Articolo metodologico

Istituzione e caratterizzazione di tre linee cellulari adenocarcinoma polmonare resistente agli Agrassiinib sviluppate con l'aumento delle dosi di Afatinib

DOI:

10.3791/59473

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26 giugno 2019

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1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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È stato sviluppato un metodo per stabilire linee cellulari aresistenza ai grassiinib da cellule adenocarcinoma polmonari PC-9, e sono state caratterizzate cellule resistenti. Le cellule resistenti possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza dell'inibitore della cinesi del fattore di crescita epidermico, applicabili per i pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule.

Abstract

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La resistenza acquisita agli inibitori molecolari è un grave problema nella terapia del cancro. Il cancro del polmone rimane la principale causa di morte per cancro nella maggior parte dei paesi. La scoperta di "mutazioni del driver oncogeniche", come il recettore del fattore di crescita epidermico(EGFR) e il successivo sviluppo di agenti molecolari mirati della licinesi (TCI) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, e osimertinib) hanno drammaticamente alterato il trattamento del cancro ai polmoni negli ultimi decenni. Tuttavia, questi farmaci non sono ancora efficaci nei pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole (NSCLC) che trasportano mutazioni attivanti EGFR. A seguito della resistenza acquisita, la progressione sistemica della NSCLC rimane un ostacolo significativo nel trattamento dei pazienti con NSCLC positivo alla mutazione EGFR. Qui, presentiamo un metodo di escalation delle dosi graduale per stabilire tre linee cellulari agrassinib agrassiinib acquisite in modo indipendente da cellule NSCLC PC-9 che ospitano mutazioni di commutazione di coppie di 15 basi in EGFR esoni 19. Vengono brevemente presentati metodi per caratterizzare le tre linee cellulari indipendenti aresistenza agrassiinib. I meccanismi di resistenza acquisiti alle EGFR TCI sono eterogenei. Pertanto, devono essere esaminate più linee cellulari con resistenza acquisita agli EGFR-TCI. Da dieci a dodici mesi sono necessari per ottenere linee cellulari con resistenza acquisita utilizzando questo approccio di escalation della dose stepwise. La scoperta di nuovi meccanismi di resistenza acquisiti contribuirà allo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci e sicure.

Introduzione

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Cinque inibitori della kinasi tirosina, mirati al recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tra cui gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib sono attualmente disponibili per il trattamento di pazienti con cancro (NSCLC). Negli ultimi dieci anni, le terapie per tali pazienti hanno subito uno sviluppo drammatico con la scoperta di nuovi potenziali EGFR-TMI. Tra i pazienti con adenocarcinoma polmonare, le mutazioni somatiche nell'EGFR sono identificate in circa il 50% dei pazienti asiatici e il 15% dei pazienti caucasici1. Le mutazioni più comuni in EGFR sono una mutazione punto L858R in EGFR exon 21 e 15 coppie di base (bp) delezioni in EGFR exon 192. Nei pazienti eGFR con NSCLC, gli EGFR-TMI migliorano i tassi di risposta e gli esiti clinici rispetto al precedente standard di chemioterapia del doppietto di platino3.

Gefitinib e erlotinib sono stati i primi inibitori di piccole molecole approvati e sono generalmente indicati come TCI EGFR di prima generazione. Questi EGFR TKIs bloccano l'attività della chinasi della tirosina competendo con ATP e legandosi reversibilmente ai siti di legame ATP4. Afatinib è un EGFR TKI di seconda generazione che si lega in modo irreversibile e covalente al dominio della chinasi tirosina di EGFR ed è caratterizzato come un inibitore della famiglia EGFR pan-umano5.

Nonostante il vantaggio drammatico di queste terapie nei pazienti con NSCLC, la resistenza acquisita è inevitabile. Il meccanismo di resistenza più comune contro i TCI EGFR di prima e seconda generazione è l'emergere della mutazione T790M in EGFR exon 20, che è presente nel 50-70% dei campioni di tumore6,7,8. Altri meccanismi di resistenza includono segnali di bypass (a MET, IGF1R, e HER2), trasformazione in carcinoma polmonare a piccole cellule, e l'induzione di transizione epiteliale-mesenchymal, che si verificano pre-clinicamente e clinicamente9. I meccanismi di resistenza alle EGFR TCI sono eterogenei. Identificando nuovi meccanismi di resistenza negli studi preclinici, potrebbe essere possibile sviluppare nuove terapie per superare la resistenza. Le terapie di sequenza ottimali che massimizzano il beneficio clinico per i pazienti devono considerare i meccanismi di resistenza e l'obiettivo terapeutico.

È imperativo scegliere la giusta linea cellulare dei genitori, in quanto è la base di tutti gli esperimenti successivi. Le strategie di selezione iniziano con rilevanza clinica; è necessario scegliere una linea cellulare chemioterapia e radioattiva. Il precedente trattamento chemioterapico e/o radiativo può indurre l'alterazione delle vie di resistenza e cambiamenti dell'espressione dei marcatori di resistenza ai farmaci. In questo studio, le cellule PC-9, che trasportano 15 bp delezioni in EGFR exon 19, sono impiegate per l'istituzione di resistenza acquisita all'afatinib. Questa linea cellulare è stata derivata da un paziente NSCLC giapponese, che non ha ricevuto chemioterapia e radiazioni precedenti.

Poiché afatinib viene somministrato per via orale su base giornaliera, il trattamento continuo in vitro, in cui le cellule vengono coltivate costantemente in presenza di afatinib sarebbe clinicamente rilevante. La dose di droghe utilizzate nelle varie fasi dell'esperimento deve essere ottimizzata per la linea cellulare dei genitori selezionata. Un saggio di citotossicità può essere utilizzato per determinare una gamma di farmaci adatti, che dovrebbe essere paragonabile alle informazioni farmacocinetiche del farmaco.

Durante tutto il processo di selezione, l'intera popolazione di cellule viene mantenuta come un unico gruppo; la clonazione o altri metodi di separazione non vengono utilizzati. Le cellule sono prima continuamente esposte a un basso livello del farmaco. Successivamente, dopo che le cellule si adattano a crescere in presenza del farmaco, la dose del farmaco viene lentamente aumentata alla dose ottimale finale del farmaco10,11. In alternativa, un impulso farmaco-somministrazione o mutagenesi può essere utilizzato per la selezione di cellule di resistenza, che vengono eseguite anche prima del trattamento farmacologico 12,13. Purtroppo, i casi in cui la resistenza ai farmaci non si sviluppa sono generalmente segnalati. Le strategie di selezione sono sviluppate con l'obiettivo di cercare di imitare le condizioni dei pazienti oncologici per ricostruire la resistenza clinicamente rilevante. A volte, per identificare i cambiamenti molecolari associati ai meccanismi di resistenza ai farmaci, viene utilizzata un'alta concentrazione di farmaci. Questo modello diventa meno clinicamente rilevante.

Qui, descriviamo un metodo per stabilire tre linee cellulari indipendenti resistenti agli agrassinib da cellule PC-9 che ospitano 15 bp delezioni in EGFR exon 19, nonché la caratterizzazione iniziale delle linee cellulari resistenti agli agrassiinib.

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Protocollo

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1. Creazione di tre linee cellulari indipendente resistente agli agrassiinib PC-9

  1. Determinazione della concentrazione iniziale di esposizione agrassinib per le cellule PC-9 utilizzando il saggio 3-(4,5-dithlthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromuro (MTT)
    1. Coltura PC-9 cellule nel mezzo di crescita contenente siero bovino fetale (10%), penicillina (100 U/mL), e streptomicina (100 g/mL) in una coltura cellulare trattata 10 cm piatto in un 5% DI CO2 incubatore a 37 .
    2. Risospendere le cellule PC-9 a 4 x 104 celle/mL nel mezzo di crescita e poi seme a 50 .l/well in una micropiastra da 96 pozze. La concentrazione finale delle cellule è 2,0 x 103 cellule/50 - L/po. Incubare pernottamento in un incubatore di CO2 del 5% a 37gradi centigradi.
    3. Aggiungere 50 l di soluzione agrassinib a diverse concentrazioni: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20M ai pozze contenenti il mezzo di crescita (50 . Il volume finale e le concentrazioni di afatinib sono rispettivamente di 100 , L e 0, 0,001, 0,01, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10M.
    4. Incubare la piastra 96 per 96 h in un'incubatrice di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi.
    5. Aggiungete 15 l della soluzione di colorante (vedi Tabella deimateriali) ad ogni pozzo e incubate per 4 h in un'incubatrice di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi, quindi aggiungete 100 l di solubilizzazione/stop-solution (vedere Tabella deimateriali) a ciascun pozzo e incubate durante la notte in un CO del 5%). incubatore c10>2 a 37 gradi centigradi.
    6. Misurare la densità ottica a 570 nm (OD570) utilizzando un lettore di microplacino (vedere Tabella dei materiali). Preparare 6-12 repliche e ripetere gli esperimenti almeno tre volte.
    7. Utilizzare un software statistico (vedi Tabella dei materiali) per tracciare graficamente questi dati come un grafico semi-log e calcolare il valore IC50, che è la concentrazione di droga che riduce la risposta al 50% del suo massimo (vedi Tabella dei materiali ).
  2. Esposizione continua delle cellule PC-9 all'irreversibile EGFR-TKI, afatinib, mediante escalation graduale della dose in tre piatti indipendenti da 10 cm
    1. Coltura PC-9 cellule in piatti p100 contenenti 10 mL di mezzo di crescita. Quando le cellule PC-9 raggiungono la fase sub-confluente, trasferire 1 mL di sospensione cellulare in tre nuovi piatti p100, con 9 mL di mezzo di crescita. Le cellule 1:10 PC-9 diluite diventano sub-confluenti in 3-4 giorni, con un numero di cellule di circa 4-5 x 105 celle / mL.
    2. Il giorno successivo, aggiungere 1/10 del valore IC50 di afatinib in ciascuno dei tre piatti p100.
      NOT: Afatinib è ricostituito in DMSO a concentrazioni di scorte di 1 m, 10 M, 100 M, 1 mM e 5 mM. Da 1 a 10 l di afatinib-solution viene aggiunto in 10 mL di mezzo di crescita nella coltura, come dalle concentrazioni finali richieste.
    3. Quando le cellule dei piatti afatinib p100 diventano sub-confluenti, mescolare bene per aspirazione con una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL della sospensione cellulare a 9 mL di mezzo di crescita fresco in un nuovo piatto p100. Successivamente, aggiungere 10-20% più alte concentrazioni di agrassiinib alla nuova cultura.
    4. Aumentare la concentrazione di agrassiinibi di 0,1 nM a 1 M nel mezzo con l'escalation della dose stepwise con la concentrazione di agrassiinib aumentata del 10-20% ad ogni passo nel periodo di 10-12 mesi.
      NOT: Quando la concentrazione agrassinib si avvicina al valore IC50, la crescita cellulare diventa piuttosto lenta. Se le cellule sono divise 1:9, non possono crescere, in quanto queste cellule vengono uccise da concentrazioni più elevate di asinneb. Pertanto, a concentrazioni afanitib più elevate, le cellule possono essere divise con un rapporto di 1:2. Le cellule più resistenti sono state coltivate in un mezzo agrassinib-contenuto per 3-14 giorni, e il mezzo non è stato cambiato fino a quando le cellule resistenti dovevano essere passaggio.
    5. Coltura le cellule resistenti agli agrassiinib per 2-3 mesi in 1 mezzo di crescita agrassiinib contenente. Ad una concentrazione agrassinib di 1 M, sono necessari 10-12 mesi per sviluppare resistenza all'afatinib in questo modello. Eseguire il saggio MTT per confermare che le cellule sono resistenti all'agrasso. Le tre linee cellulari agrassinib stabilite indipendentemente erano denominate AFR1, AFR2 e AFR3.

2. Caratterizzazione di tre celle indipendenti resistenti agli Agrassiinib

  1. Determinazione della curva di crescita delle cellule parentali PC-9 e creazione di cellule resistenti agli agrassinibi
    1. Cultura delle cellule PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 in media di crescita in un incubatore di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi.
    2. Risospendere le cellule a 5 x 103 cellule/mL con mezzo di crescita, e seme 100 l/well in una micropiastra da 96 pozze, in modo che la concentrazione finale delle cellule sia 500 cellule/100 l/l/well.
      NOT: L'analisi MTT viene eseguita per misurare i valori OD570 a 0, 1, 2, 3, 5 e 7 giorni. Per ogni giorno sono necessarie sei microplacche da 96 pozze.
    3. Eseguire il saggio MTT ogni 24 h e quindi nei giorni 0, 1, 2, 3, 5 e 7. Misurare i valori OD570 e preparare 6-12 repliche; ripetere gli esperimenti almeno tre volte e tracciare graficamente i risultati utilizzando un software statistico (vedere Tabella dei materiali).
  2. Identificazione delle alterazioni genomiche del DNA nell'EGFR tramite PCR in tempo reale
    NOT: Afatinib è un piccolo inibitore molecolare che si rivolge alla tirosina EGFR kinase. Lo stato di espressione EGFR è determinato a livello di DNA e proteine.
    1. Il DNA genomico è isolato utilizzando un kit di purificazione del DNA (vedi Tabella deimateriali) seguendo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione del DNA genomico isolato con uno spettrofotometro (vedi Tabella deimateriali) e regolare tutti i campioni di DNA genomico a 25 ng/ L.
    2. Amplifica 50 ng di DNA genomico, che equivale a 2 litri dei 25 stock ng/L, utilizzando un mix master verde SYBR (vedi Tabella dei materiali) e analizza i risultati utilizzando un sistema di rilevamento RT-PCR basato sulla fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
      NOT: Le condizioni di ciclo PCR sono iniziate con un primo passo di denaturazione a 95 gradi centigradi per i 20 s, seguito da 40 cicli di denaturazione di 95 gradi centigradi per 3 s, 60 gradi annealing per 30 s. I set di primer specifici sono i seguenti: EGFR F: 5'-CAAGGCCATGGACTA-3'R: 5'-CTGGAATGTGGAGGAGGACA-3'. Gene di normalizzazione LINE-1 F: 5'-AAAGGCTCAACTACATGG-3', R: 5-TGCTTTTGAATGCGTCCCAGAG-3'.
  3. Valutazione dell'effetto delle alterazioni proteiche sul livello dell'EGFR mediante l'analisi delle macchie occidentali
    1. Trattare le cellule con agrassiinib in modo continuo prima di esperimenti per 24 h. Lavare le cellule PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 due volte con PBS e poi semerli in mezzi di crescita senza afatinib. Lavare due volte le celle PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 con 5 mL di PBS ghiacciato.
    2. Lyse le cellule nel buffer RIPA contenente 1% protease inhibitor cocktail (vedi Tabella dei materiali) e fosforo cocktail inibitore II e III (vedi Tabella dei materiali) e incubare questa soluzione a 4 gradi centigradi per 30 min. Centrifugare le lismi per 10 min a 100 x g e 4 gradi centigradi e raccogliere i lismi cancellati.
    3. Determinare le concentrazioni di proteine utilizzando l'acido bicinchoninico (vedi Tabella dei Materiali), regolare tutti i campioni di proteine a 0,5 o 1 g/L utilizzando un buffer di campioni 4x (500 mM) (PH 6,8), il 40% di glicerolo, l'8% di SDS, il 20% H2O, lo 0,02% blu bronolifeolo) e bollire a 96 gradi centigradi per 5 min. Conservare questi campioni di proteine a -80 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita l'analisi delle macchie occidentali.
    4. Separare le stesse quantità di campioni di proteine, preferibilmente 20-30 l, per l'8% di pagine SDS e trasferire le proteine in una membrana di fluoruro polivichine (PVDF).
      NOT: L'elettroforesi del gel di sodio dodecyl-polyacrilio (SDS-PAGE) è comunemente usato in laboratorio per la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare.
      1. Pulire le lastre di vetro con etanolo e assemblare la lastra di vetro e distanziali. Preparare gel poliacrilamide dell'8% contenenti 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% Bis-acrilamide, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Polimerizzare per 30 min a temperatura ambiente.
      2. Successivamente, preparare un gel di impilamento contenente 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrylamide, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Aggiungere la soluzione di gel di impilamento, inserire il pettine e polimerizzare il gel per 20-30 min a temperatura ambiente.
      3. Posizionare i gel nell'apparato di elettroforesi e riempire il serbatoio con tampone di funzionamento (0,25 M Tris, 1,92 M glicina e 1% SDS). Caricare la stessa quantità di campioni di proteine (20-30 l) ed eseguire il gel a 180 V. Fermare l'elettroforesi una volta che la parte anteriore colorante fuoriesce dal gel, dopo circa 60 min.
      4. Lavare il gel per 1-2 min con TBST e poi trasferire le proteine su una membrana PVDF da gonfiore semi-secco (vedi Tabella dei Materiali) per 1,5 h ad una corrente costante di 300 mA.
    5. Bloccare le membrane con il 5% di latte secco non grasso (vedi Tabella deimateriali) diluito con soluzione TBST (vedi Tabella dei materiali) per 1 h a temperatura ambiente, quindi sondare le membrane con anti-EGFR, anti-phospho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anticorpi anti-HER3, anti-MET e anti-actin (diluiti 1:3.000 in TBST) (vedi Tabella deimateriali) a 4 gradi durante la notte.
    6. Lavare le membrane con TBST tre volte per 10 min, quindi esporre le membrane all'anticorpo secondario (diluito 1:200 in TBST) per 1-1,5 h a temperatura ambiente. Lavare le membrane cinque volte con TBST per 10 minuti a temperatura ambiente, esporli alla soluzione ECL (vedere Tabella dei materiali) e visualizzare i segnali utilizzando le pellicole.
  4. Analisi delle mutazioni EGFR mediante sequenziamento
    1. Amplifica il DNA genomico usando primer specifici per gli esoni EGFR 19-21. Le condizioni di denaturazione della PCR iniziano con un primo passo di denaturazione a 94 gradi centigradi per 1 min, seguito da 30 cicli di denaturazione a 98 gradi centigradi per 10 s, annealando a 55 s per 30 s, ed estraendo si protrae a 72 gradi centigradi per 1 min.
      NOT: I primer specifici per EGFR exon 19: F: 5'-GCAATATCGCCTTAGTagTGCCTCTCTC-3' R: 5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3', Esone 20: F: 5'-CCATGAGACTATTTTGAAACTC-3', R: 5-CATATCCCTCCATCCAACTCTCTCTGC-3', e exon 21' e eson 21: F: 5'-ATGAACATGACCCTCTCTGAATTCGG-3', R: 5'- GCTCcACCCAGAATGTCTGGAGA-3.
    2. Depurai i prodotti PCR amplificati utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi Tabella deimateriali) e sequenzia gli ampi.

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Risultati

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Lo schema per stabilire tre linee cellulari aresistenza agrassiinib da cellule PC-9 utilizzando una procedura di dose-escalation passo a passo è illustrato nella Figura 1. La figura 2 mostra una diminuzione della proliferazione cellulare delle cellule parentali del PC-9 con l'aumento della concentrazione di agrassinib, indicando che le cellule PC-9 sono sensibili all'esposizione agrassinib. La figura 3

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Discussione

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Qui, abbiamo descritto un metodo per stabilire tre linee cellulari indipendenti resistenti agli agrassinib e abbiamo caratterizzato queste cellule rispetto alle cellule parentali del PC-9. Con l'esposizione all'escalation della dose graduale, le cellule parentali di PC-9 hanno acquisito resistenza all'afatinib per un periodo di 10-12 mesi. Clinicamente, i meccanismi di resistenza ai TCI EGFR sono eterogenei, e quindi, dopo il trattamento iniziale con afatinib, le cellule PC-9 sono state suddivise in tre piatti p100 indip...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il membro dell'Advanced Cancer Translational Research Institute per i loro commenti premurosi e Editage per la loro assistenza con l'editing in lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione: 16K09590 a T.Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
afatinibSelleck S1011
anti-EGFR anti-EGFR anticorpo monoclonaledi segnalazione cellulare4267S
saggio dell'acido bicinchoninicosigmaB9643
trattato con coltura cellulare piatto da 10 cmViolamo2-8590-03
CELL BANKER1 TakaRaCB011terreno di crioconservazione
CellTiter 96Promega  G4100  Saggio di proliferazione cellulare non radioattiva; Soluzione colorante e soluzione di solubilizzazione/arresto
DMSOWako043-07216
Soluzione ECLPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied BiosystemsSistema di rilevamento RT-PCR basato sulla fluorescenza 
Software GraphPad Prism v.7 GraphPad, Inc.un software statistico
Spettrofotometro NanoDrop LiteTermospettrofotometro
di segnalazione delle cellulelatte secco sgrassato9999S
PenStrep gibco15140-163
cocktail di inibitori della fosfatasi 2sigmaP5726
cocktail di inibitori della fosfatasi 3sigmaP0044
Lettore di micropiastre Powerscan HTBioTek
Potenza SYBR Mix master verde Applied BiosystemsSYBR Green master mix
inibitore della proteasi cocktailsigmaP8340
QIAamp DNA Mini kitQiagen51306Kit di purificazione del DNA
QIAquick Kit di purificazione PCRQIAGEN
RPMI-1640 Wako189-02025con L-Glutammina e Rosso Fenolo
TBST in polveresigmaT9039
Trans-Blot SD Cella di trasferimento elettroforetica semi-seccaBio-RadApparecchio semi-secco t4ransfer
Micropiastra a 96 pozzettiThermo130188
tecnologia Tecnologia del

Riferimenti

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