In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Louis Masclef; Uriarte Maxime; Oumaima Ahmed; Nadine Sen Nkwe; Haithem Barbour; Nicholas  V.G. Iannantuono; Amina Boubekeur; Salima Daou; El Bachir Affar

doi:10.3791/59385

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Articolo metodologico

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

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DOI:

10.3791/59385

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25 luglio 2019

Louis Masclef^*¹ , Uriarte Maxime^*¹ , Oumaima Ahmed¹ , Nadine Sen Nkwe¹ , Haithem Barbour¹ , Nicholas V.G. Iannantuono¹ , Amina Boubekeur¹ , Salima Daou¹^,² , El Bachir Affar¹^,²

¹Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, ²Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

Abstract

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante in vari percorsi di segnalazione ed è particolarmente coinvolta nel coordinamento della funzione della cromatina e dei processi associati al DNA. Questa modifica comporta un'azione sequenziale di diversi enzimi, tra cui E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjuging e E3 ubiquitin-ligase ed è invertita da deubiquitinaes (DUB). L'ubiquitinazione induce la degradazione delle proteine o l'alterazione della funzione proteica, compresa la modulazione dell'attività enzimatica, l'interazione proteina-proteina e la localizzazione subcellulare. Un passo fondamentale nella dimostrazione dell'ubiquitinazione proteica o della deubiquitinazione è quello di eseguire reazioni in vitro con componenti purificati. Un'efficace ubiquitinazione e reazioni di deubiquitinazione potrebbero essere fortemente influenzate dai diversi componenti utilizzati, dai co-fattori enzimatici, dalle condizioni di buffer e dalla natura del substrato. Qui, forniamo protocolli passo-passo per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Illustriamo queste reazioni utilizzando componenti minimi del mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, un E3 ubiquitin ligase che monoubiquizza istone H2A sulla lisina 119. La deubiquitinazione del nucleosomal H2A viene eseguita utilizzando un complesso minimo Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) formato dal deubiquitinase BAP1 umano e dal dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) del suo co-fattore ASXL2. Questi saggi di ubiquitinazione/deubiquitinazione possono essere condotti nel contesto di nucleosomi ricombinanti ricostituiti con proteine purificate dai batteri o nucleosomi nativi purificati dalle cellule dei mammiferi. Mettiamo in evidenza la complessità che può avere un impatto significativo su queste reazioni e proponiamo che i principi generali di questi protocolli possano essere rapidamente adattati ad altri legamenti e deubiquitinasi E3.

Introduzione

L'ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un'ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L'ubiquitinazione consiste nell'attaccamento covalente dell'ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l'attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase¹^: ²^,³. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, c....