Le linee cellulari primarie o consolidate sono comunemente utilizzate per affrontare questioni biologiche e meccanicistiche fondamentali come approccio iniziale prima di utilizzare modelli animali. Questo protocollo descrive come preparare estratti di cellule intere e frazioni subcellulari per studi di zinco (Zn) e altri oligoelementi con spettroscopia di assorbanza atomica.
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Articolo metodologico
Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metalli di transizione sono micronutrienti essenziali per gli organismi, ma possono essere tossici per le cellule ad alte concentrazioni competendo con i metalli fisiologici nelle proteine e generando stress redox. Le condizioni patologiche che portano alla deplezione o all'accumulo di metalli sono agenti causali di diverse malattie umane. Alcuni esempi includono l'anemia, l'enteropatica dell'acrodermatite e le malattie di Wilson e Menkes. È quindi importante essere in grado di misurare i livelli e il trasporto dei metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e accuratezza al fine di facilitare la ricerca esplorando come questi elementi contribuiscano alle normali funzioni fisiologiche e Tossicità. Lo zinco (Zn), ad esempio, è un cofattore in molte proteine dei mammiferi, partecipa a eventi di segnalazione ed è un messaggero secondario nelle cellule. In eccesso, Zn è tossico e può inibire l'assorbimento di altri metalli, mentre in deficit, può portare a una varietà di condizioni potenzialmente letali.
La spettroscopia di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) fornisce un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare Zn e altre concentrazioni di metalli di transizione in diversi campioni biologici. L'atomizzazione elettrotermica tramite GF-AAS quantifica i metalli atomizzando piccoli volumi di campioni per la successiva analisi selettiva dell'assorbimento utilizzando la lunghezza d'onda dell'eccitazione dell'elemento di interesse. Entro i limiti della linearità della legge della birra-Lambert, l'assorbanza della luce da parte del metallo è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'analita. Rispetto ad altri metodi per determinare il contenuto di Zn, GF-AAS rileva sia Zn libero e complessato in proteine e possibilmente in piccole molecole intracellulari con alta sensibilità in piccoli volumi di campione. Inoltre, GF-AAS è anche più facilmente accessibile rispetto alla spettrometria di massa plasmatica induttivamente accoppiata (ICP-MS) o alla fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone. In questo metodo, viene descritta la preparazione sistematica del campione di diverse linee cellulari coltivate per le analisi in un GF-AAS. Le variazioni di questo oligoelemento sono state confrontate sia nei lisati a cellule intere che nelle frazioni subcellulari di cellule proliferanti e differenziate come prova di principio.
Introduzione
La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell'ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l'esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L'acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle....
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Protocollo
1. coltura cellulare dei mammiferi
- Considerazioni generali
- Seguire le tecniche asettiche per la coltura cellulare dei mammiferi precedentemente recensiti38.
- Mantenere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato 5% CO2 a 37 ° c. Le condizioni di coltura delle celle variano per ogni tipo di cella. È importante mantenere condizioni di coltura appropriate per ogni linea cellulare utilizzata, poiché le variazioni di queste procedure porteranno a fenotipi aberranti e al fallimento della coltura cellulare.
- Assicurati di conoscere la linea cellulare di interesse e segui i p....
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Risultati
Abbiamo testato la capacità del GF-AAS di rilevare i livelli dei minuti di Zn nelle cellule di mammiferi (Figura 1). Così, abbiamo coltivato i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, e le linee cellulari stabilite N2A (neuroblastoma derivato), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitelio del seno), e cellule MDCK (epitelio del rene del cane). In primo luogo, abbiamo isolato le frazioni intere di cellule, citosoliche e nucleari di tutti questi tipi .......
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Discussione
La spettroscopia di assorbanza atomica è un metodo altamente sensibile per la quantificazione di Zn in piccoli campioni biologici di volume/massa. L'ottimizzazione descritta della misura Zn rende semplice l'applicazione di questo metodo e garantisce condizioni analitiche ideali. Qui, utilizzando GF-AAS, abbiamo determinato la concentrazione di Zn in cellule intere, e in frazioni citosoliche e nucleari, da diverse linee cellulari. I risultati dimostrano che questa tecnica rende paragonabile a quelle ottenute da sonde fluo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla facoltà diversità studiosi Award dalla University of Massachusetts Medical School a T.P.-B. N.N.-T. è supportata da SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N è supportato dalla National Science Foundation Grant DBI 0959476. Gli autori sono grati al dottor Daryl A. bosco per aver fornito la linea cellulare N2A e a Daniella Cangussu per il suo supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-isobutile-1-metilxantina | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acido acetico | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-anticorpo (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulina-anticorpo (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Desametasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Fattore di crescita epidemale (EGF)Siero | bovino Sigma Aldrich | E9644 | |
| (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fattore di crescita fibroblastico-Basico (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | Siero PHG0024 | |
| cavallo | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Idrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Perossido di idrogeno (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulina | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulina-Transferrina-Selenio-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Acido nitrico (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Terreni di siero ridotti) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillina-Streptomicina | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagene) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Acido rezionale | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso | fenoloThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinco (Zn) puro a elemento singolo, 1.000 & micro; g/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | Collezione di colture di tipo americano | CL-173 | |
| MCDK | Collezione di colture di tipo americano | CCL-34 | |
| MCF10A | Collezione di colture di tipo americano | CRL-10317 | |
| N2A | Americano Tipo Collezione di colture | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Spettrofotometro ad assorbimento atomico | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
Riferimenti
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, ....
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Ristampe e permessi
