La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic

Summary

Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.

Abstract

La contrattilità cellulare è essenziale in diversi aspetti della biologia, guidando processi che vanno dalla motilità e divisione, alla contrazione dei tessuti e alla stabilità meccanica, e rappresenta un elemento fondamentale della vita animale multicellulare. Nelle cellule aderenti, la contrazione acto-miosina è osservata nelle forze di trazione che le cellule esercitano sul loro substrato. La disregolazione della contrattilità cellulare appare in una miriade di patologie, rendendo la contrattilità un obiettivo promettente in diversi approcci diagnostici utilizzando la biofisica come metrica. Inoltre, nuove strategie terapeutiche possono essere basate sulla correzione dell'apparente malfunzionamento della contrattilità cellulare. Queste applicazioni, tuttavia, richiedono la quantificazione diretta di queste forze.

Abbiamo sviluppato la microscopia a forza di trazione basata su elastomeri in silicone (TFM) in un formato multi-well parallelizzato. Il nostro uso di gomma in silicone, in particolare polidimetilsiloxane (PDMS), piuttosto che la poliacrilammide idrogel comunemente impiegata (PAA) ci permette di fare substrati robusti e inerti con una durata di conservazione indefinita che non richiede condizioni di stoccaggio specializzate. A differenza degli approcci basati su pillar-PDMS che hanno un modulo nella gamma GPa, il PDMS qui utilizzato è molto conforme, che vanno da circa 0,4 kPa a 100 kPa. Creiamo una piattaforma ad alta velocità per TFM partizionando questi grandi substrati monolitici spazialmente in pozzi biochimicamente indipendenti, creando una piattaforma multi-bene per lo screening della forza di trazione che è compatibile con i sistemi multi-well esistenti.

In questo manoscritto, utilizziamo questo sistema di forza di trazione multi-bene per esaminare la transizione epitelica a mesenchymica (EMT); induciamo EMT nelle cellule NMuMG esponendole al TGF-z e per quantificare i cambiamenti biofisici durante EMT. Misuriamo la contrattilità in funzione della concentrazione e della durata dell'esposizione al TGF- I nostri risultati qui dimostrano l'utilità della TFM parallelizzata nel contesto della biofisica della malattia.

Introduction

La contrattilità dell'acto-miosina è un elemento essenziale della meccanica delle cellule attive, influenzando i comportamenti delle cellule dalla motilità e la proliferazione alla differenziazione delle cellule staminali. Nei tessuti, la contrattilità determina l'attività dalla separazione polare nell'embriogenesi, alla costrizione delle vie aeree e all'attività cardiaca. Fondamentalmente, per generare tensione, le cellule devono prima aderire al loro ambiente extracellulare. In questo modo, questa contrattilità genera forze di trazione sull'ambiente circostante. La microscopia a forza di trazione (TFM) è emersa in una moltitudine di forme come un modo per quantificare queste forze da diverse cellule in diverse condizioni.

Il campo della TFM ha visto un'eccezionale ampiezza di innovazione e applicazione, e i risultati hanno aperto la strada a nuove prospettive in biologia, che incorporano la meccanica e le forze fisiche. A partire da substrati di silicone rugosa¹, i ricercatori hanno applicato varie tecniche per misurare le forze di trazione cellulare. Questi approcci sono stati continuamente migliorati e hanno ora raggiunto un livello di risoluzione dell'ordine di diversi micron². Tuttavia, è emerso un problema principale, che è la difficoltà di creare substrati di moduli opportunamente bassi utilizzando i siliconi disponibili. Per aggirare questo problema, la poliacrilammide è stata adottata in sostituzione grazie alla facilità di creazione di substrati nell'ordine di 1-20 kPa³. Recentemente abbiamo implementato siliconi moltoconformi in TFM 4, permettendoci di fabbricare la stessa gamma di moduli come poliacrilammide, ma con i vantaggi di silicone inerte e robusto.

Gli approcci TFM hanno permesso preziose scoperte meccano-biologiche, tuttavia, una persistente carenza è la loro complessità, spesso limitandone l'uso ai ricercatori nelle discipline ingegneristiche o scienze fisiche. Ciò è dovuto in gran parte alle calibrazioni dettagliate e ai calcoli impegnativi necessari per quantificare la contrattilità. Un'altra sfida significativa è che i metodi TFM sono in gran parte a bassa velocità effettiva e quindi inadatti a studiare molte condizioni diverse o popolazioni contemporaneamente⁵. Ciò ha presentato un collo di bottiglia, che ha ostacolato il trasferimento di TFM da un'impostazione di biofisica specialistica in applicazioni biologiche e farmacologiche più ampie.

Recentemente abbiamo sviluppato una piastra TFM multi-bene, che consente ai ricercatori di parallelizzare le loro misurazioni TFM per una più rapida quantificazione delle metriche di contrattilità, esplorando l'impatto di diversi composti e utilizzando anche meno reagenti⁴ . Questa metodologia ha un'ampia utilità in diversi studi di meccanobiologia, dalla valutazione degli effetti dei composti sull'attività cellulare, alla quantificazione dei cambiamenti contrattuali nella differenziazione o nella malattia.

Un'area di ricerca biomedica che trarrà grande beneficio dalla TFM è lo studio di come i segnali fisici influenzano i fenotipi maligni delle cellule tumorali. La metastasi, responsabile del 90% dei decessi correlati al cancro, è caratterizzata da cellule cancerose che lasciano il loro sito tumorale originale e colonizzano un sito secondario. Affinché le cellule migrano attraverso i tessuti e passino dentro e fuori dal sistema vascolare, devono cambiare radicalmente le loro forme per spremere attraverso queste barriere fisiche, generando forze sostanziali per muoversi lungo la matrice extracellulare o spostarsi tra gli altri Cellule. Queste forze vengono trasmesse al substrato attraverso interazioni di adesione focale^2,3e possono essere quantificate utilizzando TFM. Mentre i tumori sono biochimicamente eccezionalmente diversi, con un repertorio in espansione di mutazioni note e cambiamenti proteici, sono stati osservati alcuni cambiamenti fisici comuni; in una varietà di tumori, tra cui il seno, la prostata e i tumori polmonari, le cellule metastatiche hanno dimostrato di esercitare 2-3 volte le forze di trazione delle cellule non metastatiche^6,7,8. Questi risultati suggeriscono che ci può essere una forte correlazione tra la progressione metastatica e le forze di trazione esercitate dalle cellule; tuttavia, i cambiamenti dettagliati dipendente dal tempo nella contrattilità sono difficili da esaminare.

La transizione epiteliale-mesenchica (EMT) è un processo attraverso il quale le cellule riducono l'adesione mediata cellulare-aderente e a giunzione stretta, diventando più migratoria e invasiva. Oltre alle funzioni fisiologiche che includono la guarigione delle ferite e i processi di sviluppo, EMT è anche un processo sfruttato durante la metastasi, rendendolo un utile sistema modello per studiare questo processo. Utilizzando il TGF-z, possiamo indurre l'EMT nelle cellule epiteliali mammarie murine (NMuMG)⁹ a quantificare direttamente i cambiamenti fisici durante questa trasformazione e a caratterizzare gli effetti dipendenti dal tempo e dalla dose del TGF- su EMT e sulla contratcietà cellulare. In questo articolo viene illustrata l'utilità di questo approccio misurando i cambiamenti nella contrattilità durante un EMT indotto.

Protocol

NOTA: Il seguente protocollo guiderà i ricercatori nella fabbricazione e nell'utilizzo del piatto TFM multi-bene illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione dei substrati in silicone PDMS

1. Preparazione della miscela di gomma in silicone PDMS basata su una miscela composita composta di due kit disponibili in commercio.
   1. Aggiungere la parte A e la parte B del kit PDMS (ad esempio, GEL-8100, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto di peso 1:1 nel tubo da 50 mL.
      NOTA: La miscela viene miscelata su un rotatore ad una velocità sufficientemente lenta da far scorrere la miscela avanti e indietro durante la rivoluzione per garantire una miscelazione completa.
   2. Aggiungere la quantità necessaria di agente di stagionatura per il modulo desiderato del substrato.
      NOTA: La quantità di agente di cura da aggiungere alla miscela dipende dal modulo desiderato del substrato e può in genere variare da 0,1% a 1,8%. Fare riferimento alla tabella 1 e alla figura 3 per una guida a specifiche concentrazioni di crosslinker e ai moduli risultanti.
   3. Mescolare la formulazione sul rotatore per 30-45 min; garantire che la rotazione sia abbastanza lenta per una miscelazione accurata.
2. Strato inferiore: rivestimento PDMS substrati sul vetrino di vetro
   1. Posizionare il mandrino personalizzato illustrato in Figura 2 sullo spin-coater. Pulire il bicchiere con etanolo o isopropanolo e asciugarlo con una salvietta senza lafone. Posizionare il vetrino di vetro nel mandrino e accendere il vuoto per tenere il vetrino in posizione.
   2. Applicare PDMS non curato a circa 1 cm dai bordi e lavorare verso il centro. Applicare abbastanza PDMS (3-4 mL) per garantire che l'intera superficie sarà coperta.
      NOTA: Per garantire che il PDMS sia distribuito uniformemente sulla superficie del vetro, una punta pipetta può essere utile per diffondere la miscela PDMS dal centro ai bordi.
   3. Girare il vetro con la miscela PDMS su uno spin-coater con il seguente protocollo.
      1. Per diffondere il PDMS non curato sul vetrino, accelerare a 50 rpm/s da 0 a 200 giri/min; tenere a 200 rpm per 1 min.
      2. Per ottenere uno strato PDMS spesso 100 m, accelerare a 50 giri/s a 300 giri/mm e tenere per 1 min a 300 rpm. Diversi spessori desiderati diversi da 100 m richiedono valori di velocità specifici.
      3. Per rimuovere, decelerare a 50 rpm/s a 0 rpm. Disattivare il vuoto e rimuovere il vetrino rivestito, facendo attenzione a non toccare la superficie rivestita.
         NOTA: È importante includere le fasi di accelerazione e decelerazione per garantire una superficie continua liscia.
         AVVISO: Per garantire che il campione non voli fuori dal mandrino, il supporto su misura deve essere utilizzato per tenere il vetrino, e non fare affidamento semplicemente sul vuoto e sul mandrino piatto esistente. I dettagli e le specifiche di questo titolare sono riportati nella figura 2.
   4. Mettere il campione rivestito a spin in forno alla temperatura raccomandata dal produttore (100 gradi centigradi) per 2 ore.
      NOTA: La superficie del forno in cui è posizionato il campione deve essere solida (cioè, non un rack di filo) e la superficie di livello per garantire il riscaldamento uniforme e lo spessore del campione. Una lastra in ceramica o in acciaio è una superficie ideale.
3. Strato di perline superiore
   1. Aggiungere la soluzione di perline nel rapporto appropriato alla miscela PDMS rimanente.
      NOTA: Questo rapporto dipende dalla concentrazione della soluzione di perline di riserva e dalla densità di perline desiderata sul campione. I valori finali tipici sono 9,2 x 10¹¹ perline/mL e 0,05-0,2 perline/m², e un eccesso di perline è generalmente preferibile a una quantità inadeguata.
   2. Mescolare la soluzione di perline con il PDMS non curato. Questo può essere fatto posizionando il tubo su un rotatore per circa 30 min, vortice per 1-2 min, o sonicazione per 30 min. Questi metodi possono essere combinati.
      NOTA: Nella nostra applicazione, troviamo che la sonicazione è efficace nel rompere gli aggregati di perline, e la rotazione è efficace nella miscelazione. Perline fiduciarie sintetizzate possono aggregarsi in magazzino. Prima dell'uso, possono essere risospesi in esasta e sonicati. Se ci sono aggregati di grandi dimensioni significativi, si può filtrare la sospensione del tallone attraverso un filtro di siringa da 5 m. Questa fase di filtrazione è facoltativa; aiuta a rivestire il campione con perline monodisperse, ma una frazione significativa di perline può essere persa nel filtro.
   3. Togliere lo scivolo dal forno, lasciare raffreddare a temperatura ambiente e posizionarlo sullo spin-coater.
   4. Aggiungere 3-4 mL del tallone e la miscela PDMS non curata sulla superficie del campione rivestito.
      NOTA: La miscela con perline aggiunte è meno viscosa a causa dell'esano. Assicurarsi di non toccare la superficie del substrato in quanto potrebbe danneggiare il substrato PDMS già rivestito. Inoltre, la miscela di perline può inizialmente non bagnato la superficie; assicurarsi che la miscela non scorra immediatamente dalla superficie del PDMS curata.
   5. Ruotare l'esempio con il protocollo seguente.
      1. Per diffondere la miscela di perline e PDMS non curata, accelerare a 100 rpm/s da 0 a 500 giri/min; tenere a 500 rpm per 1 min.
      2. Per ottenere un sottile strato di PDMS incorporato in perline (1 m), accelerare a 200 rpm/s da 500 a 5000 rpm; tenere a 5000 rpm per 10 s.
      3. Per rimuovere, decelerare a 100 rpm/s a 0 rpm. Disattivare il vuoto e rimuovere il vetrino rivestito, facendo attenzione a non toccare la superficie rivestita.
   6. Mettete il campione rivestito a spin in forno a 100 gradi per 1 h.
      NOTA: Le temperature superiori a 100 o durate superiori a 1 h possono ridurre la fluorescenza del tallone. Assicurarsi che la temperatura del forno sia impostata su 100 gradi centigradi e non superiore.
   7. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per conservare il campione, coprire la superficie per evitare la polvere e l'esposizione alla luce. Assicurarsi che nulla tocchi la superficie. Il campione è stabile a temperatura locale a tempo indeterminato.
4. Assemblaggio della piastra
   1. Aggiungere la parte A (base) e la parte B (agente di polimeraggio, ad esempio Sylgard) di un kit di elastomeri PDMS in un rapporto di peso 10:1 nel tubo da 50 mL.
   2. Mescolare il composto sul rotatore per 30-45 min.
      NOTA: Per una piastra, mescolare 5 mL di base con 0,5 mL di agente di polimerità. Fino a 1 mL di esagonale può essere aggiunto per ridurre la viscosità della miscela.
   3. Applicare la miscela sul fondo del divisore e stendere la miscela.
      NOTA: Il divisore deve essere posizionato capovolto.
   4. Appoggiare il substrato sul divisore capovolto.
   5. Mettete il campione a testa in giù in forno a 65 gradi centigradi per 2 ore.
   6. Estrarre i campioni dal forno e pulire il fondo del vetro con 70% di etanolo o isopropanolo per rimuovere eventuali residui PDMS.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Per conservare il campione, posizionare un coperchio sul substrato e avvolgere il dispositivo in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Il campione è stabile a temperatura locale a tempo indeterminato. Il divisore utilizzato in questo metodo è in un formato di 96 po' ; tuttavia, i ricercatori possono impiegare altri formati (384-bene, 2-bene, 4-bene, 8-bene, ecc)) a seconda delle configurazioni di esperimento desiderate e la disponibilità di strutture divisorie. Potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.

2. Funzionalizzazione delle superfici

1. Dissolvere 80 - L di un Sulfo-SANPAH in 40 mL di buffer HEPES da 0,1 M (pH 7-9).
   NOTA: Preparare l'aliquota Sulfo-SANPAH sciogliendo 100 mg di polvere Sulfo-SANPAH in 2 mL di zolfo didimetilo sterile (DMSO). Preparare il buffer HEPES da 0,1 M diluindo 50 mL di HEPES in 450 mL di acqua sterile e filtrare attraverso un filtro poroso da 0,22 m.
2. Aggiungere 200 l di soluzione Sulfo-SANPAH diluita ad ogni pozzo della piastra di 96 pozze.
3. Esporre la piastra alla luce UV (300-460nm) a distanza e durata appropriate.
   NOTA: dopo l'esposizione ai raggi UV, il colore della soluzione deve essere più scuro. La distanza e la durata dell'esposizione ai raggi UV dipendono dalla potenza della lampada UV. Nella nostra applicazione, esponiamo per 10-15 min ad una distanza di 5 cm.
4. Togliere la soluzione Sulfo-SANPAH dai pozzetti e aggiungere a ogni pozzo 200 -L di 5 g/mL di fibronectina.
   NOTA: La proteina specificata dal ricercatore può essere utilizzata per il rivestimento superficiale. Alcune proteine comunemente utilizzate sono collagene, fibronectina, e laminina. Abbiamo trovato Sulfo-SANPAH per essere il metodo più efficace, e la pulizia del plasma mentre a volte impiegando in PDMS è scoraggiato in quanto crea uno strato di biossido di silicio e danneggia visibilmente la superficie.
5. Incubare la piastra a 4 gradi durante la notte.
   NOTA: Diversi metodi di incubazione possono essere applicati a seconda della proteina utilizzata per il rivestimento.
6. Rimuovere la soluzione di fibronectina e lavare ogni pozzo con la salina (PBS) con buffer fosfato due volte.
7. Posizionare un coperchio sul campione.
8. Aggiungere 200 l di PBS ad ogni pozzo.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni rivestiti di fibronectina possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.

3. sterilizzazione UV

1. Sterilizzare il campione sotto la luce UV in un armadietto di sicurezza biologico per 30 min.
   NOTA: tempi di esposizione UV più lunghi possono avere un impatto negativo sulla fluorescenza del tallone. Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili.

4. Cultura cellulare

1. Rimuovere il PBS da ogni pozzo e aggiungere 200 l di celle sospese nei supporti di coltura ad ogni pozzo.
   1. Piastrare le celle alla densità di cellule desiderata. La densità cellulare dipende dall'esperimento desiderato. Per gli studi a cella singola, le cellule devono essere distanti almeno 50 m e le cellule vicine ai bordi della finestra di imaging non devono essere incluse nella misurazione TFM. Per le cellule monostrato, la finestra di imaging deve avere il campo di visualizzazione coperto con uno strato confluente di cellule.
   2. Preparare la coltura completa per le cellule NMuMG integrando DMEM con 5% FBS, 10 mHE HEPES, 10 anamporterine b, 1% penicillina-streptomycin, 1 mM L-glutamine e 0,5 g/mL di anforcume b.
   3. Preparare lo stock di insulina ricostituito in acqua acidificata (2,5 mL di acido acetico glaciale in 130 mL di acqua deionizzata) a una concentrazione di 10 mg/mL. Conservare la soluzione di stock a 4 gradi centigradi. Attendere che la soluzione sia chiara, quindi filtrare attraverso un filtro poro s 0,22 m.
2. Aggiunta TGF-z
   1. Per preparare lo stock di TGF-z, sciogliere di 2 g di TGF-z in 100 -L di 10 mM di acido citrico (pH 3,0) e sterilizzare il filtro con 0,22 m di pori. Vorticare il tubo e aliquota nei volumi desiderati. Conservare gli aliquote a -80 gradi centigradi.
   2. Aggiungete 1,5 l di soluzione azionaria tGF-z a 10 mL del supporto di coltura cellulare completo per costituire i supporti di coltura cellulare con la concentrazione finale di TGF-z di 3 ng/mL.
      NOTA: Per fare 10 mM pH 3.0 acido citrico, diluire l'acido in acqua e regolare il pH a 3.0 aggiungendo HCl.

5. Acquisizione dati

1. Per ogni posizione, acquisire almeno un'immagine di particelle fiduciarie e cellule. Concentrati sullo strato di perline.
   NOTA: le dimensioni dei pixel devono essere ottimizzate in base alle dimensioni delle particelle fiduciarie e al metodo di elaborazione delle immagini utilizzato. In questa applicazione, gli autori utilizzano un obiettivo 10x 0.4 NA e le immagini vengono acquisite con risoluzione 1024 x 1024, con 455 nm/pixel. In generale, è utile mantenere una risoluzione di almeno 1-5 pixel per tallone; qui, le perline sono polidisperse e hanno una dimensione individuale di 300-500 nm. È fondamentale che le perle fiduciarie fluorescenti siano a fuoco per le immagini da utilizzare per i calcoli TFM. La qualità di messa a fuoco e di imaging delle perline dovrebbe essere prioritaria rispetto all'imaging delle cellule stesse. Non ci dovrebbe essere alcun dialogo incrociato tra i diversi canali, in particolare qualsiasi fluorescenza non dalle perline fiduciarie che appare negli spettri di imaging delle perline.
2. Una volta registrate tutte le posizioni di interesse, aggiungere una soluzione di distacco ad ogni pozzo per acquisire immagini di riferimento senza forza delle particelle fiduciarie.
   1. Per preparare la soluzione di distacco delle celle, mescolare una soluzione acquosa contenente 2% TritonX-100, 50 mM di azie di sodio e 500 mM di idrossido di potassio.
      NOTA: quanto sopra è fornito come esempio di una soluzione di distacco efficace. Diverse soluzioni di distacco a discrezione dei ricercatori possono essere utilizzate per staccare le cellule dalla superficie del substrato.

6. Analisi dell'immagine

1. Eseguire l'analisi dell'immagine appropriata come desiderato.
   NOTA: il software di analisi è stato sviluppato internamente. L'analisi delle immagini può essere effettuata con software o software su misura disponibili online.

7. Sintesi di perline

NOTA: Il seguente protocollo si basa sul metodo disintesi descritto da Klein et al.

1. Sotto un cofano a fumi, preparare il flacone a tre colli con un condensatore di reflusso raffreddato ad acqua.
   AVVISO: Impostare una sintesi in una cappa di fumi chimici ben ventilata.
2. Aggiungere al flacone 0,5 mL di stabilizzatore PDMS e fluoroforo.
3. Equipaggiare un collo con un setto di gomma con un ago di azoto in sella e un ago di uscita e dotare l'altro collo con un setto di gomma per aggiungere reagente con una siringa.
4. Aggiungere 100 mL di anidrioe esano in 250 mL al pallone e aggiungere una piccola barra magnetica di stiro.
5. Collocare il pallone nel bagno di olio minerale a 75 gradi centigradi e purificarlo con gas di azoto per 1 ora.
6. Aggiungere 6 mL di metilmethacryla a un pallone rotondo rotondo da 25 mL.
7. Aggiungere al flacone del fondo rotondo 0,100 g di 2,2'-azobisobutyronitrile (AIBN) al flacone inferiore rotondo ed eliminare la miscela con gas di azoto per 1 h.
   NOTA: Sciacquare il metilamethacrylato attraverso la colonna preconfezionata per rimuovere gli inibitori prima dell'uso. Aggiungere il metilamethacrita e la miscela AIBN al flacone a tre colli.
8. La soluzione inizialmente diventa torbida e diventa lattiginosa. Lasciare che la reazione venga eseguita per 3 h dopo che la soluzione diventa torbida.
9. Dopo 3 h, mettere il pallone in un bagno d'acqua ghiacciata.
10. Filtrare a vuoto la soluzione con carta da filtro grossolana.
11. Centrifugare il filtrato e ri-sospendere le particelle in esano.
    NOTA: Il volume dell'esano da aggiungere dipende dalla concentrazione desiderata della soluzione di perline. La sonicazione facilita la ridispersione delle particelle di perline nella soluzione exane. Perline prodotte dagli autori hanno diametri polidisperso di circa 300-500nm. A causa dell'uso del tracciamento del modello di correlazione incrociata per determinare gli spostamenti, non sono necessarie perline monodisperse.

8. Protocollo di misurazione della reologia

NOTA: La reologia non è necessaria per ogni ricercatore o esperimento, ma è necessario quantificare la moduliper nuove formulazioni di PDMS. In questo protocollo, impieghiamo un reometro di taglio per misurare gli effetti del linker incrociato, della frequenza e della tensione sulla moduli di campioni PDMS. A seconda degli strumenti e delle competenze disponibili, i moduli possono anche essere misurati utilizzando molti altri approcci di analisi meccanica. Inoltre, i ricercatori che utilizzano questo protocollo possono scegliere di utilizzare il nostro modulista pubblicato presentato nella tabella 1, Figura 3 e Figura 4.

1. Utilizzare un reometro con una geometria a piastre parallele di 25 mm di diametro. È possibile utilizzare altre geometrie.
2. Inizializzare il sistema e calibrare il dispositivo e il sistema di misura (piastra parallela, d - 25 mm). Dopo aver misurato lo spazio zero, iniziare a caricare il campione PDMS.
3. Non appena il clammaero PDMS e l'agente crosslinking sono stati mescolati, pinnare la miscela sulla piastra inferiore del reometro.
   1. Spostare il mandrino verso il basso per contattare completamente la parte superiore del campione PDMS.
   2. Tagliare con attenzione l'eccesso di campione caricato dalla piastra inferiore.
4. In un test di sweep di deformazione, applicare ceppi crescenti per ogni composizione con densità di interconnessione diversa per garantire che la struttura polimerica rimanga nel regime viscoelastico lineare durante tutte le misurazioni di taglio.
   NOTA: I valori di deformazione rilevanti per gli studi sulle cellule sono in genere compresi nell'intervallo di 0,1-10%. Abbiamo scoperto che pdMS è lineare fino a circa il 100% di deformazione.
5. Misurare il modulo di taglio dinamico (G') e il modulo di perdita (G) della rete PDMS in un test di sweep del tempo con una frequenza di 1 Hz e ceppo di taglio oscillatorio dello 0,5% a 100 gradi centigradi.
6. Per determinare la viscosità e la dipendenza dal tempo della rete PDMS finale, applicare un test di sweep di frequenza con frequenza compresa tra 0,1 e 100 Hz e una deformazione oscillatoria di taglio dello 0,5%.

Results

Prima dell'aggiunta del TGF-z, un monostrato confluente di cellule ha una forma simile a un ciottolo ed è strettamente imballato. Dopo il trattamento con il TGF-z, le cellule diventano più allungate in morfologia, allargando l'area cellulare e acquisendo un fenotipo più mesenchymal. Utilizzando il dispositivo multi-bene fabbricato con elastomeri PDMS morbidi, sono state studiate le proprietà fisiche delle cellule in un totale di 17 condizioni diverse. Le cellule sono state trattate con qu...

Discussion

Per il successo di questo metodo, è fondamentale avere un campione uniformemente rivestito con uno spessore costante di circa 100 m. Il modulo deve essere scelto con attenzione per esaminare il significato fisico del sistema biologico di interesse. Quando si fabbrica uno strato superiore, la concentrazione delle particelle fluorescenti fiduciarie deve essere ottimizzata per un'analisi accurata dello spostamento e dello stress da trazione. L'analisi di singole cellule isolate richiede uno strato fiduciario più denso rispe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plate
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	Dielettrico ad alta purezza, kit di gel siliconico morbido
Dow Corning Sylgard 184 Incapsulante siliconico trasparente 0,5 kg Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg	agente indurente
Vetro tagliato su misura	Hausser Scientific Company		109,6 mm di spessore x 72,8 mm di spessore
Filtro per siringa in nylon Target 2TM	ThermoFisher Scientific	F2513-4
Supporto per striscia per cassa per uova Stripwell a 96 pozzetti	Corning	2572
Coperchio universale per micropiastre in polistirene con tacca angolare	Corning	3099
Alcool etilico	Greenfield Global	P016EA95	0.95
2-propanolo	Sigma-Aldrich	190764	reagente ACS, ≥ 99,5%
Surface Coating
Sulfo-SANPAH Crosslinker	Proteochem	c1111-100mg
Fibronectina al plasma bovino	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	soluzione filtrata sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari
PBS, 1X	Wisent	319-005-CL	pH 7.4, senza calcio e magnesio
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
Cell Culture
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4,5g/L di glucosio, con L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenolo
FBS (Siero Fetale Bovino)	Wisent	080-150	Premium Quality,  Endotossina < 1, emoglobina < 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M, acido libero
Insulina umana ricombinante	Wisent	511-016-CM	USP grado
Penicillina-Streptomicina	Soluzione Wisent	450-201-EL	100 X, sterile filtrato per coltura cellulare
Soluzione di L-glutammina	Wisent	609-065-EL	200mM, sterile filtrato per coltura cellulare
Amfotericina B	Bisonte	450-105-QL	250μ g/ml, filtrato sterile per coltura cellulare
TGF umano ricombinante-β 1	Peprotech	100-21	HEK293 Acido
acetico	Sigma-Aldrich	537020	Glaciale, ≥ 99,85%
Acido citrico	Sigma-Aldrich	251275	Reagente ACS, ≥ 99,5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	Linea cellulare della ghiandola mammaria del topo
Azazuro di sodio	Fisher Schientific	AC190385000	99%, extra puro, ACROS Organics
Idrossido di potassio	Sigma-Aldrich	221473	reagente ACS, ≥ 85%, pellet
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	grado di laboratorio
Sintesi di perline
1,1′-Diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100MG	97%
Metacrilato di metile	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	contiene ≤ 30  ppm MEHQ come inibitore, 99%
Dispositivo di rimozione dell'inibitore	Sigma-Aldrich	306312-1EA	Colonna preimpaccata per la rimozione di idrochinone ed etere monometilico idrochinone
Metacrilossilpropil Gel di polidimetilsilossano terminato		DMS-R31 (25.000 g/mol)	Stabilizzante polidimetilsilossano, 25.000 g/mol, 1.000 cSt
2,2′-Azobis(2-metilpropionitrile) (AIBN)	Sigma-Aldrich	441090-25G	98%
esano	Sigma-Aldrich	296090-2L	anidro, 95%
esano, miscela di isomeri	Sigma-Aldrich	227064-1L	anidro, ≥ 99%
Whatman  carta da filtro qualitativa, Grado 1	Sigma-Aldrich	WHA1001055	cerchi, diam. 55  mm,
Equipment
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP Lampada UV portatile modello UVGL-58	VWR	21474-622
Reometro	Anton Paar	MCR 302 WESP