Articolo metodologico

Strategie non invasive per la manipolazione cronica dell'attività neuronale controllata da DREADD

DOI:

10.3791/59439

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25 agosto 2019

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1Section on Light and Circadian Rhythms (SLCR), National Institute of Mental Health, 2Howard Hughes Medical Institute, Department of Neuroscience, Scripps Research Institute

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo due metodi non invasivi per controllare cronicamente l'attività neuronale usando la chemiogenetica nei topi. Le gocce oculari sono state utilizzate per fornire ogni giorno clozapina-n-ossido (CNO). Descriviamo anche due metodi per una somministrazione prolungata di CNO nell'acqua potabile. Queste strategie per il controllo neuronale cronico richiedono un intervento minimo riducendo lo stress degli animali.

Abstract

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Le strategie chemiogenetiche sono emerse come strumenti affidabili per il controllo remoto dell'attività neuronale. Tra questi, i recettori dei progettisti attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADD) sono diventati l'approccio chemiogenetico più popolare utilizzato nelle neuroscienze moderne. La maggior parte degli studi fornisce il ligando clozapina-n-ossido (CNO) utilizzando una singola iniezione intraperitoneale, che è adatto per l'attivazione/inibizione acuta della popolazione neuronale mirata. Ci sono, tuttavia, solo alcuni esempi di strategie per la modulazione cronica dei neuroni controllati da DREADD, la maggior parte dei quali si basano sull'uso di sistemi di consegna che richiedono un intervento chirurgico. Qui, espandiamo su due strategie non invasive per fornire il Ligand CNO per manipolare cronicamente la popolazione neurale nei topi. Il CNO è stato somministrato sia utilizzando gocce oculari ripetitive (giornaliere), sia cronicamente attraverso l'acqua potabile dell'animale. Questi paradigmi non invasivi si traducono in una robusta attivazione dei recettori dei progettisti che persistevano in tutti i trattamenti CNO. I metodi qui descritti offrono alternative per il controllo mediato cronico danzico danzico dell'attività neuronale e possono essere utili per esperimenti progettati per valutare il comportamento in animali liberamente in movimento, concentrandosi su metodi di somministrazione CNO meno invasivi.

Introduzione

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I progressi tecnici nel campo delle neuroscienze hanno permesso agli scienziati di identificare e controllare con precisione l'attività di particolari popolazioni neuronali1. Questo ha contribuito a comprendere meglio la base dei circuiti neuronali e il loro impatto sul comportamento animale, così come, rivedendo i dogmi stabiliti2,3. Tra questi nuovi strumenti, le strategie optogenetiche e chemiogenetiche hanno avuto un profondo impatto non solo sulla qualità delle scoperte, ma anche sul modo in cui gli esperimenti sono concepiti e progettati4. Nel presente mano....

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Protocollo

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Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida dei comitati per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto Nazionale di Salute Mentale (NIMH). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il numero di animali utilizzati.

1. Iniezioni di virus associati ad Adeno nell'ippocampo

NOT: I topi maschi di tipo selvatico di sottofondo misto (B6/129 F1 ibrido, 3 mesi) erano per iniettati stereotassicamente con un AAV che codificava il recettore muscarinico M3 (hM3Dq) nell'ippocampo. Durante l'intero esperimento, i topi sono stati alloggiati in una sola casa, sot....

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Risultati

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Abbiamo osservato che la consegna ripetitiva di CNO mediante gocce oculari ha provocato una robusta induzione dell'espressione c-Fos nella maggior parte dei neuroni infetti (Figura1C), dimostrando che l'efficacia della consegna CNO è sostenuta durante l'esposizione ripetitiva. Inoltre, è stata osservata una significativa induzione di c-Fos nei campioni raccolti 2 h dopo il trattamento cNO, rispetto ai campioni ottenuti 6 h dopo l'esposizione al CNO (figura1D-E), dimostrando .......

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Discussione

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I DREADD sono emersi come un approccio popolare ed efficace per manipolare da remoto l'attività neuronale17. La progettazione di strategie alternative per la consegna di CNO aumenterà ampiamente lo spettro delle opzioni disponibili per specifiche impostazioni sperimentali. Inoltre, le strategie non invasive per la consegna di CNO riducono al minimo qualsiasi potenziale interpretazione errata dei risultati riducendo gli effetti collaterali negativi che possono avere un impatto diretto sulla salute .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale presso l'Istituto Nazionale di Salute Mentale (Istituto Nazionale di Salute Mentale). Ringraziamo il sostegno del NIMH IRP Rodent Behavioral Core(

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BSASigma life science#A2153-100GPolvere liofilizzata ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio)
Topi C57BL/6JThe Jackson laboratory#000664topi maschi, 3 mesi
CapillariDrummond Scientific Company#3-000-203-G/XDiametro esterno: 1,14 pollici
Clozapina-N-ossidoSigma#C08325 mg
ForaneBaxter#NDC 10019-360-60Isoflurano, USP
Microinjector IIIDrummond Scientific Company#3-000-207Nanoject III - Iniettore di nanolitri programmabile
Mezzi di montaggioInvitrogen#P36930Reagente antidissolvenza Prolong Gold
Microscopia elettronica ParaformaldeideSciences#15710Soluzione acquosa al 16% (senza metanolo), 10 mL
anticorpi c-Fos primariTecnologia di segnalazione cellulare#2250Sc-Fos (9F6) Corpo monoclonale di coniglio ( 100µ L)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherryUNC Vector CoreTitolo: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherryUNC Vector CoreTiter: ~3x10e12 vg/mL
Anticorpo secondarioInvitrogen#A21206Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100americanbio.com#AB02025-00100
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
  2. Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of dep....

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Controllo DREADDsomministrazione di CNOsomministrazione tramite colliriosomministrazione tramite acqua potabilemodulazione neuronale cronicaanalisi dell espressione di cFosmicroscopia confocale a fluorescenzachirurgia stereotassicainiezione di AAV nell ippocampo

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