Method Article

Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell'immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule pennello tracheali sono cellule epiteliali colinergiche pronte a trasmettere segnali dal lume delle vie aeree al sistema immunitario e nervoso. Fanno parte di una famiglia di cellule epiteliali chemiosensoriali che includono cellule del ciuffo nella mucosa intestinale, cellule pennello nella trachea, e cellule chemiosensoriali solitarie e microvillous nella mucosa nasale. Le cellule chemiosensoriali in diversi compartimenti epiteliali condividono marcatori intracellulari chiave e una firma trascrizionale di base, ma mostrano anche una significativa eterogeneità trascrizionale, probabilmente riflettente dell'ambiente del tessuto locale. L'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalle sospensioni a cella singola è necessario per definire in dettaglio la funzione di queste rare cellule epiteliali, ma il loro isolamento è impegnativo, potenzialmente a causa della stretta interazione tra le cellule del pennello tracheale e le terminazioni nervose o a causa della composizione specifica delle vie aeree di giunzioni strette e aderenti. Qui, descriviamo una procedura per l'isolamento delle cellule pennello dall'epitelio tracheale del topo. Il metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa, consentendo una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Questa procedura offre una soluzione rapida e conveniente per lo smistamento citometrico del flusso e l'analisi funzionale delle cellule pennello tracheale vitali.

Introduction

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Le cellule pennello appartengono a una classe di cellule epiteliali chemiosensoriali caratterizzate dall'espressione di recettori del gusto amaro e dal meccanismo di trasduzione del recettore del gusto presente nelle cellule delle papille gustative. A differenza delle cellule epiteliali chemiosensoriali, le cellule epiteliali chemiosensoriali sono sparse in superfici epiteliali e sono indicate come cellule chemiosensoriali solitarie (SCC) e cellule microvinili nell'epitelio nasale1,2, cellule pennello nel trachea 3,4, e cellule di ciuffo nell'intestino5,6. Le cellule epiteliali che esprimono recettori del gusto amaro eil meccanismo di trasduzione amara si trovano anche nell'uretra 7,8 e nel tubo uditivo9. Le cellule pennello delle vie aeree hanno funzioni uniche nelle risposte neurogeniche e immunitarie delle vie aeree. Sono cellule chemiosensoriali che producono acetilcolina che evocano riflessi respiratori protettivi dopo l'attivazione con composti amari e metaboliti batterici come sostanze di quorum-sensing10. Le cellule pennello delle vie aeree sono anche la fonte epiteliale delle vie aeree di IL-25, che regola l'infiammazione di tipo 2 aeroallergened nelle vie respiratorie3.

La caratterizzazione del trascrittoma completo delle cellule pennello delle vie aeree inferiori e la loro risposta agli stimoli ambientali è stata limitata dal loro basso numero nell'epitelio tracheale e da un numero molto limitato oltre il grande bronchi10. Le tecniche utilizzate per l'isolamento delle cellule chemiosensoriali dall'epitelio intestinale non hanno prodotto numeri proporzionalmente elevati dalla trachea, probabilmente a causa dei contatti intimi delle cellule pennello tracheale con terminazioni nervose10 o altro fattori specifici del tessuto nella mucosa respiratoria come la composizione di aderesi e proteine di giunzione strette. Recenti rapporti di isolamento riuscito delle cellule pennello tracheale in numero maggiore per l'analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula hanno impiegato un'incubazione di 2 h con papaina o un'incubazione di 18 h con prosiano11,12. Poiché incubazioni più lunghe con enzimi digestivi possono diminuire la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule dai tessuti digeriti13, questo potrebbe bias comparativa analisi con altre popolazioni epiteliali chemiosensoriali.

Qui, segnaliamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell'RNA3. Il trattamento della trachea con dispase ad alto dosaggio separa l'epitelio dalla submucosa. La successiva digestione del foglio epiteliale con papaina consente un eccellente recupero di questa cellula strutturale.

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Protocol

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Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutti gli usi e i protocolli per la cura degli animali siano approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e siano eseguiti in accordo con la "Guida per la cura e l'uso di Laboratory Animals" (8a edizione 2011) e le linee guida DI ARRIVE. Tutte le procedure descritte di seguito sono state riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Brigham and Women's Hospital.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare la soluzione di digestione Dispase, che è una soluzione PBS che contiene 16 U/mL dispase e 20 g/mL DNase I. Assicurarsi che la polvere didispasi sia completamente dissolta prima di riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
  2. Aggiungere il 5% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) per una soluzione di arresto.
  3. Preparare il buffer Tyrode I: aggiungere 26 U/mL di papaina (20 l/mL di soluzione papaina 48 U/mg) e 10 l/mL L-cisteina al buffer di HEPES-Tyrode senza calcio.
  4. Preparare il buffer Tyrode II: aggiungere 2 leupeptina l/mL (5 mg/mL) al buffer di HEPES-Tyrode con calcio.
  5. Preparare il buffer FACS: utilizzare la soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) senza calcio, magnesio e rosso fenolo, integrato con 2 mM di acido etileminamineaminetracetracetica (EDTA) e aggiungere 2% FBS.

2. Dissezione di Trachea del topo

NOT: I topi utilizzati in questo protocollo sono ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 mesi di età di entrambi i sessi. Ridurre al minimo l'esposizione del tessuto alla luce diretta per ridurre il fotosbiancamento di eGFP.

  1. Eutanasia del topo con 100 mg/kg soluzione di eutanasia pentobarbitale iniettata intraperiti al tempo o utilizzando protocolli standard approvati dall'IACUC.
  2. Fissare il mouse su una scheda chirurgica in posizione supina con 21 G aghi con estremità superiori e inferiori estese. Spruzzare la pelliccia con il 70% di EtOH per sanificare l'area.
  3. Utilizzando pinze dritte, sollevare la pelle e la pelliccia dell'addome e fare un'incisione al centro con forbici dissecistrici (forbici dritte, 3 cm). Utilizzando le forbici, separare la pelle dal tessuto sottocutaneo dall'addome alla mandibula. Tenendo il tessuto sottocutaneo con le pinze, fare una piccola incisione con le forbici al centro della parete addominale.
  4. Aprire il peritoneo con un'incisione a forma di V. Utilizzando le pinze, spostare delicatamente l'intestino tenue di lato, individuare l'aorta addominale e vena cava e fare un'incisione con le forbici dissetanti per consentire una rapida esanguinazione.
  5. Individuare il diaframma. Utilizzando un ago da 18 G, fare un'apertura nel diaframma appena sotto lo sterno per sgonfiare i polmoni. Separare con cura il diaframma dalla gabbia toracica utilizzando forbici dritte appuntite per tagliare lungo la base delle costole.
  6. Utilizzando le pinze, sollevare l'estremità esposta dello sterno e tagliare lo sterno longitudinalmente dalla base della gabbia toracica al collo. Fare un'incisione cervicale centrale con forbici corte dritte (2 cm) e separare i due lobi della ghiandola submandibolare.
  7. Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo circostante e il timo sovrastante la carina con un paio di pinze ad alta precisione punto fine.
  8. Assottigliare la trachea libera prima separando l'estremità prossimale a livello dell'epiglottide e poi sezionando l'estremità distale a livello della biforcazione della trachea.
  9. Individuare l'epiglottide e tagliare la trachea longitudinalmente dall'epiglottide alla carina.

3. Digestione epiteliale tracheale

  1. Collocare la trachea in un tubo da 1,5 mL contenente 750 l di soluzione di disgestione dispasi preriscaldata (a 37 gradi centigradi). Incubare su uno shaker a 200 rpm per 40 min a temperatura ambiente. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta.
  2. Aggiungere 750 l di DMEM freddo con 5% FBS per fermare la reazione. Mettere sul ghiaccio.
  3. Trasferire la trachea in un piatto Petri (100 mm x 15 mm) e metterla al microscopio dissettivo. Orientare la trachea con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. La trachea sezionata longitudinale ha una forma semi-cilindrica mantenuta dagli anelli cartilagine. L'epitelio è sulla superficie concava.
  4. Legare l'area di epiglottide della trachea con pinze dritte al piatto Petri e utilizzando un bisturi monouso taglia 22, raschiare l'epitelio dalla trachea. Lo strato epiteliale si separa come un foglio traslucido.
  5. Mitare l'epitelio con il bisturi. Trasferire lo strato epiteliale in un tubo da 2 mL.
  6. Sciacquare il piatto Petri con 750 tamponanti di Tyrode I e trasferirlo al tubo da 2 mL contenente lo strato epiteliale.
  7. Incubare lo strato epiteliale tracheale nel buffer Tyrode I per 30 min a 37 gradi centigradi su uno shaker a 200 giri/m. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta.
  8. Aggiungere 750 l di tampone freddo Tyrode II. Vortice il tessuto digerito vigorosamente per 20-30 s. Triturare l'omogeneità con una siringa attaccata ad un ago 18 G 10 volte.  Passare a un ago calibro 21 G e triturare 10-20 più volte.
  9. Filtrare le cellule attraverso un colino da 100 m in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 30:1 vol/vol di freddo FACS buffer.
  10. Girare a 350 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare il super-natante. Risospendere il pellet nel buffer FACS freddo e trasferire la sospensione in un tubo di polistirolo da 12 mm x 75 mm (5 mL). Girare di nuovo a 350 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante.
  11. Sospendere nuovamente il pellet in 100 o L di BUFFER FACS.
  12. Aggiungere 1 l'anticorpo anti-topo cd16/32 per bloccare il legame non specifico e incubare per 15 min sul ghiaccio. Non lavare.
  13. Aggiungere i seguenti anticorpi e i rispettivi controlli isotipi: pacific blue anti-mouse CD45 o ratto IgG2a, k (0,25 g/106 cellule in 100 volume) e l'allophycocyanin (APC) anti-topo EpCAM o ratto IgG2b, k (0,5 g/106 cellule in volume 100) anticorpi monoclonali. Incubare per 45 min sul ghiaccio protetto dalla luce diretta. Aggiungere 4,5 mL di tampone FACS freddo, mescolare e girare a 350 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il buffer FACS e sospendere nuovamente il pellet in 300 - L di buffer FACS a freddo.
  14. Aggiungere lo iodide di propidio (PI) (5 g/mL) immediatamente prima dello smistamento citometrico del flusso.
    NOT: Le celle pennello hanno una forma irregolare con diversi processi che potrebbero potenzialmente aumentare la loro aderenza ai filtri (Figura 3C). Abbiamo confrontato filtri da 30 mm a filtri da 70 e 100 mm e abbiamo scoperto che i filtri dei pori più grandi garantivano una resa migliore. Inoltre, la triturazione completa della sospensione cellulare dopo la digestione della papaina migliora significativamente le rese delle cellule pennello. Si consiglia di utilizzare un ago 18G per la triturazione iniziale seguito da un foro più piccolo (21 o 23 G ago) per una dissociazione più fine delle cellule.

4. Strategia di flusso cytometry Gating

  1. Identificare le celle dai detriti in base all'angolo di dispersione in avanti e laterale. Escludere i doppietti utilizzando l'altezza e la larghezza della dispersione in avanti e l'altezza e la larghezza della dispersione laterale. I doppi sono le celle con valori di larghezza elevata.
  2. All'interno delle singole celle, identificare le cellule vive come la popolazione che è PI negativo.
  3. All'interno delle singole celle vive, identificare le cellule da basso a negativo CD45 in base al controllo isotipo.
  4. All'interno delle celle a basso/negativo CD45, identificare le celle positive EpCAM che sono anche eGFP positivo (nel canale FITC). Questa è la popolazione di celle pennello (Figura 2A).

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Results

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Questa procedura è stata implementata con successo per isolare le cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell'RNA3. Dopo l'isolamento della trachea e la digestione del tessuto con un protocollo in 2 fasi (Figura 1), le cellule sono state raccolte e macchiate con CD45 ed EpCAM con etichettaflua fluorescente dopo l'esclusione delle cellule morte con PI. Dopo aver creato doppietti in base alle caratteristiche di dispersione in avanti e laterale, abbiamo def...

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Discussion

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Abbiamo scoperto che una combinazione di trattamento dispase ad alta dose per 40 min seguita da un breve trattamento papaina (30 min) fornisce un protocollo ottimale per la digestione tracheale e l'isolamento delle cellule pennello. Questa combinazione evita una digestione estesa e produce la massima resa di celle pennello, rispetto ai protocolli alternativi.

Mentre la digestione polmonare per estrarre le cellule ematopoietiche ha classicamente invocato enzimi digestivi lievi come collagenae I...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo Adam Chicoine al Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core per il suo aiuto con lo smistamento citometrico del flusso. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), e K08 AI132723 (L.G.B), e dall'American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), del Premio AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), dello Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), del Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), e di un generosa donazione da parte della famiglia Vinik (L.G.B.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticorpi
Anti-GFP (Ig capra policlonale)Abcamcat# ab5450
APC anti-topo CD326 (EpCAM)  (G8.8)Biolegendcat#118214
APC Rat IgG2a, controllo dell'isotipo kBiolegendcat#400511
DAPIBiolegendcat#422801
Asino anti-capra IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probescat#A-11055
Normal Goat IgGR& D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, controllo dell'isotipo kBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anti-topo CD16/32) AnticorpoBiolegendcat#101320
Sostanze chimiche, peptidi e proteine
DispasiGibcocat# 17105041 
DNase ISigma gatto# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Tampone senza calcio (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM glucosio. Preparato in acqua da 18,2 megaohm e filtrato attraverso 0,22 &5; m filtroBoston BioProductscat# PY-912
Tyrode' Soluzione (tamponata HEPES) 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 25 mM di HEPES, 2 mM di CaCl2, 2 mM di MgCl2 e 10 mM di glucosio. Preparato in acqua da 18,2 megaohm e filtrato attraverso 0,22 &5; m filtro. )Boston BioProductscat# BSS-355
L-CisteinaSigmacat# C7352
Leupeptin trifluoroacetato saleSigmacat# L2023
Papaina da lattice di papayaSigmacat# P3125
Ioduro di propidio Sigmacat# P4170
Modelli sperimentali: Organismi/Ceppi
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)The Jackson Laboratory7902
Equipment
LSM 800 con sistema confocale Airyscan  su a  Microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1Zeiss
LSRFortessaBD647465
Attrezzatura monouso
1,5 mL provette steriliThomas Scientific1157C86
5 mL Provetta in Poysterene a fondo tondo, 12 mm x 75 mm stileFalcon14-959-1A
Provetta conica in polipropilene da 50 mL, 30 mm x 115 mm Falcon352098
Feather Bisturi monouso n.12Fisher ScientificNC9999403
Piastra di Petri, 100 mm x 15 mm StyleFalcon351029
Filtro per cellule sterili, 100 &; mFisherbrandgatto#22363549
ricombinanti

References

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