Vi presentiamo un protocollo per un saggio colorimetrico di attività di sinteassi citrate per la quantificazione della massa mitocondriale intatta negli omogenei del tessuto della Drosophila.
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Articolo metodologico
Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri svolgono i ruoli più importanti nel metabolismo cellulare producendo ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa e regolando una varietà di processi fisiologici. La disfunzione mitocondriale è una causa primaria di una serie di malattie metaboliche e neurodegenerative. I mitocondri intatti sono fondamentali per il loro corretto funzionamento. L'enzima citrato synthasi è localizzato nella matrice mitocondriale e quindi può essere utilizzato come un marcatore enzimatico quantitativo di massa mitocondriale intatta. Dato che molte molecole e percorsi che hanno importanti funzioni nei mitocondri sono altamente conservati tra gli esseri umani e la Drosophila, e che una serie di potenti strumenti genetici sono disponibili in Drosophila, la Drosophila serve come un buon sistema modello per studiare la funzione mitocondriale. Qui, presentiamo un protocollo per la misurazione rapida e semplice dell'attività di sintetazione della citrata nell'omogenea tissutale da mosche adulte senza isolare i mitocondri. Questo protocollo è adatto anche per misurare l'attività di sintetasi citrate in larve, cellule coltivate e tessuti mammiferi.
Introduzione
I mitocondri sono meglio conosciuti come gli organelle che producono energia nella maggior parte degli organismi eucarioti, che producono la valuta energetica, ATP, attraverso il ciclo dell'acido tricarboxylico (cioè il ciclo di Krebs) e il ciclo osofoso. I mitocondri si trovano anche a svolgere un ruolo importante in molti altri processi fisiologici, come la regolazione dell'apoptosi1, Ca 2 omeostasi2,3, specie reattiva di ossidazione (ROS) generazione4e reticolo endoplasmico (ER)-risposta di stress5. La disfunzione mitocondria....
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Protocollo
1. Colorimetric Citrate Synthase Activity Assay for D. melanogaster16
- Raccogli dieci mosche adulte per ogni campione. Raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo.
- Preparare 500 l di buffer di estrazione a freddo ghiaccio contenente 20 mHE HEPES (pH , 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 in una provetta da 1,5 mL per ogni campione.
- Anestesizza le mosche adulte con CO2 su un cuscinetto di anestesia e isola i tessuti desiderati. Per isolare il torasse del volo adulto, per esempio, fissare i diluvi di mosca da un paio di pinze, e quindi isolare l'addome di mosca tagliando lungo il bordo ....
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Risultati
La figura 1 presenta un esempio delle curve cinetiche per l'assorbimento OD a 412 nm nel tempo ottenute utilizzando il saggio colorimetrico dell'attività di citrate synthase per misurare i setgenati del tessuto toracico della Drosophila di diversi genotipi. È ben noto che il PGC-1 è un regolatore principale della biogenesi mitocondriale. Il PGC-1 è conservato funzionalmente tra la Drosophila e gli esseri umani. Drosophila RNF34 (dRN.......
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Discussione
Gli studi metabolici che utilizzano la Drosophila come modello devono prendere in considerazione il background genetico, la dieta e il mantenimento delle scorte delle mosche18. Per evitare gli effetti di diversi background genetici sulla misurazione dell'attività synthase citrato, diversi ceppi di Drosophila dovrebbero essere riincrociati al ceppo di controllo per 10 generazioni. Il background genetico di tutti i ceppi di Drosophila utilizzati nei nostri esperimenti è
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), della Science and Technology Commission del comune di Shanghai, del Programma Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e della Natural Science Foundation di Shanghai (19-R1446400).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil]etansolfonico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propandiolo (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Acido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pestello a pellet | Sangon | F619072 | |
| Motore a pestello a pellet | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Lettore di piastre | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit di analisi | Beyotime | P0010S | |
| Forbici | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Riferimenti
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
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Ristampe e permessi
