Vi presentiamo un protocollo per un saggio colorimetrico di attività di sinteassi citrate per la quantificazione della massa mitocondriale intatta negli omogenei del tessuto della Drosophila.
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Articolo metodologico
Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri svolgono i ruoli più importanti nel metabolismo cellulare producendo ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa e regolando una varietà di processi fisiologici. La disfunzione mitocondriale è una causa primaria di una serie di malattie metaboliche e neurodegenerative. I mitocondri intatti sono fondamentali per il loro corretto funzionamento. L'enzima citrato synthasi è localizzato nella matrice mitocondriale e quindi può essere utilizzato come un marcatore enzimatico quantitativo di massa mitocondriale intatta. Dato che molte molecole e percorsi che hanno importanti funzioni nei mitocondri sono altamente conservati tra gli esseri umani e la Drosophila, e che una serie di potenti strumenti genetici sono disponibili in Drosophila, la Drosophila serve come un buon sistema modello per studiare la funzione mitocondriale. Qui, presentiamo un protocollo per la misurazione rapida e semplice dell'attività di sintetazione della citrata nell'omogenea tissutale da mosche adulte senza isolare i mitocondri. Questo protocollo è adatto anche per misurare l'attività di sintetasi citrate in larve, cellule coltivate e tessuti mammiferi.
Introduzione
I mitocondri sono meglio conosciuti come gli organelle che producono energia nella maggior parte degli organismi eucarioti, che producono la valuta energetica, ATP, attraverso il ciclo dell'acido tricarboxylico (cioè il ciclo di Krebs) e il ciclo osofoso. I mitocondri si trovano anche a svolgere un ruolo importante in molti altri processi fisiologici, come la regolazione dell'apoptosi1, Ca 2 omeostasi2,3, specie reattiva di ossidazione (ROS) generazione4e reticolo endoplasmico (ER)-risposta di stress5. La disfunzione mitocondriale può colpire qualsiasi organo nel corpo a qualsiasi età ed è una causa primaria di metabolica, invecchiamento6e malattie neurodegenerative7. I mitocondri intatti sono meccanicamente correlati alla funzione mitocondriale. Pertanto, una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale8. Citrate synthase, un enzima che limita il tasso nella prima fase del ciclo di acido tricarboxylico9, è localizzato nella matrice mitocondriale all'interno delle cellule eucariotiche, e quindi può essere utilizzato come marcatore quantitativo per la presenza di massa mitocondriale intatta9,10. L'attività synthase citrato può anche essere utilizzata come fattore di normalizzazione per proteine mitocondriali intatte11,12.
La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un ottimo sistema modello per studiare la funzione mitocondriale, come molte molecole e percorsi che svolgono ruoli fondamentali nei mitocondri sono evolutivamente conservati dalla Drosophila agli esseri umani13,14,15. Qui, presentiamo un protocollo per un metodo semplice e veloce per la misurazione dell'attività di sinteassi citrati da un saggio colorimetrico in omogenato del tessuto della Drosophila 16 in un formato 96 beh piastra. Nel saggio di attività di sintetzia citrato, citrato synthase nel tessuto di Drosophila omogenato cala la reazione di osaloaceta con coenzima acetil A (acetyl CoA) per formare il citrate CoA-SH e H. CoA-SH reagisce successivamente con 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) per generare un prodotto colorato, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), che può essere facilmente misurato spettrometricamente a 412 nm. L'attività synthasi citrata può essere riflessa dal tasso di produzione del colore.
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Protocollo
1. Colorimetric Citrate Synthase Activity Assay for D. melanogaster16
- Raccogli dieci mosche adulte per ogni campione. Raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo.
- Preparare 500 l di buffer di estrazione a freddo ghiaccio contenente 20 mHE HEPES (pH , 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 in una provetta da 1,5 mL per ogni campione.
- Anestesizza le mosche adulte con CO2 su un cuscinetto di anestesia e isola i tessuti desiderati. Per isolare il torasse del volo adulto, per esempio, fissare i diluvi di mosca da un paio di pinze, e quindi isolare l'addome di mosca tagliando lungo il bordo del torace e dell'addome utilizzando un paio di forbici. Raccogliere i thoraxes mosca per il muscolo citrato synthase attività saggio.
NOTA: Determinare il peso fresco del tessuto in questo passaggio se lo si utilizza per normalizzare l'attività di synthase citrato. - Trasferire immediatamente 10 dilaghi di mosca adulti a 100 -L di tampone di estrazione ghiacciata e omogeneizzare con un pestello sul ghiaccio. Per mantenere i campioni ghiacciati, omogeneizzare i campioni per 5-10 s sul ghiaccio, quindi avere i campioni sedersi sul ghiaccio per 5 s, e ripetere fino a quando tutti i tessuti nel tubo sono omogeneizzati completamente.
NOTA: Nastro il tubo, controllare gli omogenei per assicurarsi che non ci siano coaguli negli omogenei e che i tessuti nel tubo siano omogeneizzati completamente. Tutti i trattamenti campione devono essere eseguiti sul ghiaccio. - Prendete 10 l di ogni campione omogeneizzato in un nuovo tubo per la misurazione del contenuto proteico. Conservare i campioni per la misurazione delle proteine sul ghiaccio.
NOTA: I campioni di proteine possono essere congelati e conservati a -80 gradi centigradi per un'analisi successiva. Le concentrazioni proteiche servono come parametro interno per la normalizzazione delle attività di sintesi della citrata. - Aggiungere 400 l di tampone di estrazione a freddo ghiaccio ad ogni campione rimanente per fare un volume totale di 500 .L. Mescolare bene pipetting su e giù per almeno 5x, evitando la formazione di bolle. Per ogni reazione, aggiungere 1 luna di lisata a cellule diluite a 150 luna della soluzione di reazione appena preparata (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM di acetyl CoA, 1 mM di acido oxaloacetico). Mescolare accuratamente e immediatamente pipettando delicatamente, evitando la formazione di bolle. Misurare l'assorbimento a 412 nm ogni 10-30 s per 4 min a 25 gradi centigradi utilizzando un lettore di lamiere in grado di misurare l'assorbimento a 412 nm a intervalli minimi di 10 s.
NOTA: Modificare la punta prima di pipettare un reagente diverso ed evitare di formare bolle nei pozzetti. La miscelazione incompleta dei reagenti può causare variazioni nelle misurazioni. Il saggio di attività di sintease citrato deve essere fatto a temperatura ambiente immediatamente dopo che i campioni sono raccolti, come questo saggio viene utilizzato per quantificare intatta massa mitocondriale. Il buffer di reazione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso e non deve essere memorizzato. - Tracciare i dati come assorbimento della densità ottica (OD) (abs) (asse Y) rispetto al tempo (in minuti) (asse X). Quindi calcolare la pendenza per la porzione lineare della curva, dove il tasso di reazione è
Dividere il valore per la concentrazione di proteine campione per normalizzare l'attività di sintesi della citrata. L'attività di sintetismo citrato è calcolata come
NOTA: La concentrazione di proteine del campione può essere misurata con un kit di analisi della concentrazione di proteine.
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Risultati
La figura 1 presenta un esempio delle curve cinetiche per l'assorbimento OD a 412 nm nel tempo ottenute utilizzando il saggio colorimetrico dell'attività di citrate synthase per misurare i setgenati del tessuto toracico della Drosophila di diversi genotipi. È ben noto che il PGC-1 è un regolatore principale della biogenesi mitocondriale. Il PGC-1 è conservato funzionalmente tra la Drosophila e gli esseri umani. Drosophila RNF34 (dRN...
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Discussione
Gli studi metabolici che utilizzano la Drosophila come modello devono prendere in considerazione il background genetico, la dieta e il mantenimento delle scorte delle mosche18. Per evitare gli effetti di diversi background genetici sulla misurazione dell'attività synthase citrato, diversi ceppi di Drosophila dovrebbero essere riincrociati al ceppo di controllo per 10 generazioni. Il background genetico di tutti i ceppi di Drosophila utilizzati nei nostri esperimenti è
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), della Science and Technology Commission del comune di Shanghai, del Programma Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e della Natural Science Foundation di Shanghai (19-R1446400).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil]etansolfonico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propandiolo (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Acido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pestello a pellet | Sangon | F619072 | |
| Motore a pestello a pellet | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Lettore di piastre | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit di analisi | Beyotime | P0010S | |
| Forbici | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
