Un modello di Xenotrapianto a parte del paziente di melanoma

Summary

I modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente riassumono in modo più robusto le caratteristiche molecolari e biologiche del melanoma e sono più predittivi della risposta terapeutica rispetto ai tradizionali saggi basati sulla coltura dei tessuti plastici. Qui descriviamo il nostro protocollo operativo standard per la creazione di nuovi modelli PDX e la caratterizzazione/sperimentazione di modelli PDX esistenti.

Abstract

Sempre più prove suggeriscono che le proprietà molecolari e biologiche differiscono nelle cellule del melanoma coltivate in vasi tradizionali di coltura dei tessuti bidimensionali rispetto a quelli in vivo nei pazienti umani. Ciò è dovuto alla selezione del collo di bottiglia delle popolazioni clonali di cellule melanoma che possono crescere robustamente in vitro in assenza di condizioni fisiologiche. Inoltre, le risposte alla terapia nelle colture di tessuti bidimensionali nel complesso non riflettono fedelmente le risposte alla terapia nei pazienti affetti da melanoma, con la maggior parte degli studi clinici che non riescono a dimostrare l'efficacia delle combinazioni terapeutiche dimostrata essere efficaci Vitro. Sebbene il xenotrapianto delle cellule di melanoma nei topi fornisca il contesto fisiologico in vivo assente dai test di coltura dei tessuti bidimensionali, le cellule di melanoma utilizzate per l'innesto hanno già subito la selezione del collo di bottiglia per le cellule che potrebbero crescere sotto condizioni bidimensionali quando è stata stabilita la linea cellulare. Le alterazioni irreversibili che si verificano come conseguenza del collo di bottiglia includono cambiamenti nelle proprietà di crescita e invasione, così come la perdita di specifiche sottopopolazioni. Pertanto, i modelli che ricapitolano meglio la condizione umana in vivo possono prevedere meglio strategie terapeutiche che aumentano efficacemente la sopravvivenza complessiva dei pazienti con melanoma metastatico. La tecnica dello xenotrapianto derivante dal paziente (PDX) prevede l'impianto diretto delle cellule tumorali dal paziente umano a un ricevente del topo. In questo modo, le cellule tumorali sono costantemente coltivate sotto stress fisiologici in vivo e non subiscono mai il collo di bottiglia bidimensionale, che conserva le proprietà molecolari e biologiche presenti quando il tumore era nel paziente umano. Notevoli, i modelli PDX derivati da siti di organi di metastasi (cioè cervello) mostrano una capacità metastatica simile, mentre i modelli PDX derivati da pazienti ingenui di terapia e pazienti con resistenza acquisita alla terapia (cioè la terapia inibitore BRAF/MEK) sensibilità simile alla terapia.

Introduction

I modelli preclinici sono fondamentali per tutti gli aspetti della ricerca traslazionale sul cancro, compresa la caratterizzazione delle malattie, la scoperta di vulnerabilità utilizzabili per il cancro rispetto alle cellule normali e lo sviluppo di terapie efficaci che sfruttano queste vulnerabilità per aumentare la sopravvivenza complessiva dei pazienti. Nel campo del melanoma, decine di migliaia di modelli di linee cellulari sono stati fortemente utilizzati per lo screening farmacologico, con >4,000 forniti dal nostro gruppo da solo (serie WMXXX). Questi modelli di linea cellulare sono stati derivati da pazienti affetti da melanoma con varie forme di melanoma cutaneo (ad esempio, acrale, ueal e diffusione superficiale) e da diversi genotipi (ad esempio, BRAF^V600-mutant e neuroblastoma RAS virale oncogene homolog [ NRAS ^Q61R-mutante]), che abbracciano lo spettro della malattia presente nella clinica^1,2.

Inequivocabilmente, la strategia terapeutica mirata di maggior successo nel campo del melanoma è emersa da 1) la caratterizzazione genomica dei tumori dei pazienti che identificano le mutazioni di BRAF nel 50% dei melanomi³ e da 2) indagini precliniche sfruttando i modelli della linea cellulare del melanoma⁴. La combinazione di inibitori BRAF/MEK è stata approvata nella Food and Drug Administration (FDA) nel 2014 per il trattamento di pazienti i cui melanomi ospitano l'attivazione di mutazioni BRAF^V600E/K e vanta un tasso di risposta >75%⁵. Nonostante questa efficacia iniziale, la resistenza si manifesta rapidamente in quasi tutti i casi a causa di meccanismi di resistenza intrinseci e acquisiti multifariosi e eterogeneità intratumorale. Sfortunatamente, i modelli della linea cellulare non ricapitolano l'eterogeneità biologica rappresentativa se coltivati in coltura bidimensionale in vasi di plastica, il che maschera il loro potenziale clinico predittivo quando gli investigatori tentano di determinare sperimentalmente terapie che potrebbero essere efficaci nei pazienti con una forma specifica o genotipo di melanoma⁶. Comprendere come modellare al meglio l'eterogeneità intratuare del paziente consentirà agli sperimentatori di sviluppare meglio le modalità terapeutiche che possono uccidere le sottopopolazioni resistenti alla terapia che indirizzano il fallimento alle attuali terapie standard di cura.

La Paramount al limitato valore predittivo dei modelli a linee cellulari è il modo in cui vengono inizialmente stabiliti. Alterazioni irreversibili si verificano nel paesaggio clonale del tumore quando una sospensione unicellulare del tumore di un paziente viene coltivata su vasi bidimensionali di coltura dei tessuti plastici, compresi i cambiamenti nel potenziale proliferare e invasivo, l'eliminazione di sottopopolazioni, e l'alterazione delle informazioni genetiche⁷. Gli Xenograft nei topi di questi modelli di linea cellulare del melanoma rappresentano la piattaforma in vivo più utilizzata per gli studi preclinici; tuttavia, questa strategia soffre anche della scarsa ricapitolazione dell'eterogeneità tumorale complessa osservata clinicamente. Per ovviare a questa lacuna, c'è stato un crescente interesse nell'incorporare modelli preclinici più sofisticati di melanoma, incluso il modello PDX. I modelli PDX sono stati utilizzati per >30 anni, con studi seminali in pazienti affetti da cancro del polmone che dimostrano la concordanza tra la risposta dei pazienti agli agenti citotossici e la risposta del modello PDX derivato dallo stesso paziente⁸. Recentemente, c'è stato un impulso a utilizzare i modelli PDX come strumento di scelta per le indagini precliniche sia nel settore che nei centri accademici. I modelli PDX, a causa della loro ricapitolazione superiore dell'eterogeneità tumorale nei pazienti umani, sono clinicamente più rilevanti da utilizzare negli sforzi di ottimizzazione della terapia rispetto agli xenografi della linea cellulare⁹. Nel melanoma, ci sono ostacoli immensi che smussano la gestione terapeutica della malattia avanzata¹⁰. Sono stati utilizzati modelli PDX clinicamente pertinenti per modellare la resistenza clinica e identificare strategie terapeutiche con agenti clinicamente disponibili per il trattamento dei tumori resistenti alla terapia^11,12. In breve, il protocollo qui presentato per generare modelli PDX richiede l'impianto sottocutaneo di tessuto fresco da melanomi primari o metastatici (raccolti mediante biopsia o chirurgia) nei topi NOD/scid/IL2-receptor null (NSG). Variazioni diverse nell'approccio metodologico sono utilizzate da gruppi diversi; tuttavia, esiste un nucleo fondamentale¹³.

Protocol

I seguenti protocolli animali seguono le linee guida del comitato etico umano del Wistar Institute e le linee guida per la cura degli animali.

1. Raccolta del tessuto tumorale del melanoma

1. Raccogliere il tessuto tumorale (chiamato passaggio 0) dai pazienti con melanoma con uno dei seguenti metodi chirurgici o biopsie.
   1. Per il tessuto di escissione chirurgica, mantenere un minimo di 1 g di tessuto (metastasi di resect e lesioni primarie) nei supporti di stoccaggio di trasporto (RPMI 1640 - 0,1% fungizone - 0.2% gentamicin) a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
   2. Per il tessuto di biopsia chirurgica, mantenere meno di 1 g di tessuto (spesso biopsie di biopsie sottocutanee [s.c.] e metastasi di linfonodi [LN]) nei supporti di stoccaggio del trasporto a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
   3. Per il tessuto biopsia del nucleo, lavare un cilindro (core) di tessuto di circa 10 mm x 1 mm (spesso biopsie epatiche) in un tubo da 15 mL contenente 5 mL di supporti di stoccaggio del trasporto a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
   4. Per il tessuto di aspirato fine (FNA), mantenere una quantità molto piccola di tessuto (meno di 1 mm di dimensione) prelevato direttamente dal paziente in un ago e siringa a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
2. Consegnare il tessuto in supporti di stoccaggio di trasporto a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio nello stesso giorno o con spedizione notturna dopo l'escissione chirurgica o la biopsia. Elaborare il tessuto entro 1-2 h dalla consegna.

2. Elaborazione dei tessuti tumorali per l'impianto del topo

1. Escissione chirurgica o elaborazione chirurgica dei tessuti da biopsia
   1. Trasferire il tessuto in una parabola Petri sterile e separare il tessuto tumorale dal tessuto normale circostante il più possibile.
   2. Rimuovere il tessuto necrotico (di solito identificato come tessuto pallido situato in posizione centrale all'interno del tumore) dal tumore rimanente il più possibile.
   3. Utilizzare un bisturi per suddividere un pezzo di tumore iniziale in pezzi approssimativi (3 mm x 3 mm) per l'impianto chirurgico del mouse (Figura 2).
   4. Facoltativamente, se è disponibile un numero sufficiente di tessuto tumorale, bloccare il tessuto per i saggi a valle (sequenziamento dell'RNA [RNASeq], sequenziamento dell'intero esoma [WES], ecc.).
   5. Fare un liquame tumorale da maciacquare il tessuto tumorale utilizzando una tecnica di lama trasversale con due lame del bisturi. Tritare i pezzi tumorali il più finemente possibile per formare un liquame, che è ora pronto per l'impianto chirurgico del topo.
   6. In alternativa, se il tessuto tumorale è troppo duro per la dissociazione meccanica, utilizzare una procedura di dissociazione di digestione per formare liquami gel-like e una sospensione unicellulare per l'impianto e/o l'iniezione.
      1. Tritare i pezzi tumorali il più finemente possibile per formare liquami.
      2. Mettere il liquame in un tubo da 50 mL con soluzione di sale bilanciato a freddo(HBSS)^-/- (senza Ca e Mg); quindi, centrifugare e pellet a 220 x g per 4 min a 4 gradi centigradi.
      3. Risospendere il liquame in 10 mL di supporti freschi di digerimento riscaldati (200 U/mL collagenase IV - 5 mM CaCl₂ - 50 U/mL DNase in HBSS^-/-) per 1 g di tessuto tumorale.
      4. Mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 20 minuti e mescolare vigorosamente ogni 5 min con una pipetta usa e getta.
      5. Lavare con fino a 50 mL di HBSS^-/-; quindi, centrifugare a 220 x g per 4 min a 4 gradi centigradi.
      6. Aggiungere 5 mL di TEG preriscaldato (0,025% di trypsin , 40 g/mL etilene glicol-bis(etere di amminogenie)-N,N,N',N'-acido tetraceo [EGTA] - 10 g/mL di alcol polivinino [PVA]) per 1 g di tumore, resossare/agitare delicatamente e mettere il tubo a 37 gradi centigradi per 2 min senza mescolare.
      7. Aggiungere almeno 1 volume uguale di supporti di colorazione a freddo (1% albumina di siero bovino [BSA] - 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid [HEPES] - 1x penicillina-streptomycin nei media L15) per districare la trippsina e centrifugaa a 220 x g per 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min sec.
      8. Risospendere il campione in 10 mL di supporti di colorazione per 1 g di tessuto tumorale e filtrarlo attraverso un colino cellulare di 40 m per ottenere una sospensione a singola cellula per l'iniezione del topo (Figura 2).
      9. Lo slurry che rimane sopra il colino cellulare può anche essere raccolto per l'impianto chirurgico del topo.
2. C elaborazione del tessuto da biopsia del minerale
   1. Versare il tessuto cilindro centrale nel tubo di trasporto dei tessuti in una parabola Petri di 5 cm.
   2. Rimuovere il liquido in eccesso, raschiare il tessuto sul bordo della parabola di Petri, tritare finemente il tessuto tumorale, aggiungere 100–150 dollari di HBSS^-/- sopra il tessuto tumorale e disegnare rapidamente la sospensione HBSS/ tessuto nella siringa da 1 mL.
   3. Attaccare un ago da 23 G alla siringa da 1 mL, passare la sospensione del tessuto HBSS/tumore attraverso l'ago in un tubo di spin da 1,5 ml.
   4. Ridisegnare la sospensione del tumore nella siringa con l'ago ancora acceso fino a quando non può passare senza intoppi attraverso l'ago.
   5. Infine reinserire la sospensione del tumore nella siringa e staccare l'ago da 23 G.
   6. Attaccare un ago da 27 G e disegnare nella siringa un volume uguale (100-150 USD) di matrice extracellulare artificiale (vedere Tabella deimateriali).
   7. Aggiungere un volume uguale di matrice extracellulare artificiale lentamente nel tubo di rotazione 1,5 mL con il tumore/HBSS^-/- sospensione, evitando con attenzione la formazione di bolle.
   8. Disegnare un'ultima volta di nuovo nella siringa e il tessuto tumorale biopsia nucleo è ora pronto per l'iniezione di topo.
3. Lavorazione dei tessuti FNA
   1. Posizionare la siringa contenente i campioni FNA (intrappolati nell'ago) sul ghiaccio.
   2. Separare l'ago (contenente il tessuto FNA) dalla siringa e rimuovere lo stantuffo dalla siringa, aggiungere l'aghino di HBSS^-/- alla parte superiore della siringa.
   3. Reinserire lo stantuffo nella siringa e nell'ago (contenente il tessuto FNA) e spingere fuori l'HBSS^-/- attraverso l'ago in un tubo di spin da 1,5 mL. Questo passo rimuove il tumore FNA dall'ago.
   4. Ripetere il passaggio 2.3.3 con la sospensione HBSS^-/-/FNA due volte utilizzando la stessa siringa per massimizzare il recupero del tessuto tumorale dall'ago.
   5. Aggiungete un volume uguale (100-150 dollari l) di matrice extracellulare artificiale al tubo di rotazione da 1,5 mL contenente la sospensione HBSS/FNA.
   6. Mescolare adeguatamente elaborando lentamente la matrice extracellulare artificiale/HBSS^-/-/FNA sospensione di nuovo nell'ago 23 G e ripetendo due volte.
   7. Disegnare l'intera matrice extracellulare artificiale/HBSS^-/-/FNA volume di nuovo nella siringa, sostituire l'ago 23 G con un ago 27 G, e il campione FNA è ora pronto per l'iniezione del mouse.

3. Impianto e iniezione di tumore nei topi

1. Impianto di escissione chirurgica o tessuto di biopsia chirurgica
   NOTA: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterili mediante autoclaving o l'uso di strumenti monouso pre-sterilizzati.
   1. Rasare i capelli dalla parte bassa della parte posteriore di NSG 6-8 settimana topi maschi o femmine lasciando una superficie di circa 1,5 cm x 3 cm senza capelli. Anestesizza i topi usando l'isoflurane e conferma la spremitura delicata del piede come prova di reattività. Utilizzare unguento veterinario sui loro occhi per evitare la secchezza.
   2. Mettere i singoli topi su un pad di calore nel cono naso della macchina per l'anestesia, strofinare l'area rasata con la clorhessia. Quindi dosare con 70% etanolo e lasciare evaporare.
   3. Preparare i blocchi o dividere i liquami tumorali in un piatto di Petri in singoli tumuli per l'impianto chirurgico (cioè in tre tumuli uguali se essere impiantati in 3 topi).
   4. Utilizzando la lama del bisturi, fare un'incisione di circa 5 mm di lunghezza sul centro della parte posteriore del mouse, prendere una coppia di pinze e sollevare la pelle sul lato dell'incisione opposta dell'operatore.
   5. Prendere le forbici nell'altra mano e separare la pelle dallo strato muscolare tagliando delicatamente la membrana fasciale con piccoli tagli a forbice, creando così una "tasca" per il tessuto tumorale.
   6. Raccogliere un pezzo di tumore o un singolo tumulo di tessuto tumorale litigio con la lama del bisturi e posizionare delicatamente il tessuto nella tasca creata.
   7. Amministrare 100 l di matrice extracellulare artificiale sul tumulo del tessuto tumorale in tasca.
   8. Utilizzando due coppie di pinze, tirare l'incisione su entrambe le estremità in modo che i bordi della ferita si chiudano e chiuda la ferita applicando una o due clip della ferita.
   9. Iniettare sottocutaneo 1-5 mg/kg di meloxicam come analgesico nei topi dopo l'intervento chirurgico.
   10. Togliere il mouse dal cono naso e rimetterlo nella sua gabbia originale, osservare il mouse mentre si sveglia. Non tornare in una gabbia fino a completa recupero.
   11. Rimuovere le clip della ferita dopo circa 7 giorni. Se la guarigione non è completa dopo 7 giorni, lascia la clip della ferita per altri uno o due giorni.
       NOTA: Se si utilizza una sospensione a singola cellula dall'escissione chirurgica o dall'elaborazione chirurgica del tessuto di biopsia, si mescolerà con la matrice extracellulare artificiale (al rapporto 1:1) per l'iniezione di topi.
2. Iniezione di FNA o tessuto biopsia di base
   1. Posizionare un mouse NSG su un rack griglia in acciaio, tenere saldamente il mouse dalla coda e tirare delicatamente il mouse indietro. Afferrerà saldamente la griglia con le zampe anteriori. In alternativa, trattenete un topo nella mano non dominante e lasciate visibile l'area del fianco.
   2. Disinfettare la pelle del fianco con tamponi di preparazione alcolica, iniettare lentamente e costantemente il contenuto della siringa sotto la pelle del topo.
   3. Estrarre l'ago e riporre il mouse nella sua gabbia.

4. Monitorare la crescita del tumore

1. Monitorare i topi una volta alla settimana per verificare la presenza di tumori palpabili.
2. Una volta che i tumori sono auna dimensione misurabile (circa 50 mm 3), utilizzare una pinza per registrare le dimensioni del tumore. Utilizzare la seguente formula per calcolare i volumi tumorali: (larghezza x larghezza x lunghezza) / 2.
3. Il tumore del raccolto una volta che il volume del tumore raggiunge circa 1,5 cm³ (circa 4-10 settimane). Il tumore è ora chiamato passaggio del topo 1 (MP1).

5. Tumore del raccolto per il tessuto bancario, il reimpianto e l'esperimento/caratterizzazione

1. Eutanasia topo in una camera di CO 2, controllare i segni vitali per confermare la morte, e poi immergere il topo in una soluzione Virkon per sterilizzare la pelle per 30 s nel bio-cabinet.
2. Utilizzare forbici curve e pinze chirurgiche per sollevare la pelle adiacente al tumore e fare un taglio orizzontale.
3. Utilizzare una tecnica di separazione contundente per mobilitare la pelle su entrambi i lati del tumore e sul tumore, esponendo il tumore.
4. Utilizzare le forbici o una lama bisturi per separare il tumore dalla fascia.
5. Ridigitare il tumore e trasferire il tumore in una parabola Petri sterile, tagliare il tumore a piccoli pezzi e rimuovere il tessuto necrotico dal tumore.
6. Tessuto tumorale della banca per un impianto futuro.
   1. Prendere 2-3 piccoli pezzi di tumore più piccoli di 10 mm x 10 mm e strazioarli in pezzi più piccoli di 1 mm x 1 mm.
   2. Trasferire tutto il tessuto macinato in una fiala criogenica da 2 mL, aggiungere 1 mL di supporti di congelamento (10% DMSO - 90% FBS).
   3. Mescolare bene e posizionare le fiale criogeniche in un contenitore pre-cooling a base di cellule a base di isopropanol su ghiaccio secco.
   4. Conservare il contenitore nel congelatore a -80 gradi centigradi durantela notte e quindi trasferire le fiale criogeniche nello stoccaggio di azoto liquido (LN 2).
7. Tessuto a congelamento a scatto per i saggi a valle (RNASeq, WES, ecc.).
   1. Mettere i pezzi di tessuto tumorale (3 mm x 3 mm) in una fiala criogenica e mettere immediatamente la fiala criogenica in LN_2. Conservare le fiale nel congelatore a -80 gradi centigradi.

6. Sperimentazioni di terapia PDX

NOTA: Ci vorranno due fasi di espansione per far crescere abbastanza tessuto tumorale da generare il numero necessario di topi con cuscinetti PDX per lo studio terapeutico.

1. Raccogliere un crioviale contenente il tessuto PDX bancato da LN₂e posizionare il crioviale in un bagno d'acqua di 37 gradi fino a quando il supporto di congelamento contenente il tessuto tumorale sta appena iniziando a sciogliersi.
2. Svuotare il contenuto del crioviale in HBSS preriscaldato^-/- in un tubo da 50 mL, e lavare il tessuto.
3. Tessuto di pellet per centrifugazione per 5 min a 1.200 giri/mm.
4. Rimuovere HBSS^-/- dal campione di tumore per aspirazione sottovuoto con un pipet Pasteur.
5. Far scorrere il tessuto PDX dal tubo da 50 mL in una parabola Petri di 5 cm o 10 cm e mettere sul ghiaccio bagnato.
6. Segui il protocollo di impianto di cui sopra per impiantare il tessuto bancato da una fiala criogenica in 5 topi NSG per il primo ciclo di espansione del tumore PDX.
7. Una volta che i tumori raggiungono i 600-800 mm³, raccogliere 1-2 tumori per ottenere una sospensione a singola cellula con il protocollo di cui sopra per l'elaborazione dei tessuti tumorali: dissociazione meccanica, procedura di dissociazione di dissociazione della disgestione di collagenase.
8. Cellule di pellet e resospendono in 6 mL di HBSS^-/-/artificial extracellular matrix (rapporto 1:1), topi sottocutanei per l'iniezione da 50 NSG, con 100 l una di miscela cellulare per topo per il secondo ciclo di espansione del tumore della PDX.
9. Misurare le dimensioni del tumore con pinze bisettimanali.
10. Attendere un tumore di 100 mm³ in 3-5 settimane, randomizzare i topi in gruppi, e iniziare il trattamento.
11. Quando la dimensione del tumore raggiunge il volume massimo approvato da IACUC, interrompere il trattamento.
12. Seguire il protocollo di tumore raccolto di cui sopra per raccogliere pezzi di tumore congelato snap, pezzi di tumore per blocchi di paraffina.

Results

Il tessuto tumorale per i modelli di melanoma PDX può provenire da una varietà di fonti diverse e può anche essere elaborato in base alla dinamica di crescita dei singoli modelli e all'uso desiderato del tessuto PDX. La priorità quando si stabilisce un modello PDX è quella di avere materiale sufficiente per l'uso futuro e DNA per la caratterizzazione (Figura 1).

Una volta che il materiale sufficiente è incassato, il tessuto tumorale può essere espanso in uno dei t...

Discussion

Abbiamo descritto la generazione di modelli PDX di melanoma con tessuto paziente derivato da tumori primari e metastatici, biopsie core e FNA. Quando direttamente innestati in topi NSG, tumori presentano proprietà morfologiche, genomiche e biologiche simili a quelle osservate nel paziente. Nel caso in cui solo una piccola quantità di tessuto sia disponibile per i ricercatori, come spesso accade con i FNA, la tecnica PDX consente l'espansione del tessuto tumorale per la caratterizzazione del DNA, dell'RNA e delle proteine...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (senza Ca++ o Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2,5% tripsina	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquote conservate presso – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Clorexidina	Fisher Scientific Cat	# 50-118-0313
Collagenasi IV (2.000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- da stock di polvere Collagenase IV (Worthington #4189, u/mg indicato sul flacone e varia con ogni lotto); congelare 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (glicole etilenico bis(2-amminoetiletere)-N,N,N' Acido N'-tetraacetico)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicina	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurano	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
I supporti L15 di Leibovitz	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Matrice extracellulare artificiale
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, come antidolorifico
NOD/SCID/IL2-recettore nullo (NSG) Topi	The Wistar Institute, allevamento di strutture
PVA (alcol polivinilico)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X con L-Glutammina	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Clip per ferite	MikRon	Cat #427631