La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic

Sommario

Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.

Abstract

La contrattilità cellulare è essenziale in diversi aspetti della biologia, guidando processi che vanno dalla motilità e divisione, alla contrazione dei tessuti e alla stabilità meccanica, e rappresenta un elemento fondamentale della vita animale multicellulare. Nelle cellule aderenti, la contrazione acto-miosina è osservata nelle forze di trazione che le cellule esercitano sul loro substrato. La disregolazione della contrattilità cellulare appare in una miriade di patologie, rendendo la contrattilità un obiettivo promettente in diversi approcci diagnostici utilizzando la biofisica come metrica. Inoltre, nuove strategie terapeutiche possono essere basate sulla correzione dell'apparente malfunzionamento della contrattilità cellulare. Queste applicazioni, tuttavia, richiedono la quantificazione diretta di queste forze.

Abbiamo sviluppato la microscopia a forza di trazione basata su elastomeri in silicone (TFM) in un formato multi-well parallelizzato. Il nostro uso di gomma in silicone, in particolare polidimetilsiloxane (PDMS), piuttosto che la poliacrilammide idrogel comunemente impiegata (PAA) ci permette di fare substrati robusti e inerti con una durata di conservazione indefinita che non richiede condizioni di stoccaggio specializzate. A differenza degli approcci basati su pillar-PDMS che hanno un modulo nella gamma GPa, il PDMS qui utilizzato è molto conforme, che vanno da circa 0,4 kPa a 100 kPa. Creiamo una piattaforma ad alta velocità per TFM partizionando questi grandi substrati monolitici spazialmente in pozzi biochimicamente indipendenti, creando una piattaforma multi-bene per lo screening della forza di trazione che è compatibile con i sistemi multi-well esistenti.

In questo manoscritto, utilizziamo questo sistema di forza di trazione multi-bene per esaminare la transizione epitelica a mesenchymica (EMT); induciamo EMT nelle cellule NMuMG esponendole al TGF-z e per quantificare i cambiamenti biofisici durante EMT. Misuriamo la contrattilità in funzione della concentrazione e della durata dell'esposizione al TGF- I nostri risultati qui dimostrano l'utilità della TFM parallelizzata nel contesto della biofisica della malattia.

Introduzione

La contrattilità dell'acto-miosina è un elemento essenziale della meccanica delle cellule attive, influenzando i comportamenti delle cellule dalla motilità e la proliferazione alla differenziazione delle cellule staminali. Nei tessuti, la contrattilità determina l'attività dalla separazione polare nell'embriogenesi, alla costrizione delle vie aeree e all'attività cardiaca. Fondamentalmente, per generare tensione, le cellule devono prima aderire al loro ambiente extracellulare. In questo modo, questa contrattilità genera forze di trazione sull'ambiente circostante. La microscopia a forza di trazione (TFM) è emersa in una moltitudine di forme come un modo per quantifica....

Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo guiderà i ricercatori nella fabbricazione e nell'utilizzo del piatto TFM multi-bene illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione dei substrati in silicone PDMS

1. Preparazione della miscela di gomma in silicone PDMS basata su una miscela composita composta di due kit disponibili in commercio.
   1. Aggiungere la parte A e la parte B del kit PDMS (ad esempio, GEL-8100, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto di peso 1:1 nel tubo da 50 mL.
      NOTA: La miscela viene miscelata su un rotatore ad una velocità sufficientemente lenta da far scorrere la miscel....

Risultati

Prima dell'aggiunta del TGF-z, un monostrato confluente di cellule ha una forma simile a un ciottolo ed è strettamente imballato. Dopo il trattamento con il TGF-z, le cellule diventano più allungate in morfologia, allargando l'area cellulare e acquisendo un fenotipo più mesenchymal. Utilizzando il dispositivo multi-bene fabbricato con elastomeri PDMS morbidi, sono state studiate le proprietà fisiche delle cellule in un totale di 17 condizioni diverse. Le cellule sono state trattate con qu.......

Discussione

Per il successo di questo metodo, è fondamentale avere un campione uniformemente rivestito con uno spessore costante di circa 100 m. Il modulo deve essere scelto con attenzione per esaminare il significato fisico del sistema biologico di interesse. Quando si fabbrica uno strato superiore, la concentrazione delle particelle fluorescenti fiduciarie deve essere ottimizzata per un'analisi accurata dello spostamento e dello stress da trazione. L'analisi di singole cellule isolate richiede uno strato fiduciario più denso rispe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Plate
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	Dielettrico ad alta purezza, kit di gel siliconico morbido
Dow Corning Sylgard 184 Incapsulante siliconico trasparente 0,5 kg Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg	agente indurente
Vetro tagliato su misura	Hausser Scientific Company		109,6 mm di spessore x 72,8 mm di spessore
Filtro per siringa in nylon Target 2TM	ThermoFisher Scientific	F2513-4
Supporto per striscia per cassa per uova Stripwell a 96 pozzetti	Corning	2572
Coperchio universale per micropiastre in polistirene con tacca angolare	Corning	3099
Alcool etilico	Greenfield Global	P016EA95	0.95
2-propanolo	Sigma-Aldrich	190764	reagente ACS, ≥ 99,5%
Surface Coating
Sulfo-SANPAH Crosslinker	Proteochem	c1111-100mg
Fibronectina al plasma bovino	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	soluzione filtrata sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari
PBS, 1X	Wisent	319-005-CL	pH 7.4, senza calcio e magnesio
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
Cell Culture
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4,5g/L di glucosio, con L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenolo
FBS (Siero Fetale Bovino)	Wisent	080-150	Premium Quality,  Endotossina < 1, emoglobina < 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M, acido libero
Insulina umana ricombinante	Wisent	511-016-CM	USP grado
Penicillina-Streptomicina	Soluzione Wisent	450-201-EL	100 X, sterile filtrato per coltura cellulare
Soluzione di L-glutammina	Wisent	609-065-EL	200mM, sterile filtrato per coltura cellulare
Amfotericina B	Bisonte	450-105-QL	250μ g/ml, filtrato sterile per coltura cellulare
TGF umano ricombinante-β 1	Peprotech	100-21	HEK293 Acido
acetico	Sigma-Aldrich	537020	Glaciale, ≥ 99,85%
Acido citrico	Sigma-Aldrich	251275	Reagente ACS, ≥ 99,5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	Linea cellulare della ghiandola mammaria del topo
Azazuro di sodio	Fisher Schientific	AC190385000	99%, extra puro, ACROS Organics
Idrossido di potassio	Sigma-Aldrich	221473	reagente ACS, ≥ 85%, pellet
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	grado di laboratorio
Sintesi di perline
1,1′-Diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100MG	97%
Metacrilato di metile	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	contiene ≤ 30  ppm MEHQ come inibitore, 99%
Dispositivo di rimozione dell'inibitore	Sigma-Aldrich	306312-1EA	Colonna preimpaccata per la rimozione di idrochinone ed etere monometilico idrochinone
Metacrilossilpropil Gel di polidimetilsilossano terminato		DMS-R31 (25.000 g/mol)	Stabilizzante polidimetilsilossano, 25.000 g/mol, 1.000 cSt
2,2′-Azobis(2-metilpropionitrile) (AIBN)	Sigma-Aldrich	441090-25G	98%
esano	Sigma-Aldrich	296090-2L	anidro, 95%
esano, miscela di isomeri	Sigma-Aldrich	227064-1L	anidro, ≥ 99%
Whatman  carta da filtro qualitativa, Grado 1	Sigma-Aldrich	WHA1001055	cerchi, diam. 55  mm,
Equipment
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP Lampada UV portatile modello UVGL-58	VWR	21474-622
Reometro	Anton Paar	MCR 302 WESP

derivato