Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale

Sommario

Utilizzando un dispositivo progettato in precedenza per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti, questo documento descrive una geometria del substrato ridisegnata e un apparato personalizzato per l'imaging a cella singola ad alta risoluzione delle cellule tese con un obiettivo di immersione in olio 100x.

Abstract

Ceppo meccanico extracellulare è noto per suscitare risposte fenotipiche cellulari e ha rilevanza fisiologica in diversi sistemi tissutali. Per catturare l'effetto dello sforzo di trazione extracellulare applicato sulle popolazioni cellulari in vitro attraverso saggi biochimici, un dispositivo è stato precedentemente progettato che può essere fabbricato semplicemente ed è abbastanza piccolo da adattarsi all'interno di incubatori di coltura tissutale, così come sopra fasi del microscopio. Tuttavia, il precedente disegno del substrato di polidimetilsilossano non ha consentito l'imaging subcellulare ad alta risoluzione attraverso obiettivi di immersione in olio. Questo lavoro descrive una geometria ridisegnata del substrato di polidimetilsilossano e una configurazione di imaging personalizzata che insieme può facilitare l'imaging subcellulare ad alta risoluzione delle cellule vive mentre è sotto sforzo applicato. Questo substrato può essere utilizzato con lo stesso dispositivo progettato in precedenza e, quindi, ha gli stessi vantaggi di cui sopra, oltre a consentire l'imaging ottico ad alta risoluzione. Il design del substrato di polidimetilsilossano può essere migliorato incorporando una griglia che faciliterà il tracciamento della stessa cellula prima e dopo l'applicazione della deformazione. I risultati rappresentativi dimostrano l'imaging time-lapse ad alta risoluzione di nuclei con etichetta fluorescente all'interno di cellule tese catturate utilizzando il metodo descritto qui. Questi dati di dinamica nucleare forniscono approfondimenti sul meccanismo mediante il quale la deformazione a trazione applicata favorisce la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte.

Introduzione

Cellule e tessuti nel corpo sono sottoposti a vari spunti meccanici, compresi i ceppi di trazione. Tuttavia, gli effetti di questi spunti sulla biologia delle cellule neurali non sono ancora stati studiati ampiamente e compresi completamente. Nel sistema nervoso centrale, le fonti di ceppo meccanico includono la crescita dello sviluppo^1,2,3,4, processi fisiologici come piegatura del midollo spinale, sangue e liquido cerebrospinale pulsazioni e condizioni patologiche come trauma, gonfiore assone, cicatrici gliali o crescita tumorale

Protocollo

1. progettazione dello stampo a singolo pozzetto in polidimetilsilossano per immagini ad alta risoluzione

Nota: lo stampo per la produzione di lastre di polidimetilsilossano è stato progettato con le seguenti caratteristiche per consentire l'imaging con una lente di immersione a olio 100x e una corretta misura nel dispositivo di deformazione personalizzato-Build (Figura 1a, B).

1. Mantenere le dimensioni complessive della piastra in modo che si adatti ai morsetti del dispositivo di deformazione.
   Nota: sono 60 mm x 73 mm.
2. Fare un compartimento di celle o bene....

Risultati

I recenti lavori volti a indagare l'effetto della deformazione a trazione sugli oligodendrociti¹⁰ hanno mostrato che un ceppo di trazione uniassiale del 10% promuove la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte mediante cambiamenti globali nell'espressione genica. Il meccanismo dietro questi cambiamenti nell'espressione genica può essere sondato attraverso l'imaging dei parametri subcellulari, come la struttura del citoscheletro, la localizza.......

Discussione

Un dispositivo ha precedentemente¹ stato progettato per l'applicazione di sforzo di trazione extracellulare su cellule aderenti. Il disegno del substrato di polidimetilsilossano in quel lavoro era sufficiente per i saggi biochimici, così come l'imaging a bassa risoluzione delle cellule allungate. In questo lavoro, il substrato è stato ridisegnato e è stata introdotta una nuova configurazione di imaging che facilita l'imaging cellulare subcellulare ad alta risoluzione. I vantaggi di questo sistema .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Primary cells			Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolate da neonatal rats sono state fornite dal laboratorio del Dr. S. Y. Chew presso la Nanyang Technological University
Media
DMEM high  glucosio	Gibco	11996-065-500ml
Pen/Strep	Gibco	15070-063-100ml
FGF	Prospec	CYT-608-50ug
PDGF	Prospec	CYT-776-10ug
Media Componenti di riserva
BSA	Sigma	A9418-10G
Progesterone	Sigma	P8783-1G
Putrescine	Sigma	P5780-5G
Selenito di sodio	Sigma	S5261-10G
Tri-iodotironina	Sigma	T6397-100MG
Tiroxina	Sigma	T1775-100MG
Olo-transferrina	Sigma	T0665-500MG
Insulina	Sigma	I9278
Stampo e piastra
PDMS PDMS - Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Stampo - Plastica liquida	Smooth-On	Smooth Cast 310 - Trail Size
Substrato Rivestimenti
	Sigma	P6407-5MG
Fibronectina	Sigma	F1141-2MG
strong>Colorazione istonica
CellLigt H2B-GFP BacMam	Sonde molecolari	C10594
Funzionalizzazione superficiale
APTES	Sigma	A3648-100ml
BS3	Covachem	13306-100mg
tampone HEPES pH 8.0	Alfa Aesar	J63578-AK-250ml
Distacco cellulare
Accutase	Invitrogen	A1110501-100ml

poli-D-lisina <