Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo privo di enzimi per isolare le cellule staminali mesenchymal da campioni di abdominoplastica e lipoaspirati utilizzando un metodo explant. L'assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione prevede cellule staminali clinicamente rilevanti che possono essere utilizzate per studi in vitro o trasferite di nuovo alla clinica.

Abstract

Le cellule staminali mesentali (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti che possono essere isolate da vari tessuti adulti e fetali, tra cui il tessuto adiposo. Come tipo di cellula clinicamente rilevante, sono necessari metodi ottimali per isolare ed espandere queste cellule in vitro. La maggior parte dei metodi per isolare le MSC derivate da adipose (ADSC) si basano su enzimi duri, come il collagenasi, per digerire il tessuto adiposo. Tuttavia, sebbene efficaci nell'abbattere il tessuto adiposo e produrre un elevato recupero ad SPSC, questi enzimi sono costosi e possono avere effetti negativi sugli ADSC, compresi i rischi derivanti dall'utilizzo di componenti xenogenei nelle applicazioni cliniche. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per isolare gli ADSC da campioni di lipoaspirate e abdominoplastica freschi senza enzimi. In breve, questo metodo si basa sulla dissociazione meccanica di qualsiasi tessuto sfuso seguita da un sistema di coltura di tipo explant. Gli ADSC sono autorizzati a migrare fuori dai tessuti e sulla piastra di coltura dei tessuti, dopo di che gli ADSC possono essere coltivati ed espansi in vitro per un numero qualsiasi di ricerche e/o applicazioni cliniche.

Introduzione

Le cellule staminali mesentali (MSC) sono una classe di cellule staminali adulte multipotenti che possono essere isolate da vari tessuti adulti e fetali, anche dal tessuto adiposo. Queste cellule sono un tipo di cellula attraente sia per la ricerca di base che per le applicazioni cliniche a causa della loro plasticità per differenziarsi in cellule di tutti gli strati germinali in vitro, barriere allogeneche incrociate, sede di aree di infiammazione, e sopprimere l'infiammazione (rivisto in Sherman, et al.¹). Le MSC derivate da Adipose (ASC) sono particolarmente interessanti a causa della loro facilità di ottenimento, poiché il tessuto adiposo è generalmente considerato tessuto di scarto a seguito di procedure di liposuzione e di abdominoplastica. Tuttavia, una volta ottenuti, i campioni sono generalmente sottoposti a condizioni difficili – condizione ezimatica o centrifugazione – al fine di isolare gli ASC^2,3. Questo metodo illustra una semplice procedura per isolare gli ASC utilizzando un metodo espianto, in assenza di dure fasi enzimiche o centrifugation.

Il metodo più comune per isolare gli ASC consiste nel lavare un campione adiposo, digerire enzymaticamente il campione con il collagene, centrifugare il campione e infine liscificare i globuli rossi prima di coltivare gli ASC⁴. Sebbene efficiente nell'isolare un'elevata resa degli ASC, l'uso di componenti xenogenei (ad esempio, la digestione enzimatica con il collagene) è considerato più che "minimamente manipolato" dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti e può comportare rischi come la reazione immunitaria, vietando l'uso delle cellule nella clinica^5,6. Per ridurre al minimo i rischi dei componenti xenogenei, molti gruppi hanno suggerito enzimi non derivati dagli animali e fabbricati per digerire il tessuto adiposo. Tuttavia, questi enzimi sono ancora duri e possono alterare il fenotipo cellulare⁷.

Altri metodi di isolamento degli ASC includono la centrifugazione ad alta velocità, l'utilizzo di forze fino a 1.200 x ge il vortice per isolare gli ASC⁸. Anche le forze a partire da 400 x g erano sufficienti per isolare gli ASC vitali⁹. Mentre queste cellule producono una grande quantità di cellule vitali, molti protocolli non sono riusciti a proliferare oltre 14 giorni⁸. Inoltre, l'isolamento meccanico produce meno cellule recuperate rispetto alla digestione enzimatica, ma una percentuale più elevata di cellule isolate erano ASC rispetto ad altre cellule endogene al tessuto adiposo al passaggio 0¹⁰.

L'isolamento di una popolazione più pura e sostenibile di ASC in meno tempo, insieme al costo e ai rischi dei componenti xenogenei, rende sempre meno attraente la digestione enzimatica per la traduzione in clinica. Mentre l'isolamento meccanico è inizialmente un approccio favorevole, c'è una disparità significativa nei metodi utilizzati e il volume dei tessuti elaborati è limitato alle dimensioni delle unità centrifughe specializzate e può dipendere dalla coerenza^{dell'operatore 2}.

Mentre sia la digestione ezimatica che la centrifugazione producono rapidamente un alto volume di ASC, queste cellule isolate mostrano cambiamenti fenotipici, cedendo domande sul loro comportamento quando vengono restituite a un paziente². Un metodo basato sull'isolamento ASC basato sull'espianto, come descritto nel presente protocollo, viene quindi impiegato da alcuni gruppi, in base al quale gli ASC migrano da piccoli pezzi di tessuto adiposo solido^3,11,12. Questa migrazione è probabilmente un effetto delle cellule attratte dai ricchi media nutritivi. Come altre popolazioni di MSC, ASC aderiscono alla plastica, e sopravvivono e proliferano nel supporto di coltura dei tessuti usati (componenti sotto), permettendo il loro isolamento dagli altri tipi di cellule dal tessuto adiposo. Mentre vengono inizialmente recuperate meno cellule - che spesso impiegano > 1 settimana fino a quando le cellule non sono visibili sulla piastra di coltura dei tessuti - questi ASC non manipolati prolifereranno in vitro, permettendo l'espansione delle cellule a volumi clinicamente rilevanti^11,12,13.

Protocollo

L'uso di campioni di lipoaspirate e abdominoplastica è stato approvato da The Institutional Review Board (IRB) della Rutgers University - Newark Campus.

1. Preparazione dei mezzi di comunicazione per la cultura dei tessuti

1. Preparare sterilmente 500 mL di supporti per la coltura tissutale prima di isolare gli ASC. Per preparare i mezzi di coltura, aggiungere il 10% definito siero di vitello fetale (FCS) e Penicillin-Streptomycin (10.000 U/100 mL) ai mezzi essenziali minimi di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio e 2 mM di L-glutamine. Il supporto può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 settimane e deve essere sempre utilizzato caldo (tra temperatura ambiente a 37 gradi centigradi).
   1. Se si preferisce un supporto diverso per la coltura delle cellule staminali, preparare invece tale supporto.

2. Isolamento degli ASC dal tessuto adiposo

1. Ottenere lipoasti o campioni di abdominoplastica. Dopo l'approvazione dell'IRB, ottenere tali campioni come il tessuto di scarto a seguito di varie procedure chirurgiche. Trasportare le lipoaspirari al laboratorio in qualsiasi vaso il chirurgo ha rimosso il tessuto; trasporto di adominoplastica in un sacchetto o contenitore della sala operatoria.
2. Conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 6 h o a 4 gradi centigradi per un massimo di 24 h se non vengono esposti immediatamente. I campioni di tessuto elaborati oltre i tempi summenzionati avranno probabilmente una diminuzione della resa cellulare. Mantenere i campioni di abdominoplastica umidi con l'aggiunta di 1x sterile fosfato bufferizzato salina.
3. Da questo punto in poi, condurre tutti i passaggi in una cappa flusso laminare in condizioni asettiche. Indossare guanti per la protezione personale. Mantenere 10% candeggina, 70% etanolo, e asciugamani di carta nelle vicinanze per pulire rapidamente eventuali fuoriuscite biologiche. Smaltito qualsiasi tessuto in eccesso come rifiuti biomedici.
4. Mitrare i campioni in pezzi < 1 mm. Se il blocco di abdominoplastica è troppo grande per lavorare, tagliare una dimensione gestibile del tessuto fuori del blocco prima di mincing. Trasferire il tessuto di addominoplastica sul coperchio di una piastra sterile da 100 mm. Utilizzare un ago sterile per tenere un pezzo di tessuto in posizione e utilizzare un bisturi sterile per tritare i pezzi tagliando o triturando delicatamente il tessuto sfuso.
   1. Questo passaggio non è generalmente necessario per i lipoaspirati. Tuttavia, se si osservano grandi blocchi di tessuto nel lipoaspirato, rimuovere tali blocchi con pinze sterili e il processo come sopra.
5. Trasferire il tessuto in un tubo fresco e invertire o scuotere il campione 5-6 volte per garantire la miscelazione di tutti gli strati. Facoltativo: se il lipoaspirate si è completamente depositato, rimuovere e scartare lo strato di olio prima della miscelazione.
6. Trasferire 2,5-5 mL di tessuto in una piastra di coltura tissutale trattata a gas sottovuoto da 100 mm (Tabella dei materiali). Misurare il volume del campione versando in un tubo di centrifuga fresco. Se necessario, utilizzare una spatola sterile per assistere con il trasferimento del tessuto.
7. Aggiungere un volume equivalente di supporti di coltura tissutale alla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto.
8. Incubare le pacche a 37 gradi centigradi nel 5% di CO₂ fino a quando non si vede un numero sufficiente di cellule sulla base della piastra. Nel corso del tempo, le cellule migreranno dall'interno del tessuto sulla superficie della piastra, a quel punto aderiscono alla plastica. Quando escono dal tessuto, le cellule appariranno come piccoli ammassi intorno ai pezzi di tessuto.
9. Ogni 24 h, rimuovere il più fluido possibile e sostituire con una quantità simile di supporti. Lasciare i pezzi di tessuto in posizione, se possibile.
10. Una volta che un numero sufficiente di cellule sono annotate sulla piastra (>10 ammassi di > 15-25 cellule sulla piastra) o dopo 7 giorni, a seconda di quale sia prima, rimuovere tutti i pezzi di tessuto rimanenti.
11. Coltura gli ASC in mezzi di coltura tissutale fino a raggiungere 70% confluenza o fino a quando i cluster diventano densi (>5 ammassi densi di cellule sulla piastra, ciascuno con un diametro di circa > 500 m), a quel punto le cellule devono essere passaggi.

3 Cultura degli ASC

1. Passare gli ASC quando la piastra madre raggiunge circa il 70% di confluenza. Fare attenzione a evitare la confluenza eccessiva delle culture ASC.
2. Sciacquare delicatamente la piastra con 1x fosfato tamponata salina e provare a fare in modo che le cellule aderenti. Per sofinizzare le cellule, aspirare la salina tamponata di fosfato e aggiungere 1 mL di Trypsin con 0,25% EDTA ad ogni piastra e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Dopo 5 min, confermare la decoerenza mediante microscopia. Se le cellule sono ancora aderenti, riportare le cellule all'incubatrice per altri 5 min.
3. Aggiungere una piccola quantità di supporti (circa il 25% del volume totale di prova) alla piastra per disattivare la trypsin e lavare delicatamente la base della piastra utilizzando il supporto/trypsin. Per lavare la piastra, tenere la piastra con una leggera angolazione e pipettare delicatamente il supporto / trypsin dalla parte superiore della piastra verso il basso, allentando tutte le celle settimanali attaccate dalla piastra. Le cellule possono essere ri-placcate a un rapporto 1:3 o semiate ad una densità di 120.000-500.000 cellule per piastra.
   1. Se la semina in base al numero di cellule, trasferire la trypsin/media dalla piastra in un tubo di centrifuga conico e pellet le cellule per centrifugazione a 300 x g per 7 min. Risoglino le cellule nei mezzi di coltura dei tessuti (circa 1 mL per piastra iniziale) e contano le cellule prima della semina. Per contare le celle, trasferire 10 oL della sospensione cellulare nell'emocitometro e contare le celle presenti nel quadrante 4 x 4 in ogni angolo della griglia. Calcolare questi valori insieme e moltiplicare il valore per 10⁴ per calcolare il numero di cella.
   2. Aggiungere supporti alla piastra prima di eseguire il seeding delle celle. Aggiungere le celle in modo dropwise e quindi girare la piastra per garantire una distribuzione uniforme attraverso la piastra.
      NOTA: Dopo 3 passaggi, le cellule aderenti dovrebbero apparire asimmetriche e a forma di mandrino. Fenotipo e comportamento ASC possono essere confermati utilizzando la citometria di flusso e i saggi di differenziazione.
4. Conferma del fenotipo ASC e del comportamento utilizzando la citometria di flusso e i saggi di differenziazione
   1. Citometria di flusso
      1. Raccogliere e pellet le cellule come descritto sopra. Lavare il pallocò con 1x fosfato tampone salina ed etichettare le cellule con i volumi raccomandati dal produttore di anticorpi. Un protocollo dettagliato per la citometria di flusso, una procedura di laboratorio comune, può essere trovato qui^12,14,15.
      2. Selezionare i pannelli marcatori di superficie tra i seguenti per confermare il fenotipo ASC: negativo per CD14, CD31, CD34, CD45 e CD106; e positivo per CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 e CD105^16,17,18,19. La presenza di CD36 e l'assenza di CD106 discerneno gli ABC dai MSC²⁰derivati dal midollo osseo.
   2. Assaggi di differenziazione: Confermare la differenziazione multilinea utilizzando un kit di differenziazione MSC. Sono disponibili kit di più produttori per confermare la capacità di differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica. Cambiare il supporto fornito dal kit ogni 3-4 giorni in base ai protocolli del produttore per 3 settimane o fino a quando non viene osservata la differenziazione morfologica.
5. Coltura le cellule per passaggi multipli; il numero di passaggi necessari dipenderà dall'applicazione o dalle applicazioni. Ad ogni passaggio, confermare la morfologia e il fenotipo delle cellule MSC utilizzando i suddetti marcatori di superficie cellulare e garantire che la capacità di differenziazione multilinea non sia stata persa. Mentre il potenziale di espansione differisce tra i donatori, la maggior parte dei campioni può essere espansa per un massimo di 6-9 passaggi.
6. Crioconservare le cellule e conservarle in azoto liquido per un uso futuro.

4 Crioconservazione degli ASC

1. Preparare 10 mL di soluzioni di congelamento A e B.
   1. Per la soluzione di congelamento A, aggiungere 20% FCS a DMEM con alto glucosio.
   2. Per la soluzione di congelamento B, aggiungere 20% FCS e 20% solfuro dimetile (DMSO) a DMEM con alto glucosio.
2. Pellet le cellule centrifugando a 300 x g per 5 min. Riutilizzare le cellule in un piccolo volume di soluzione di congelamento A e contare le cellule utilizzando un emocitometro come nel passo 3.3.1.
3. Calcolare il volume finale in cui le celle verranno risospese per raggiungere una concentrazione finale di celle di 500.000-1.000.000 di cellule/mL. Utilizzare la soluzione di congelamento A per risospendere il pellet nel 50% del volume finale. Aggiungere lentamente un volume uguale di soluzione di congelamento B dropwise mentre agitazione del tubo per raggiungere la concentrazione cellulare finale.
4. Congelare immediatamente le cellule in crioviali da 1-2 mL. Congelare i crioviali in un congelatore a tasso controllato o in un contenitore di congelamento posto a -80 gradi centigradi, che riduce la temperatura di 1 gradi centigradi/min. Dopo il congelamento controllato (durante la notte per un contenitore di congelamento), trasferire le cellule in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.

Risultati

Utilizzando il metodo qui descritto, gli ASC sono stati isolati con successo dai campioni di lipoaspira e abdominoplastica (Figura 1). Dopo tre passaggi, si è scoperto che le cellule isolate hanno una morfologia MSC (asimmetrica, forma del mandrino) e il fenotipo, simile agli ACC che seguono la digestione enzimatica (Figura 2). Studi precedenti del nostro gruppo e altri hanno dimostrato questi ASC per differenziarsi in adipociti, osteociti e neuroni come altri MSC, compresi gli ASC isolati con altri mezzi^11,21.

Nella maggior parte dei casi, la migrazione di ASCs sulla piastra di coltura dei tessuti può essere visualizzata entro 3-5 giorni mediante microscopia da campo luminoso. Tuttavia, in alcuni casi, solo le celle sparse saranno visibili dopo 7 giorni. In rari casi, le cellule non migreranno sulla piastra e/o non prolifereranno fino al terzo passaggio. Questo risultato è generalmente correlato a un ritardo nell'elaborazione del campione di tessuto.

Figura 1: Rappresentazione schematica dell'isolamento ASC da campioni di abdominoplastica e lipoaspirate. I campioni di abdominoplastica e lipoaspirate sono stati ottenuti come tessuto di scarto a seguito di procedure chirurgiche di routine. I campioni di abdominoplastica sono stati triturati, dopo di che i campioni di abdominoplastica o lipoasasificati sono stati placcati come espianti nei mezzi di coltura dei tessuti. Gli ASC migrarono fuori dal tessuto, verso i media ricchi di nutrienti. Dopo 1 settimana, gli espianti sono stati rimossi e gli ASC coltivati per la sperimentazione a valle e/o l'applicazione clinica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: ASC isolati con morfologia MSC e fenotipo. Gli ASC isolati dal metodo dell'espianto privo di enzimi hanno una morfologia MSC e un fenotipo al passaggio 3. (A) Come altri MSC, questi ASC hanno una forma asimmetrica del mandrino, isolata da espiante o da un metodo ezimatico (ad esempio, collagenasi). Gli ASC isolati utilizzando il metodo enzimatico producono una morfologia più lunga e stretta rispetto agli ASC isolati explant; questi ultimi assomigliano più vicini alle MSC derivate da altri metodi di isolamento privo di enzimi, come le MSC derivate dal midollo osseo (B) Come altri MSC, gli ASC isolati dell'espianto sono negativi per CD45 e positivi per CD73, CD90 e CD105. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Gli ASC sono una fonte attraente di MSC grazie al facile accesso del tessuto. Per le applicazioni cliniche e di ricerca, gli scienziati devono tenere presente la variabilità dei donatori quando isolano e coltivano queste cellule. Per ragioni ancora da chiarire, le MSC di diversi donatori mostrano diverse capacità di proliferare in vitro, che in seguito influenzeranno la migrazione dell'ASC dall'esposizione adiata e dalla capacità di proliferazione. Mentre la variabilità può essere osservata nel tempo necessario affinché gli ASC isolati da questi espianti privi di enzimi raggiungano la confluenza, era raro che un campione non proliferasse in vitro.

Oltre alla variabilità del donatore, la fonte più probabile di incapacità delle cellule di migrare fuori dal tessuto e/o proliferare in vitro è la durata del tempo in cui il tessuto è stato immagazzinato prima della lavorazione. Quando i campioni sono stati autorizzati a sedersi per >12 h prima della lavorazione o non sono stati tenuti umidi tra la raccolta e la lavorazione, sono stati osservati tassi di migrazione e proliferazione più poveri. Gli unici campioni che spesso non riescono a proliferare erano campioni di abdominoplastica che non sono stati mantenuti umidi con una soluzione salina: in questi casi, il tessuto al centro del blocco di tessuto era spesso abbastanza umido da essere processato, ma occasionalmente doveva essere scartato. È quindi fondamentale mantenere il tessuto umido dal momento del raccolto attraverso la lavorazione.

Nei casi in cui gli ASC non sono osservati sulla piastra al marchio di 1 settimana, gli esplants adiposi devono comunque essere rimossi dalle piastre di coltura dei tessuti per es. A volte ci sono troppo poche cellule per identificarsi facilmente, ma quelle poche cellule saranno in grado di espandersi all'interno del sistema di coltura. Se le cellule non sono ancora osservate a 3 settimane, l'isolamento deve essere considerato fallito.

In alcuni casi, in particolare di abdominoplastica, non è possibile ottenere un campione veramente asettico a causa delle limitazioni all'interno dell'arena chirurgica. Se non è possibile utilizzare un recipiente sterile per trasportare il tessuto dalla sala operatoria a un cofano a flusso laminare, la rimozione di 1 cm esterno del tessuto è generalmente sufficiente per prevenire la contaminazione da microrganismi. Se il campione di abdominoplastica è attaccato alla pelle, la pelle può essere asciugata con il 70% di etanolo per sterilizzare quella superficie prima di mincing il tessuto adiposo.

Durante il processo di macisino, è fondamentale che il tessuto sia macinato in piccoli pezzi fini. Se gli espianti sono troppo grandi, non ci sarà abbastanza superficie per gli ASC di migrare fuori dal tessuto e sulla piastra. Inoltre, è fondamentale che il tessuto non rimanga nella piastra più a lungo del necessario per esitare il necrotico.

Una limitazione di questo metodo è l'uso di un enzima (nel protocollo descritto, trypsin) per staccare gli ASC durante il processo di coltura dei tessuti. Altri enzimi derivati da non animali, come l'Accutase, possono essere sostituiti per eliminare la necessità di prodotti di origine animale, tuttavia, ciò aumenterà il costo della coltura dei tessuti. Per questo motivo, tra gli altri, numerosi gruppi stanno studiando metodi di coltura dei tessuti non bidimensionali come bioreattori e sistemi basati su scaffold per aumentare il potenziale di crescita di MSC riducendo al minimo la necessità di staccare le cellule dal loro substrato²².

Quando si spostano gli ASC nella clinica, una limitazione importante del metodo di isolamento degli espiantato è la dipendenza da una struttura di coltura dei tessuti a livello di buona pratica di produzione (GMP), che molti centri medici mancano. In questi casi, sarebbe necessario impiegare uno qualsiasi dei metodi basati su enzimi o centrifughe disponibili in commercio. Tuttavia, man mano che gli impianti GMP diventano più diffusi, questo effetto dovrebbe essere limitato. Nel frattempo, anche tali strutture prive di strutture di coltura tissutale GMP possono prendere in considerazione l'utilizzo del metodo explant per studiare gli ASC in vitro: meno manipolazioni, più simili queste cellule sono alle loro controparti in vivo¹¹.

Questo metodo fornisce un modo semplice per isolare gli ASC dal tessuto adiposo - sia lipoasti che abdominoplasties - in assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione. Mentre la resa iniziale degli ASC è inferiore a quella di altri metodi, gli ASC prolifereranno in vitro, riducendo al minimo l'effetto della resa iniziale inferiore. La mancanza di manipolazioni eccessive o incisive rende gli ASC isolati in modo così rilevante, poiché ci sono meno domande (cioè, se gli effetti osservati sono dovuti alle cellule stesse o alla manipolazione delle cellule durante il processo di isolamento ).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioreagenti Fisher con	dimetilsolfossido	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 piastre per colture tissutali	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	è testato in batch per garantire che supporti la crescita delle MSC
L-glutammina soluzione	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione di tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049