Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo

Summary

Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell'immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.

Abstract

Le cellule pennello tracheali sono cellule epiteliali colinergiche pronte a trasmettere segnali dal lume delle vie aeree al sistema immunitario e nervoso. Fanno parte di una famiglia di cellule epiteliali chemiosensoriali che includono cellule del ciuffo nella mucosa intestinale, cellule pennello nella trachea, e cellule chemiosensoriali solitarie e microvillous nella mucosa nasale. Le cellule chemiosensoriali in diversi compartimenti epiteliali condividono marcatori intracellulari chiave e una firma trascrizionale di base, ma mostrano anche una significativa eterogeneità trascrizionale, probabilmente riflettente dell'ambiente del tessuto locale. L'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalle sospensioni a cella singola è necessario per definire in dettaglio la funzione di queste rare cellule epiteliali, ma il loro isolamento è impegnativo, potenzialmente a causa della stretta interazione tra le cellule del pennello tracheale e le terminazioni nervose o a causa della composizione specifica delle vie aeree di giunzioni strette e aderenti. Qui, descriviamo una procedura per l'isolamento delle cellule pennello dall'epitelio tracheale del topo. Il metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa, consentendo una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Questa procedura offre una soluzione rapida e conveniente per lo smistamento citometrico del flusso e l'analisi funzionale delle cellule pennello tracheale vitali.

Introduction

Le cellule pennello appartengono a una classe di cellule epiteliali chemiosensoriali caratterizzate dall'espressione di recettori del gusto amaro e dal meccanismo di trasduzione del recettore del gusto presente nelle cellule delle papille gustative. A differenza delle cellule epiteliali chemiosensoriali, le cellule epiteliali chemiosensoriali sono sparse in superfici epiteliali e sono indicate come cellule chemiosensoriali solitarie (SCC) e cellule microvinili nell'epitelio nasale^1,2, cellule pennello nel trachea ^3,4, e cellule di ciuffo nell'intestino....

Protocol

Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutti gli usi e i protocolli per la cura degli animali siano approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e siano eseguiti in accordo con la "Guida per la cura e l'uso di Laboratory Animals" (8a edizione 2011) e le linee guida DI ARRIVE. Tutte le procedure descritte di seguito sono state riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Brigham and Women's Hospital.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare la soluzione di digestione Dispase, che è una soluzione PBS che contiene 16 U/mL d....

Results

Questa procedura è stata implementata con successo per isolare le cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell'RNA³. Dopo l'isolamento della trachea e la digestione del tessuto con un protocollo in 2 fasi (Figura 1), le cellule sono state raccolte e macchiate con CD45 ed EpCAM con etichettaflua fluorescente dopo l'esclusione delle cellule morte con PI. Dopo aver creato doppietti in base alle caratteristiche di dispersione in avanti e laterale, abbiamo def.......

Discussion

Abbiamo scoperto che una combinazione di trattamento dispase ad alta dose per 40 min seguita da un breve trattamento papaina (30 min) fornisce un protocollo ottimale per la digestione tracheale e l'isolamento delle cellule pennello. Questa combinazione evita una digestione estesa e produce la massima resa di celle pennello, rispetto ai protocolli alternativi.

Mentre la digestione polmonare per estrarre le cellule ematopoietiche ha classicamente invocato enzimi digestivi lievi come collagenae I.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpi
Anti-GFP (Ig capra policlonale)	Abcam	cat# ab5450
APC anti-topo CD326 (EpCAM)  (G8.8)	Biolegend	cat#118214
APC Rat IgG2a, controllo dell'isotipo k	Biolegend	cat#400511
DAPI	Biolegend	cat#422801
Asino anti-capra IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molecular Probes	cat#A-11055
Normal Goat IgG	R& D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, controllo dell'isotipo k	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (anti-topo CD16/32) Anticorpo	Biolegend	cat#101320
Sostanze chimiche, peptidi e proteine
Dispasi	Gibco	cat# 17105041
DNase I	Sigma	gatto# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Tampone senza calcio (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM glucosio. Preparato in acqua da 18,2 megaohm e filtrato attraverso 0,22 &5; m filtro	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode' Soluzione (tamponata HEPES) 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 25 mM di HEPES, 2 mM di CaCl2, 2 mM di MgCl2 e 10 mM di glucosio. Preparato in acqua da 18,2 megaohm e filtrato attraverso 0,22 &5; m filtro. )	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-Cisteina	Sigma	cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetato sale	Sigma	cat# L2023
Papaina da lattice di papaya	Sigma	cat# P3125
Ioduro di propidio	Sigma	cat# P4170
Modelli sperimentali: Organismi/Ceppi
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	The Jackson Laboratory	7902
Equipment
LSM 800 con sistema confocale Airyscan  su a  Microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss
LSRFortessa	BD	647465
Attrezzatura monouso
1,5 mL provette sterili	Thomas Scientific	1157C86
5 mL Provetta in Poysterene a fondo tondo, 12 mm x 75 mm stile	Falcon	14-959-1A
Provetta conica in polipropilene da 50 mL, 30 mm x 115 mm Falcon		352098
Feather Bisturi monouso n.12	Fisher Scientific	NC9999403
Piastra di Petri, 100 mm x 15 mm Style	Falcon	351029
Filtro per cellule sterili, 100 &; m	Fisherbrand	gatto#22363549