L'imaging spettrale è diventata una soluzione affidabile per l'identificazione e la separazione di più segnali di fluorescenza in un singolo campione e può facilmente distinguere i segnali di interesse dallo sfondo o dall'autofluorescenza. L'imaging iperspettrale a scansione dell'eccitazione migliora questa tecnica diminuendo il tempo necessario di acquisizione dell'immagine aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore.
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Articolo metodologico
Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diverse tecniche si basano sul rilevamento di segnali di fluorescenza per identificare o studiare fenomeni o per chiarire le funzioni. La separazione di questi segnali di fluorescenza è stata dimostrata ingombrante fino all'avvento dell'imaging iperspettrale, in cui le fonti di fluorescenza possono essere separate l'una dall'altra, nonché dai segnali di fondo e dall'autofluorescenza (data la conoscenza del loro spettro spettrale firme). Tuttavia, l'imaging iperspettrale tradizionale a scansione delle emissioni soffre di tempi di acquisizione lenti e bassi rapporti segnale-rumore a causa del necessario filtraggio sia della luce di eccitazione che di emissione. È stato dimostrato in precedenza che l'imaging iperspettrale a scansione eccitazione riduce il tempo di acquisizione necessario aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore dei dati acquisiti. Utilizzando apparecchiature disponibili in commercio, questo protocollo descrive come assemblare, calibrare e utilizzare un sistema di microscopia di imaging iperspettrale a scansione di eccitazione per la separazione dei segnali provenienti da diverse sorgenti di fluorescenza in un singolo campione. Sebbene sia altamente applicabile all'imaging microscopico di cellule e tessuti, questa tecnica può essere utile anche per qualsiasi tipo di esperimento che utilizza la fluorescenza in cui è possibile variare le lunghezze d'onda di eccitazione, compresa ma non limitata a: imaging chimico, applicazioni ambientali, cure oculistiche, scienze alimentari, scienze forensi, scienze mediche e mineralogia.
Introduzione
L'imaging spettrale può essere eseguito in vari modi ed è indicato da diversi termini1,2,3,4. In generale, l'imaging spettrale si riferisce ai dati acquisiti in almeno due dimensioni spaziali e in una dimensione spettrale. L'imaging multispettrale e iperspettrale si distingue più spesso per il numero di bande di lunghezza d'onda o per il fatto che le bande spettrali siano contigue1. Per questa applicazione, i dati iperspettrali sono definiti come dati spettrali acquisiti con bande di lunghezza d'onda contigue ottenute....
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Protocollo
1. Configurazione del dispositivo
- Sorgente luminosa: selezionare una fonte di luce spettrale a banda larga con potenza elevata e collisione elevata (una lampada ad arco Xe da 300 W è stata utilizzata per questi studi).
- Otturatore (opzionale): aggiungere un otturatore al percorso ottico per ridurre il fotosbleaching per l'imaging time-lapse.
- Sistema di filtro regolabile: incorporare un gruppo di accordatura meccanica e un filtro regolabile a pellicola sottile (TFTF) impostato per consentire l'intervallo di eccitazione regolabile a lunghezza d'onda desiderato (ad esempio, 360-485 nm).
- Microscopio: utilizzare un microscopio a fluor....
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Risultati
Diversi passaggi importanti da questo protocollo sono necessari per garantire la raccolta di dati accurati e privi di artefatti di imaging e spettrali. Se si ignorano questi passaggi, è possibile che i dati che appaiono significativi ma non possano essere verificati o riprodotti con qualsiasi altro sistema di imaging spettrale, annullando in modo efficace tutte le conclusioni fatte con tali dati. Principale tra questi importanti passi è la corretta correzione dell'uscita spettrale (sezion.......
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Discussione
L'uso ottimale di un set-up di imaging iperspettrale a scansione eccitazione inizia con la costruzione del percorso luminoso. In particolare, la scelta della sorgente luminosa, i filtri (regolabili e dicroscopici), il metodo di commutazione dei filtri e la fotocamera determinano la gamma spettrale disponibile, la possibile velocità di scansione, la sensibilità del rivelatore e il campionamento spaziale. Le lampade ad arco Mercury offrono molti picchi di lunghezza d'onda di eccitazione, ma non forniscono un'uscita spettra.......
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Dichiarazioni
Drs. Leavesley e Rich rivelano interesse finanziario in una start-up, SpectraCyte LLC, fondata per commercializzare la tecnologia di imaging spettrale.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto di NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18334060163, e il Fondo Di Abraham Mitchell.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolato da tessuti polmonari umani ottenuti da NDRI | Cellule altamente autofluorescenti e sensibili al calcio |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Otturatore controllabile a distanza per ridurre al minimo il fotobleaching |
| Fase automatizzata Fase | scientifica precedente | H177P1T4 | Tavolino controllabile a distanza per la raccolta automatizzata di più campi visivi o di immagini unite. |
| Controllore di stadio automatizzato (XY) | Prior | Scientific Proscan III (H31XYZE-US) | Per l'interfacciamento di tavolino automatizzato con computer e joystick |
| Buffer | Prodotto internamente | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucosio, 1 mM MgCl2 e 1mM CaCl2, a pH 7,3 | |
| Camera cellulare | ThermoFisher Scientific | Attofluor, A7816 | Supporto per vetrino coprioggetti composto da acciaio inossidabile chirurgico e O-ring in gomma per sigillare i terreni e prevenire la contaminazione del campione e/o |
| dell'obiettivo Filtri di eccitazione | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Gamma di lunghezze d'onda centrali (340-378 nm), Larghezza di banda (minimo 16 nm, FWHM nominale 20 nm), Indice di rifrazione (1,88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Gamma di lunghezze d'onda centrali (360-400 nm), Larghezza di banda (minimo 16 nm, FWHM nominale 20 nm), Indice di rifrazione (1,8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Gamma di lunghezze d'onda centrali (400-448,8 nm), Larghezza di banda (minimo 15 nm, FWHM nominale 20 nm), Indice di rifrazione (1,8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Gamma di lunghezze d'onda centrali (448,8-501,5 nm), Larghezza di banda (minimo 15 nm, FWHM nominale 20 nm), Indice di rifrazione (1,84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Gamma di lunghezze d'onda centrali (501,5-561 nm), Larghezza di banda (minimo 14 nm, FWHM nominale 20 nm), Indice di rifrazione (1,83) | |
| Filtro a fluorescenza Cubo Dicroico Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separa la luce di eccitazione da quella di emissione a 495 nm (>98% di riflessione tra 350-488 nm, >93% di trasmissione tra 502-950 nm), Indice efficace del filtro (1,78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Consente il passaggio di luce più lunga di 496 nm ( >93% di trasmissione media tra 503,2-1100 nm), Indice di rifrazione (1,86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmide #22692 | Un indicatore di calcio geneticamente codificato a lunghezza d'onda singola basato su GCaMP2 |
| Sfera integrata | Ottica oceanica | FOIS-1 | Utilizzato per la misurazione accurata dell'illuminazione grandangolare |
| Microscopio a fluorescenza invertita | Nikon Instruments | TE2000 | I microscopi invertiti consentono l'eccitazione diretta del campione senza la necessità di penetrare strati di terreno e/o tessuto. |
| Mitotracker Verde FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Etichetta i mitocondri |
| Lampada di calibrazione tracciabile NIST | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | Una lampada con uno spettro noto per l'uso come fluoresceina tracciabile |
| NIST-standard | ThermoFisher Scientific | F36915 | Per verificare la risposta spettrale appropriata del sistema |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Etichetta i nuclei cellulari |
| Obiettivo (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Utile per ampi campi visivi |
| Obiettivo (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Più spesso utilizzato per campioni di tessuto |
| Obiettivo (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Più spesso utilizzato per campioni cellulari |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | Per l'acquisizione di immagini digitali ad alta sensibilità |
| Spettrometro Ocean Optics | QE65000 | Utilizzato per misurare l'uscita spettrale del sistema spettrale di eccitazione-scansione Commutatore | |
| filtro sintonizzabile | Strumento Sutter Lambda | VF-5 | Unità motorizzata per la sintonizzazione automatica del filtro di eccitazione/ Lampada ad arco allo xeno commutabile |
| Sunoptic Technologies | Sorgente luminosa Titan 300HP Sorgente | luminosa con uscita spettrale relativamente uniforme |
Riferimenti
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements an....
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Ristampe e permessi
