Istituzione e caratterizzazione di tre linee cellulari adenocarcinoma polmonare resistente agli Agrassiinib sviluppate con l'aumento delle dosi di Afatinib

Sommario

È stato sviluppato un metodo per stabilire linee cellulari aresistenza ai grassiinib da cellule adenocarcinoma polmonari PC-9, e sono state caratterizzate cellule resistenti. Le cellule resistenti possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza dell'inibitore della cinesi del fattore di crescita epidermico, applicabili per i pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule.

Abstract

La resistenza acquisita agli inibitori molecolari è un grave problema nella terapia del cancro. Il cancro del polmone rimane la principale causa di morte per cancro nella maggior parte dei paesi. La scoperta di "mutazioni del driver oncogeniche", come il recettore del fattore di crescita epidermico(EGFR) e il successivo sviluppo di agenti molecolari mirati della licinesi (TCI) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, e osimertinib) hanno drammaticamente alterato il trattamento del cancro ai polmoni negli ultimi decenni. Tuttavia, questi farmaci non sono ancora efficaci nei pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole (NSCLC) che trasportano mutazioni attivanti EGFR. A seguito della resistenza acquisita, la progressione sistemica della NSCLC rimane un ostacolo significativo nel trattamento dei pazienti con NSCLC positivo alla mutazione EGFR. Qui, presentiamo un metodo di escalation delle dosi graduale per stabilire tre linee cellulari agrassinib agrassiinib acquisite in modo indipendente da cellule NSCLC PC-9 che ospitano mutazioni di commutazione di coppie di 15 basi in EGFR esoni 19. Vengono brevemente presentati metodi per caratterizzare le tre linee cellulari indipendenti aresistenza agrassiinib. I meccanismi di resistenza acquisiti alle EGFR TCI sono eterogenei. Pertanto, devono essere esaminate più linee cellulari con resistenza acquisita agli EGFR-TCI. Da dieci a dodici mesi sono necessari per ottenere linee cellulari con resistenza acquisita utilizzando questo approccio di escalation della dose stepwise. La scoperta di nuovi meccanismi di resistenza acquisiti contribuirà allo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci e sicure.

Introduzione

Cinque inibitori della kinasi tirosina, mirati al recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tra cui gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib sono attualmente disponibili per il trattamento di pazienti con cancro (NSCLC). Negli ultimi dieci anni, le terapie per tali pazienti hanno subito uno sviluppo drammatico con la scoperta di nuovi potenziali EGFR-TMI. Tra i pazienti con adenocarcinoma polmonare, le mutazioni somatiche nell'EGFR sono identificate in circa il 50% dei pazienti asiatici e il 15% dei pazienti caucasici¹. Le mutazioni più comuni in EGFR sono una mutazione punto L858R in EGFR exon 21 e 15 copp....

Protocollo

1. Creazione di tre linee cellulari indipendente resistente agli agrassiinib PC-9

1. Determinazione della concentrazione iniziale di esposizione agrassinib per le cellule PC-9 utilizzando il saggio 3-(4,5-dithlthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromuro (MTT)
   1. Coltura PC-9 cellule nel mezzo di crescita contenente siero bovino fetale (10%), penicillina (100 U/mL), e streptomicina (100 g/mL) in una coltura cellulare trattata 10 cm piatto in un 5% DI CO₂ incubatore a 37 .
   2. Risospendere le cellule PC-9 a 4 x 10⁴ celle/mL nel mezzo di crescita e poi seme a 50 .l/well in una micropiastra da 96 pozze. La con....

Risultati

Lo schema per stabilire tre linee cellulari aresistenza agrassiinib da cellule PC-9 utilizzando una procedura di dose-escalation passo a passo è illustrato nella Figura 1. La figura 2 mostra una diminuzione della proliferazione cellulare delle cellule parentali del PC-9 con l'aumento della concentrazione di agrassinib, indicando che le cellule PC-9 sono sensibili all'esposizione agrassinib. La figura 3

Discussione

Qui, abbiamo descritto un metodo per stabilire tre linee cellulari indipendenti resistenti agli agrassinib e abbiamo caratterizzato queste cellule rispetto alle cellule parentali del PC-9. Con l'esposizione all'escalation della dose graduale, le cellule parentali di PC-9 hanno acquisito resistenza all'afatinib per un periodo di 10-12 mesi. Clinicamente, i meccanismi di resistenza ai TCI EGFR sono eterogenei, e quindi, dopo il trattamento iniziale con afatinib, le cellule PC-9 sono state suddivise in tre piatti p100 indip.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
afatinib		Selleck S1011
anti-EGFR anti-EGFR anticorpo monoclonale	di segnalazione cellulare	4267S
saggio dell'acido bicinchoninico	sigma	B9643
trattato con coltura cellulare piatto da 10 cm	Violamo	2-8590-03
CELL BANKER1	TakaRa	CB011	terreno di crioconservazione
CellTiter 96	Promega	G4100	Saggio di proliferazione cellulare non radioattiva; Soluzione colorante e soluzione di solubilizzazione/arresto
DMSO	Wako	043-07216
Soluzione ECL	Perkin Elmer	NEL105001EA
FBS	gibco	26140-079
GeneAmp 5700	Applied Biosystems		Sistema di rilevamento RT-PCR basato sulla fluorescenza
Software GraphPad Prism v.7	GraphPad, Inc.		un software statistico
Spettrofotometro NanoDrop Lite	Termo		spettrofotometro
di segnalazione delle cellule	latte secco sgrassato	9999S
Pen	Strep gibco	15140-163
cocktail di inibitori della fosfatasi 2	sigma	P5726
cocktail di inibitori della fosfatasi 3	sigma	P0044
Lettore di micropiastre Powerscan HT	BioTek
Potenza SYBR Mix master verde	Applied Biosystems		SYBR Green master mix
inibitore della proteasi cocktail	sigma	P8340
QIAamp DNA Mini kit	Qiagen	51306	Kit di purificazione del DNA
QIAquick Kit di purificazione PCR	QIAGEN
RPMI-1640	Wako	189-02025	con L-Glutammina e Rosso Fenolo
TBST in polvere	sigma	T9039
Trans-Blot SD Cella di trasferimento elettroforetica semi-secca	Bio-Rad		Apparecchio semi-secco t4ransfer
Micropiastra a 96 pozzetti	Thermo	130188