Articolo metodologico

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

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DOI:

10.3791/59382

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31 marzo 2019

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1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

In questo articolo

Sommario

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

Abstract

CCCTC-associazione fattore (CTCF)-mediata stabile topologicamente associando i domini (TADs) svolgono un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs. CTCF svolge un ruolo importante nel regolare l'espressione spaziale e temporale dei geni HOX che controllano lo sviluppo embrionale, patterning di corpo, ematopoiesi e leukemogenesis. Tuttavia, rimane in gran parte sconosciuto se e come i confini HOX loci associati CTCF regolano organizzazione della cromatina ed espressione genica HOX . Nel protocollo attuale, una libreria in pool specifico sgRNA targeting per tutti i siti di legame di CTCF nei loci HOXA/B/C/D è stata generata per esaminare gli effetti di turbare i confini di cromatina CTCF-collegata sulla formazione di TAD e gene HOX espressione. Attraverso CRISPR-Cas9 screening genetico, il sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) è stato identificato come un regolatore critico del dominio della cromatina oncogeno, oltre ad essere importante per mantenere un gene HOX ectopico modelli di espressione in MLL-riorganizzate leucemia mieloide acuta (AML). Così, questa libreria sgRNA approccio di screening fornisce nuove conoscenze sulla organizzazione di genoma CTCF mediata in loci genici specifici e inoltre fornisce una base per la caratterizzazione funzionale degli elementi normativi genetici con annotazioni, entrambi di codifica e non codificante, durante i normali processi biologici in epoca di progetto genoma post-umano.

Introduzione

Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L'organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs1. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, spesso funziona come una barriera di cromatina presso un sito specifico in una cella tipo ma non in altro, suggerendo che funzioni CTCF insieme ad altre attività nella formazione della cromatina confini2. Ciò che rimane sconosciuto è se gli elementi di contorno (siti di legame per CTCF) sono direttamente collegati alla funzione biologica di CTCF, e come questi collegamenti si verificano. Quindi, supponiamo che specifici siti di legame di CTCF nel genoma direttamente regolano la formazione di TADs e controllano le interazioni promoter/enhancer all'interno di questi domini o tra domini limitrofi. Il completamento dei umani e successive analisi epigenetiche e progetti di sequenziamento del genoma di topo hanno scoperto nuove firme genetiche e molecolari del genoma. Tuttavia, il ruolo di firme/modifiche specifiche nella regolazione genica e la funzione cellulare, come pure i loro meccanismi molecolari, devono ancora essere pienamente compreso.

Linee multiple di prova sostengono che il TADs CTCF-mediata rappresenta funzionale della cromatina domini3,4,5. Anche se CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, dati CTCF ChIP-seq ampi del genoma ha rivelato che CTCF spesso funziona come una barriera di cromatina in una cella tipo ma non negli altri2. CTCF svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo di mediazione genoma organizzazione4,6,7. Rottura dei confini CTCF alterata enhancer/promotore interazioni ed espressione genica, che conduce al bloccaggio inerente allo sviluppo. Ciò suggerisce che CTCF mediata TADs sono non solo componenti strutturali, ma anche unità normativo necessario per enhancer corretta azione e gene trascrizione5,8,9.

Geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e sono temporalmente e spazialmente limitate nel loro pattern di espressione. Il locus HOXA forma due TADs stabile che separa geni anteriori e posteriori da un elemento di contorno CTCF-collegata in hESCs e IMR90 cellule1. I rapporti recenti hanno dimostrato che HoxBlinc, un HoxB locus associato lncRNA, media la formazione di CTCF diretto TADs e interazioni enhancer/promotore in luogo del HOXB . Questo porta alla attivazione del gene HOXB anteriore durante ESC impegno e differenziazione10. Inoltre, ai loci genici specifici compreso il luogo HOXA , alterazione di CTCF mediata profili di espressione genica specifici di TAD domini ha cambiato la sua stirpe ed è stata associata con lo sviluppo della malattia stati11,12. La prova sostiene una funzione primaria per CTCF nella trascrizione genica di coordinamento e nella determinazione della microcella organizzando il genoma in domini funzionali.

Nonostante il suo ruolo nello sviluppo embrionale, durante l'ematopoiesi, geni HOX regolano la funzione delle cellule (HS/PC) ematopoietica staminali e progenitrici. Questo viene fatto controllando l'equilibrio tra proliferazione e differenziazione10,13,14,15. L'espressione dei geni HOX è strettamente regolata in tutta la specifica e la differenziazione delle cellule ematopoietiche, con massima espressione in HS / espressione genica pz. HOX gradualmente diminuisce durante la maturazione, con i suoi livelli più bassi che si verificano differenziato cellule ematopoietiche16. Disregolazione genica HOX è un meccanismo dominante di trasformazione leucemica di proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione disregolando di HS/PCs che conduce alla trasformazione leucemica17,18. Tuttavia, il meccanismo di stabilire e mantenere la normale vs modelli di espressione oncogena di geni HOX , nonché reti di regolazione associati rimane poco chiaro.

Lo screening CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteca è stato ampiamente usato per interrogare di geni codificanti per proteine19 come bene come geni non codificanti, come lncRNA20 e miRNA21 in specie diverse. Tuttavia, il costo per utilizzare la libreria di sgRNA CRISPR-Cas9 per identificare nuovi bersagli genomici rimane alto, perché il sequenziamento del genoma ad alta velocità è spesso applicato per verificare la proiezione di libreria sgRNA. Nostro sgRNA sistema di screening è focalizzata sul loci specifici genoma e valuta la sgRNAs targeting attraverso One-step RT-PCR secondo l'espressione del gene marcatore, ad esempio HOXA9. Inoltre, Sanger sequenziamento ha confermato che il sgRNA è stato integrato nel genoma le mutazioni Indel può essere rilevata per identificare il sgRNA targeting per sito. Attraverso lo screening genetico loci specifici CRISPR-Cas9, il confine di cromatina CBS7/9 è stato identificato come un regolatore fondamentale per stabilire il dominio della cromatina oncogeno e mantenere ectopico pattern di espressione genica HOX nella patogenesi dell'AML 12. il metodo può essere ampiamente applicato per identificare non solo la funzione specifica di confine CTCF in sviluppo embrionale, ematopoiesi, leukemogenesis, ma anche limite di CTCF come potenziali bersagli terapeutici per la futura terapia epigenetica.

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Protocollo

1. CTCF sgRNALibrary Design utilizzando uno strumento Online

  1. Progettare il sgRNA targeting siti di legame di CTCF nei loci HOX umani utilizzando lo strumento di progettazione genetica perturbazione piattaforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Sintetizzare un totale di 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncRNA targeting geni (Figura 1, tabella 1). Ogni elemento di DNA targeting è bersagliato da 5-10 differenti sgRNAs.

2. sgRNA biblioteca clonazione

  1. Clonare gli oligonucleotidi sintetizzati nel vettore lentivirale spina dorsale CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digerire il vettore LentiCRISPRv2 con enzima di restrizione BsmBI a 37 ° C per 2 h.
    2. Cercare la presenza della band più grandi (circa 12.873 bp) sul gel dopo digestione di BsmBI e quindi purificarla con il kit di estrazione del gel.
      Nota: Un pezzo di piccola riempitrice kb 2 è anche presente sul gel dopo la digestione, ma questo può essere ignorato.
    3. Legare gli oligonucleotidi sintetizzati e digerito LentiCRISPR vettoriale con 150 ng di digerito LentiCRISPR DNA, 1 µ l di 10 µM oligos, 2 µ l di tampone di ligasi 10 x T4, 1 µ l di ligasi T4 e poi incubare a 16 ° C durante la notte.
  2. Trasformare la libreria CRISPR/sgRNA lentivirale nelle cellule electro-competente per l'amplificazione.
    1. Preparare la electroporator a 1,8 kV, 200 Ω e 25 µF. Pre-riscaldare il recupero media SOC in bagnomaria a 37 ° C, quindi pre-riscaldare piatti antibiotici ampicillina della libbra a 37 ° C.
    2. Scongelare le cellule competenti in ghiaccio per 10 min.
    3. Preparare le provette da 1,5 mL micro-centrifuga e 1 mm elettroporazione cuvette sul ghiaccio.
    4. Mescolare 1 µ l di un plasmide di biblioteca di 10 ng / µ l DNA in 25 µ l di cellule competenti in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga e mescolare delicatamente, spostando il fondo della provetta un paio di volte manualmente.
    5. Una volta che la cuvetta è abbastanza fredda, è possibile trasferire la miscela delle cellule del DNA/competenti ad esso. Toccare due volte sul piano di lavoro e pulire eventuali gocce di acqua dall'esterno della cuvetta con una velina. Quindi posizionare la cuvetta nel modulo elettroporazione e premere impulso.
    6. Aggiungere immediatamente 975 µ l di media di 37 ° C pre-riscaldato SOC. Mix di pipettaggio su e giù e trasferirlo in una provetta da 15 mL.
    7. Ruotare e incubare a 37 ° C per 1 h.
    8. Diluire 100 celle µ l in 900 µ l di media SOC e mettere 100 µ l su una piastra di agar antibiotico ampicillina LB. Incubare per una notte a 37 ° C.
  3. Estrarre il DNA del plasmide dalle colonie combinate utilizzando una colonna maxi-prep come specificato nel protocollo del produttore.
    1. Raschiare tutte le colonie dalla piastra di agar di LB e inoculare una coltura starter di 2 mL di mezzo di antibiotico ampicillina LB e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione vigorosa (~ 200 x g).
    2. Diluire la cultura starter 1: 500 in 100 mL di terreno LB ampicillina e incubare a 37 ° C per 12-16 ore con agitazione vigorosa (~ 200 x g).
    3. Raccogliere il pellet cellulare batterica mediante centrifugazione a 6.000 x g per 15 min a 4 ° C.
    4. Risospendere il pellet batterico in 10 mL di buffer di sospensione.
    5. Lisare precipitato sospeso con 10 mL di tampone di lisi e vigorosamente invertire 4 - 6 volte. Incubare il lisato per 5 min a temperatura ambiente.
    6. Neutralizzare il lisato con 10 mL di tampone di neutralizzazione refrigerati. Miscelare capovolgendo delicatamente i tubi di 4 - 6 volte e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
    7. Rotazione verso il basso a 13.500 x g per 30 min a 4 ° C. Prontamente trasferire il surnatante contenente il DNA del plasmide ad un nuovo tubo.
    8. Ripetere il passaggio 2.3.7 e prontamente trasferire il surnatante contenente il DNA del plasmide ad un nuovo tubo.
    9. Equilibrare la colonna applicando 10 mL di buffer di equilibrazione e consentire nella colonna vuota di flusso di gravità.
    10. Aggiungere il supernatante alla colonna e permetterle di entrare la resina da colata a gravità.
    11. Lavare la colonna con 2 x 30 mL di tampone di lavaggio.
    12. Eluire il DNA con 15 mL di tampone di eluizione.
    13. Precipitare il DNA con 10,5 mL di isopropanolo temperatura al DNA eluito. Mix e spin giù immediatamente a 15.000 x g per 30 min a 4 ° C e delicatamente decantare il supernatante.
    14. Lavare la pallina di DNA con 5 mL di etanolo al 70%, a pellet di DNA di centrifuga a 15.000 x g per 10 min e scartare il supernatante chiaro.
    15. Ripetere il passaggio 2.5.14 altre due volte.
    16. Centrifugare a pellet di DNA a 15.000 x g per 10 min e delicatamente decantare il supernatante senza disturbare il pellet di DNA.
    17. Asciugare il pellet per 5-10 min e sciogliere il DNA in un volume richiesto del buffer (buffer di TE, pH 8.0).

3. l'alto titolo sgRNA generazione della libreria Lentivirus

  1. Preparazione di cella: cultura HEK293T cellule in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS) e 1% (vol/vol) penicillina-streptomicina (PS) antibiotico in boccette di T-25. Metterli in incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
  2. Pacchetto dei lentivirus: co-transfect HEK293T cellule con 20 µ g di vettori libreria purificata dal passaggio 2, 15 µ g del plasmide pacchetto (psPAX2) e 10 µ g del plasmide busta (pMD2.G) per 48 h prima della raccolta i virus.
  3. Collezione di virus: dopo 48 h, collectthe virus surnatante e filtrare il surnatante attraverso una membrana PVDF di 0,45 µm povera in proteine associazione virus.
  4. Concentrazione di virus: concentrare il surnatante lentivirale utilizzando 50 volte il concentratore e testare il virus MOI nel passaggio 5.
  5. Deposito di virus: aliquota del concentrato virus e conservare in un congelatore a-80 ° C.

4. ottimizzato con puromicina concentrazione

  1. Coltura delle cellule di leucemia: cellule di cultura MOLM13 AML in RPMI 1640 completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS) e 1x antibiotici penicillina-streptomicina (PS) in un matraccio da T-125. Metterli in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Le cellule sono in genere passate ogni 4-5 d a un rapporto di divisione di 1:4 o 1:6, mai permettendo che le cellule di raggiungere più di 70% confluency.
  2. Impostare MOLM13 cellule in un piatto di 12-pozzetti con una densità pari a 1,0 x 104 cellule/mL, a un volume totale di 2 mL per pozzetto (2.0 x 104 celle).
  3. Analisi di tempo-corso: cellule MOLM13 trattare con con puromicina per 7 giorni in aumento delle concentrazioni (0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL)
    1. Impostare MOLM13 cellule senza un trattamento con puromicina il giorno 0 e impostare 3 pozzi replicare senza un trattamento con puromicina come controllo dal giorno 0 al giorno 7.
    2. Curare le cellule MOLM13 con 0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL, separatamente, con ogni condizione sperimentale contenente 3 pozzi replicare.
    3. Il rapporto di cellule vive di contare e fare una curva di sopravvivenza dal giorno 0 al giorno 7 contenente tutte le condizioni.
  4. Curva di sopravvivenza: macchia le cellule con Trypan blue e conteggio vitalità ogni giorno per ottenere le curve di sopravvivenza per ciascuna concentrazione con puromicina.
  5. Ottimizzare la concentrazione minima con puromicina: determinare la concentrazione minima con puromicina attraverso la colorazione blu di Trypan nel quale MOLM13 tutte le cellule sono uccise tra 5-7 giorni.

5. titolazione della biblioteca lentivirale in cellule di leucemia di MOLM13

  1. Preparazione di cellule di AML: raccogliere le cellule MOLM13 AML con il mezzo di trasduzione (RPMI 1640, 10% FBS, PS di 1% e 8,0 µ g/mL liquido di rivestimento) con una densità di 1.5 x 106 cellule/ml.
  2. Posto MOLM13 cellule della piastra 12-pozzetti con 1.5 x 106 cellule in ciascun pozzetto.
  3. Scongelare il lentivirus: rimuovere il lentivirus concentrato dal congelatore-80 ° C e scongelare su ghiaccio.
  4. Mix MOLM13 cellule con una dose diversa del lentivirus concentrato in pozzetti separati, tra cui 0, 1, 2.5, 5, 7,5 e 10 µ l (totali 6 gruppi).
  5. Immediatamente centrifugare queste miscele a 1.000 x g per 2 h a 33 ° C e trasferire le 12-pozzetti piastre in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 4 h.
  6. Dopo 4 h, rotazione verso il basso le cellule infettate a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  7. Delicatamente aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule trasdotte con mezzi freschi (RPMI 1640, 10% FBS e 1% PS) e poi trasferirli in boccette di T-25 e incubare a 37 ° C per 48 h senza con puromicina.
  8. Dopo 48 h, queste celle suddivise in 2 flaconi (2 gruppi): un gruppo sperimentale trattato con 1 con puromicina µ g/mL per 5 giorni e un gruppo di controllo senza un trattamento con puromicina per 5 giorni.
  9. Effettuare con puromicina selezione per 5 giorni con 1 con puromicina µ g/mL secondo il punto 4 fino a quando tutte le celle di controllo non trasdotte sono morte. Cambio per i media freschi ogni 2 giorni.
  10. Misurare il valore MOI ottimizzato per trasduzione del dividendo il numero di cellule vive, trattati con con puromicina con il numero di cellule senza un trattamento con puromicina.

6. trasduzione della libreria KO pool CRISPR-Cas9

  1. Trasduzione con lentivirus: infettare 1.5 x 106 MOLM13 cellule con 0,3 MOI di lentivirus sgRNA riunito in mezzo (RPMI 1640, 10% FBS, PS di 1% e 8 µ g/mL liquido di rivestimento) in piastra a 6 pozzetti e utilizzare le celle senza l'infezione dei lentivirus come controllo.
  2. Immediatamente Centrifugare la piastra 6 pozzetti a 1.000 x g per 2 h a 33 ° C a spinfect le cellule e trasferire le piastre in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 4 h.
  3. Rotazione verso il basso le cellule infettate a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Delicatamente aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule trasdotte con mezzi freschi (RPMI 1640, 10% FBS e 1% PS) e poi trasferirli in boccette di T-25 e incubare a 37 ° C per 48 h senza con puromicina.
  5. Dopo 48 h, è possibile trattare le cellule con 1 con puromicina µ g/mL per 5 giorni. Scambiare per media fresco dopo 2 giorni e mantenere una densità cellulare ottimale.
  6. Il singolo clone in piastre da 96 pozzetti con limitazione di metodi di diluizione del seme e incubare questi singoli cloni a 37 ° C e 5% CO2. Della loro coltura per 3-4 settimane.
  7. Dopo una singola cellula si sviluppa in su in una popolazione, trasferire la metà delle cellule in 24 pozzetti per ulteriore cultura sotto selezione con puromicina e verificare questi cloni nel passaggio successivo. Mantenere il resto delle cellule.

7. screening della libreria KO pool CRISPR-Cas9 con One-step RT-qPCR

  1. Determinare l'efficacia del clone integrato sgRNA screening dalla valutazione dell'espressione del gene marcatore HOXA9 con un passo d'inversione-transcriptase della polimerasi catena (One-step RT-qPCR).
    Nota: HOXA9 sono altamente espressi in cellule di AML MOLM13 in leukemogenesis22,23.
  2. Conte il sgRNA integrato MOLM13 e trasferimento 1 x 104 cellule per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.
  3. Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min e poi accuratamente rimuovere e scartare il surnatante con una pipetta senza disturbare il pellet cellulare.
  4. Lavare le cellule con 125 µ l di tampone PBS e centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min. Quindi rimuovere 120 µ l del surnatante con una pipetta e conservare circa 5 µ l di PBS in ciascun pozzetto.
  5. Aggiungere 50 µ l di mix master lisi cellulare contenente 48 µ l di tampone di lisi delle cellule, 1 µ l di soluzione di proteinasi K (10 mg/mL) e 1 µ l di soluzione di dnasi (1 mg/mL) ad ogni pozzetto. Quindi dispensare su e giù per 5 volte per risospendere il pellet cellulare.
  6. Incubare il mix per 10 min a temperatura ambiente, seguita da 5 min a 37 ° C e poi a 75 ° C per 5 min.
  7. Memorizzare il lysate delle cellule in congelatore a-80 ° C.
  8. La preparazione della reazione di One-step RT-qPCR: scongelare il mix di reazione di One-Step e altri componenti di reazione a 4 ° C. Quindi rallentare brevemente per raccogliere soluzioni nella parte inferiore dei tubi e metterli su ghiaccio senza luce. Mescolare e girare delicatamente.
  9. Aggiungere 1 µ l di lysate delle cellule per i pozzetti PCR con il mix di reazione di RT-qPCR, tra cui 1 µ l di primer forward di gene marcatore (300 nM) e reverse primer (300 nM), 0.125 µ l della trascrittasi inversa (10 U / µ l) e 5 µ l di miscela di reazione di One-Step (2x).
  10. Sigillare i pozzetti con la pellicola otticamente trasparente e delicatamente vortice e miscelare i componenti di reazione.
  11. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti su uno strumento PCR in tempo reale.
  12. Eseguire la reazione di trascrizione inversa per 10 min a 50 ° C, seguita da inattivazione della polimerasi e denaturazione del DNA per 1 min a 95 ° C.
  13. Eseguire RT-PCR con 40 cicli di reazione di PCR: denaturazione per 15 s a fluorescenza 95 ° C, ricottura/estensione e piastra di lettura per 20 s a 60 ° C e quindi analisi della curva di fusione a 65-95 ° C tramite incrementi di 0,5 ° C a 2-5 s/step.
  14. Impostare sovraregolati, downregulated e nessun cambiamento in gruppi secondo i livelli di espressione del gene HOXA9 in confronto al controllo, separatamente. Utilizzare gene β-actina come controllo gene housekeeping.

8. Verifica dell'integrato sgRNAs cloni positivi attraverso la genotipizzazione e la sequenza di Sanger

  1. Verificare i cloni di espressione HOXA9 è diminuito attraverso Sanger sequenziamento ed eseguire PCR con 50-100 genoma ng MOLM13 DNA, buffer di 5 µ l della polimerasi reazione (10x), primer di 1 µ l in avanti (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) e 1 µ l inverso Primer (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µ l dNTP (10mM), polimerasi (5 U /µL) di 1 unità. Eseguire la reazione di PCR con la denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 s e quindi più denaturazione a 94 ° C per 20 s, ricottura a 56 ° C per 20 s, estensione a 68 ° C per 20 s (Totale 30 cicli), estensione finale a 68 ° C per 10 min e quindi si tiene a 4 ° C.
  2. Estrarre e purificare i prodotti di PCR (dimensione 285 bp) con un Kit di purificazione di PCR.
  3. Legare i prodotti di PCR purificati nel vettore T con 2 µ l T4 legatura di tampone (10x), 50 ng T vector DNA (50 ng / µ l), 25 ng purificato PCR DNA (285 bp), ligasi di 1 µ l T4 (3 unità / µ l) e posto la legatura si mescolano in un incubatore a 16 ° C durante la notte.
  4. Trasferire il mix di legatura in cellule competenti DH5α, crescere su una piastra di agar antibiotico ampicillina LB e incubare per una notte a 37 ° C.
  5. Scegli i singoli cloni dalla piastra LB e verificarli di genotipizzazione e Sanger sequenziamento.

9. rilevazione di sgRNAs mutazione Indel indotte dall'analisi di digestione di nucleasi

  1. Rilevare che il sgRNA integrato singolo clone indotto Indel tariffe da un'analisi di test di nucleasi.
  2. A parte preparare ampliconi PCR con 50-100 ng Indel mutante (test) e DNA wild-type (WT, riferimento) come modello PCR, 5 µ l tampone di reazione della polimerasi (10x), 1 µ l dNTP (10mM), polimerasi (5 U / µ l) di 1 unità, 1 µ l primer avanti (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') e 1 µ L reverse primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La reazione di PCR è stata effettuata con denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s e poi la denaturazione a 98 ° C per 20 s, ricottura a 56 ° C per 20 s, estensione a 72 ° C per 30 s (Totale 30 cicli) ed estensione finale a 72 ° C per 10 min e che tiene a 4 ° C.
  3. Impostare il gruppo di miscela dell'eteroduplex con 200 ng di "reference" (20 ng / µ l) e 200 ng di "prova" (20 ng / µ l) tra gli ampliconi PCR in provetta PCR 0,2 mL e il gruppo di miscela omoduplex con solo 400 ng di "reference" ampliconi PCR come controllo.
  4. Separatamente Incubare la miscela dell'eteroduplex e omoduplex a 95 ° C per 5 min in un becher da 1 litro riempito con 800 mL di acqua e poi raffreddare gradualmente a temperatura ambiente per temprare e formare dell'eteroduplex o omoduplici.
  5. Separatamente il digest 400 ng della miscela dell'eteroduplex e omoduplex ricotta con nucleasi di 1 µ l indel mutazione rilevamento (2,5 U / µ l) e 2 µ l tampone reazione nucleasi (10x) a 42 ° C per 60 min.
  6. Analizzare i campioni digeriti con elettroforesi su gel di agarosio, il DNA di miscela dell'eteroduplex deve essere tagliato in piccoli frammenti (70-250 bp) e alla omoduplex DNA (320 bp) non devono essere tagliate.

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Risultati

La tecnologia CRISPR-Cas9 è un potente strumento di ricerca per gli studi di genomici funzionali. Si sta rapidamente sostituendo il gene convenzionali tecniche di editing ed ha alta utilità per applicazioni orientate al gene genoma e individuali. Qui, la prima individualmente clonato loci specifici CRISPR-Cas9-schierati sgRNA libreria contiene 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncR...

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Discussione

Proteina-codificazione gene relativo sgRNA librerie sono state applicate in un sistema di screening funzionale all'identificazione di geni e i networks che regolano specifiche funzioni cellulari attraverso sgRNA arricchimento24,25,26 ,27,28. Regione non codificante diversi correlati sgRNA librerie inoltre sono state indicate nelle schermate funzionale gene-sp...

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Dichiarazioni

Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano anche Nicholas Cesari per il manoscritto di editing. Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente Lipofectamina 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinasi KThermo Fisher Scientific25530049
PuromicinaThermo Fisher ScientificA1113802
cellule Stbl3Tecnologie per la vita 
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligasi New England Biolabs  M0202S
Kit per estratto di gel QIAquickQIAGEN28706
Kit di purificazione QIAuick PCRQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR®   Kit Verde One-StepBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Maxi Kit PlasmidicoQIAGEN12163
Dulbecco' s Aquila modificata media Thermo Fisher Scientific 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Siero fetale bovino (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillina/streptomicina/L-glutammina Tecnologie per la vita 
concentratore Lenti-X Clontech631232
Soluzione blu di tripanoThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) Genessee Scientific  25-507
tampone TAE Thermo Fisher Scientific FERB49
Geometra Kit di rilevamento delle mutazioni TecnologieDNA integrate706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifuga 5424 REppendorf5404000138
Bagni a secco/riscaldatori a blocchi digitali ThermoFisher Scientific88870002
Congelatori ultra-bassi serie TSXThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma&commercio; Steri-Culto & commercio; CO2  IncubatriciThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Cabina di Sicurezza Biologica Classe IIThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Leggenda e commercio; Centrifuga XT/XF SerieThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™   Isotemp&commercio; Bagni d'acquaThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™   Localizzatore e commercio; Plus Sistemi rack e boxThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-Rad1855195
MiniAmp™ TermociclatoreApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™   Gufo&commercio; EC300XL2 alimentatore compattoThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™   Gufo&commercio; EasyCast&commercio; B1 Mini Sistemi di Elettroforesi su GelThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Rotatore per tubi e girarrostiVWR International10136-084
VWR® Mini agitatore in incubazioneVWR International12620-942
Bilancia analitica MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
Spettrofotometro DS-11 FX e DS-11 FX+DeNovix Inc.DS-11 FX
C7373031196508410378016

Riferimenti

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