piastra di coltura un banco pulito.
   Nota: Confermare la gelificazione inclinando la piastra di coltura.
6. Delicatamente versare 150 µ l di K110 sul gel utilizzando una pipetta lungo la parete del pozzo, posto la cultura piastra in un incubatore a CO₂ e incubare a 37 ° C per 1 h. spostare la piastra di coltura per un banco pulito. Prima della coltura delle cellule, delicatamente scartare il K110 utilizzando una pipetta.
   Nota: Per proteggere il gel, la punta della pipetta deve toccare la parete del pozzo.

3. preparazione della forma non fibrose di collagene di tipo I

Nota: Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.

1. Aggiungere 4 µ l di collagene a 1,2 mL di 1 millimetro di acido cloridrico (HCl) in una provetta da 1,5 mL e mescolare delicatamente con una pipetta.
   Nota: Preparare collagene immediatamente prima dell'uso. Mantenere il collagene e HCl refrigerati fino al momento dell'uso.
2. Versare 100 µ l di collagene in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 96 pozzetti usando una pipetta. Agitare delicatamente la piastra di coltura in una sinistra a destra movimento e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
   Nota: Assicurarsi che l'intera superficie dei pozzetti è ricoperta di soluzione.
3. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione di collagene e lavare i pozzetti con PBS (-) due volte utilizzando una pipetta.
4. Versare 150 µ l di 1% bovina siero albumina/PBS (-) (1% BSA) in un pozzetto della piastra 96 pozzetti cultura e incubare a temperatura ambiente per 1 h. prima della coltura delle cellule, scartare la BSA 1%.
   Nota: Assicurarsi che l'intera superficie dei pozzetti è ricoperta di soluzione.

4. la cultura delle cellule FEPE1L-8

Nota: Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.

1. Mantenere le cellule di FEPE1L-8 in K110 in un 100mm cultura piatto in incubatore a CO₂ e incubate a 37 ° C e 5% CO₂, a semi-confluenza.
2. Preparare K110, tripsina e inibitore della tripsina in un bagno di acqua a 37 ° C.
3. Con attenzione rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura, aggiungere 3 mL di tripsina 0.05% utilizzando una pipetta, mettere il recipiente in un incubatore a CO₂ e incubare a 37 ° C per 5 min. Dopo l'incubazione, controllare il distacco delle cellule dalla superficie della piastra di coltura usando la microscopia di contrasto di fase a 10 ingrandimenti.
   Nota: La morfologia delle cellule indipendente diventa rotonda. Se le cellule si sono diffuse, incubare per un ulteriore periodo di 5 min.
4. Aggiungere 3 mL di inibitore della tripsina e raccogliere le cellule indipendenti in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando una pipetta. Centrifugare le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL a 200 x g per 5 min.
5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di K110 utilizzando una pipetta. Contare le celle usando la microscopia di contrasto di fase a 10 ingrandimenti e preparare la concentrazione di cellule a 5,0 x 10⁴ cellule/mL di diluizione appropriata con K110.
6. Delicatamente il seeding 0,1 mL di K110 con cellule in ciascun pozzetto della piastra di coltura utilizzando una pipetta lungo la parete del pozzo. Posizionare la piastra di coltura in incubatore a CO₂ e incubare a 37 ° C per il tempo indicato (2 h, 1 giorno, 3 giorni).
   Nota: Per proteggere il gel, la punta della pipetta deve toccare la parete del pozzo.

5. stima del numero di cellule vitali

1. Incubare K110 in un bagno di acqua a 37 ° C. Mix 130 µ l di sale di tetrazolio, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, sale monosodico (WST-8) e 1,3 mL di K110 in un tubo di 2 mL utilizzando una pipetta.
2. Spostare la piastra di coltura un banco pulito ed eliminare delicatamente la K110 utilizzando una pipetta. Lavare via delicatamente cellule non aderenti con K110 utilizzando una pipetta
3. Aggiungere 110 µ l di K110 mescolato con WST-8 in ogni pozzetto usando una pipetta, posizionare la piastra di coltura in incubatore a CO₂ e incubare a 37 ° C per 2 h.
4. Spostare la piastra di coltura un banco pulito, raccogliere 100 µ l di medium condizionato da ciascun pozzetto e spostarlo in un pozzo di un'altra piastra 96 pozzetti. Misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 450 nm (OD₄₅₀) utilizzando un lettore di micropiastre e stima il numero di cellule vitali.

Risultati

Una rappresentazione schematica del trattamento delle superfici delle piastre di coltura utilizzando tipo I collagene è raffigurato nella Figura 1. Morfologie delle cellule osservate sulle forme non fibrose e fibrille sono presentate nei pannelli di sinistra e destra della Figura 2, rispettivamente. FEPE1L-8 cellule sono state coltivate per 2 h (pannelli superiori) e 3 giorni (pannelli inferiori). In iniziale 2h di coltura, le cellule aderito e pubblicizza su entrambe le forme di collagene (Figura 2, pannelli superiori). Tre giorni dopo la semina, cellule del form non fibrose ha continuato a diffondersi e cellulari numeri aumentati (Figura 2, pannello inferiore sinistro). Al contrario, le cellule della maschera della fibrilla hanno mostrato diffusione limitata (Figura 2, pannello di destra più bassa). FEPE1L-8 cellule continuò a proliferare sulla forma non fibrose di tipo I del collagene (Figura 3, linea nera continua, chiuso cerchi neri) e sul piatto non trattato superfici (Figura 3, punteggiato linea grigia, cerchi grigi chiusi). Al contrario, le cellule non ha fatto proliferare su forma fibrillare (Figura 3, linea tratteggiata, cerchi aperti). Figura 2 e Figura 3 sono state modificate da Fujisaki et al¹¹.

Figura 1 : Rappresentazioni schematiche di superfici piatto cultura trattate con tipo I collagene. In condizioni acide, collagene di tipo I molecole sono adsorbiti sulla superficie di un piatto in forma non fibrose (pannello di sinistra). In condizioni di neutralità a 37 ° C, tipo I collagene molecole vengono riassemblati in fibrille e adsorbiti sulla superficie dei piatti in forma di gel (pannello di destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Morfologia delle cellule di FEPE1L-8. FEPE1L-8 cellule in K110 sono state coltivate utilizzando il modulo non fibrose (10 µ g/mL; pannelli a sinistra) o forma fibrillare (1 mg/mL; pannelli di destra) di tipo I del collagene per 2 h (pannelli superiori) oppure 3 giorni (pannelli inferiori). Barre bianche indicano 100 µm. nella figura 2 è stato modificato da Fujisaki et al. in Figura 1E – H¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Proliferazione di FEPE1L-8 cell. Il numero di cellule vitali sono stato stimato nel modulo non fibrose (linea nera continua, neri cerchi pieni) o sulla fibrilla forma (linea tratteggiata, cerchio aperto) di tipo collagene, o superfici non trattate piatto (linea tratteggiata grigia, grigi cerchi pieni) per 2 h, 1 giorno e 3 giorni. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplici copie e valori sono indicati come mezzi + SD Questa figura è stata modificata da Fujisaki et al. in Figura 1J¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Alcuni componenti della ECM, tra cui collagene di tipo I, forma tridimensionale strutture in vivo¹. Coltura su tali un tridimensionale, gel substrato fornisce ulteriori condizioni fisiologiche in vitro più su una superficie bidimensionale, plastica^1,2,3,4. Sono stati segnalati numerosi protocolli per quanto riguarda il metodo di cultura del gel, come l'utilizzo di collagene^{1,2,3,4,6,7, di tipo I 11}, collagene tipo IV^14,15e¹⁶di Matrigel. Tipo I collagene è un materiale ben definito e ampiamente usato a causa della sua abbondanza e la facilità di manipolazione. Le caratteristiche di tipo purificata ho collagene dipendono l'animale specie, età e purificazione metodi^5,17. Tipo I collagene può essere purificato utilizzando acido acetico e/o proteasi, come la pepsina, papaina e proctase^5,17. Collagene solubile in acido mantiene ammino-telopeptides e proteasi-solubile collagene sono fenduti ammino-telopeptides^5,17. La durata riservata del amminico-telopeptides dipende dal tipo di proteasi, e la presenza di telopeptides influisce sulla morfologia della fibrilla e gel forza^5,17. La viscosità delle fibrille di collagene solubile in acido è maggiore di quello di proteasi-trattati collageni¹⁷. In questo studio, abbiamo usato acido-solubili collagene bovino di tipo I. Pepsina-solubilizzato collagene possono essere utilizzata anche in questo protocollo di cultura del gel; Tuttavia, la resistenza del gel è più debole¹⁷. Queste differenze nei materiali possono causare differenze di comportamento delle cellule, ma attualmente non sono buono capiti.

Il protocollo di cultura gel descritto in questo studio è molto semplice. Molte modifiche di questo metodo sono state segnalate. Una eventuale modifica della cultura dei cheratinociti è quello di imitare la membrana dello scantinato. Gel di collagene di tipo IV può essere meglio per mantenere una struttura di scantinato membrana-come substrato in vitro^15,18. Tuttavia, un lungo periodo di incubazione è necessario per la preparazione di tipo IV del collagene gel^14,15,18. Invece, miscelazione del collagene di tipo IV con tipo I gel del collagene può produrre substrati di coltura romanzo (tipo I / tipo IV del collagene ibrido gel)¹⁹. Questi gel ibrido sono facili da gestire, richiedono poco tempo per gelificazione e producono più scantinato membrana-come condizioni di cheratinociti. Il tipo I / gel ibrido del collagene di tipo IV, keratinocytes sopravvivere, formano colonie e indurre la differenziazione terminale¹⁹. Questo metodo ibrido ha applicazioni versatili.

Usando il gel cultura tipo I collagene colpisce le cellule tumorali. La forma della fibrilla di collagene di tipo I, l'attivazione di Akt e la crescita delle cellule Caco-2 (una linea cellulare del cancro del colon) sono soppressi⁷. Inoltre, la crescita delle cellule di melanoma umano (M24met) sul modulo della fibrilla è arrestata al checkpoint G1/S²⁰. Inoltre, i livelli contrassegnato aumentati di specie reattive dell'ossigeno sono osservati in preadipociti murini 3T3-L1 coltivate sul modulo della fibrilla. Inoltre, migrazione e proliferazione delle cellule sono stimolate in direzioni opposte da non fibrose e forme della fibrilla di tipo collagene²¹.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina da siero bovino (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Sciogliere 1 g di polvere di BSA in 100 ml di PBS (-) e filtrare
Kit di conteggio cellulare-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	sale di tetrazolio, 2-(2-metossi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disolfofenil)-2H  tetrazolio, sale monosodico (WST-8)
Collagene di tipo I (Collgen solubile in acido)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	da bovino (qualsiasi altra specie disponibile, la concentrazione è di 3,0 mg/mL
unità filtrante a membrana monouso DISMIC acetato di cellulosa	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0,2 µ m dimensione dei
pori della linea dei cheratinociti umani cellula FEPE1L-8			Donato dal Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	integratore additivo con 500 mg di BSA, 500 mg di estratti di corpi ipofisari bovini, 2,5 mg di insulina, 0,05 µ g di h-EGF e 5 mg di eparina
K110 Type-II medium	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	terreno di coltura basale per cheratinociti
K110 Tipo-II medium con K-1 e Penicillina-Streptomicina (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Aggiungere 5 ml di penicillina-streptomicina e 10 ml di integratore additivo (K-1) in 500 ml di terreno di coltura basale per cheratinociti K110 di tipo II
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Sciogliere 1 busta di polvere di PBS (-) in 1000 ml di acqua deionizzata e filtrare.
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Sciogliere 1 busta di polvere di PBS (-) in 100 ml di acqua deionizzata e filtrare
Penicillina-streptomicina	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 unità/mL di penisillina G e 10.000μ g/mL di streptmicina solfato in soluzione fisiologica soluzione
salina tamponata con fosfato Soluzione salina BioPerformance certificata Certi, pH 7,4	Confezione		P-5368-10
Tripsina da pancreas suino	Merck KGaA	T4799
0,05 % tripsina	Merck KGaA	T4799	Sciogliere 0,25 g di tripsina e 0,186 g di EDTA.2Na in 500 mL di PBS (-) e filtrare.
Inibitore della tripsina dalla soia	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Inibitore della tripsina	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Sciogliere 50 mg di inibitore della tripsina e 500 mg di BSA in 500 ml di PBS (-) e filtrare.