Articolo metodologico

Navigazione MARRVEL, uno strumento basato sul Web che integra la genomica umana e le informazioni di genetica degli organismi modello

DOI:

10.3791/59542

⸱

15 agosto 2019

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 6Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 7Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per accedere e analizzare in modo efficiente molti database di organismi umani e modelli. Questo protocollo dimostra l'uso di MARRVEL per analizzare le varianti candidate che causano malattie identificate dagli sforzi di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

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Attraverso il sequenziamento dell'intero esoma/genoma, i genetisti umani identificano varianti rare che si segregano con i fenotipi della malattia. Per valutare se una variante specifica è patogena, è necessario interrogare molti database per determinare se il gene di interesse è collegato a una malattia genetica, se la variante specifica è stata segnalata in precedenza e quali dati funzionali sono disponibili nell'organismo modello database che possono fornire indizi sulla funzione del gene nell'uomo. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) è uno strumento di raccolta dati unico per geni e varianti umani e dei loro geni ortologhi in sette organismi modello, tra cui topo, ratto, pesce zebra, mosca della frutta, verme di nematodi, fissione lievito e lievito in erba. In questo protocollo, forniamo una panoramica di ciò che MARRVEL può essere utilizzato per e discutere come diversi set di dati possono essere utilizzati per valutare se una variante di significato sconosciuto (VUS) in un gene noto che causa la malattia o una variante in un gene di significato incerto (GUS) può essere Patogeni. Questo protocollo guiderà l'utente attraverso la ricerca di più database umani contemporaneamente a partire da un gene umano con o senza una variante di interesse. Discutiamo anche su come utilizzare i dati da OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV e DECHIPHER. Inoltre, illustriamo come interpretare un elenco di geni candidati ortologi, modelli di espressione e termini GO in organismi modello associati ad ogni gene umano. Inoltre, discutiamo del valore delle annotazioni del dominio strutturale delle proteine fornite e spieghiamo come utilizzare la funzione di allineamento delle proteine di più specie per valutare se una variante di interesse influisce su un dominio evolutivamente conservato o aminoacido. Infine, discuteremo tre diversi casi d'uso di questo sito web. MARRVEL è un sito web ad accesso aperto facilmente accessibile progettato sia per i ricercatori clinici che per i ricercatori di base e funge da punto di partenza per la progettazione di esperimenti per studi funzionali.

Introduzione

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L'uso della tecnologia di sequenziamento di nuova generazione si sta espandendo sia nella ricerca che nei laboratori genetici clinici1. Le analisi dell'intero esoma (WES) e del sequenziamento dell'intero genoma (WGS) rivelano numerose rare varianti di significato sconosciuto (VUS) nei geni noti che causano malattie, nonché varianti nei geni che devono ancora essere associati a una malattia mendeliana (GUS: geni di incerti significatività). Presentato con un elenco di geni e varianti in un rapporto di sequenza clinica, i genetisti medici devono visitare manualmente più risorse online per ottenere maggiori informazioni per valutare quale variante può essere responsabile di un certo fenotipo visto nel paziente di interesse . Questo processo richiede molto tempo e la sua efficacia dipende fortemente dall'esperienza dell'individuo. Anche se sono stati pubblicati diversi articoli di linee guida2,3, l'interpretazione di WES e WGS richiede la cura manuale poiché non esiste ancora una metodologia standardizzata per l'analisi delle varianti. Per l'interpretazione del VUS, le conoscenze sulla relazione genotipo-fenotipo precedentemente segnalata, sulla modalità di eredità e sulle frequenze degli alleli nella popolazione generale diventano preziose. Inoltre, la conoscenza se la variante colpisce un dominio proteico critico, o un residuo evolutivamente conservato può aumentare o diminuire la probabilità di patogenicità. Per raccogliere tutte queste informazioni, è in genere necessario navigare attraverso 10-20 database di organismi umani e modello poiché le informazioni sono sparse attraverso il World Wide Web.

Allo stesso modo, gli scienziati di organismi modello che lavorano su geni e percorsi specifici sono spesso interessati a collegare le loro scoperte ai meccanismi delle malattie umane e desiderano sfruttare le conoscenze che vengono generate nel campo della genomica umana. Tuttavia, a causa della rapida espansione ed evoluzione dei set di dati relativi al genoma umano, è stato difficile identificare database che forniscono informazioni utili. Inoltre, poiché la maggior parte dei database modello di organismi sono progettati per i ricercatori che lavorano con l'organismo specifico su base giornaliera, è molto difficile, ad esempio, per un ricercatore di topi cercare informazioni specifiche in un database di Drosophila e viceversa. Simile alla ricerca di interpretazione della variante effettuate dai genetisti medici, l'identificazione di informazioni utili sull'uomo e su altri organismi modello è dispendioso in termini di tempo e fortemente dipendente dallo sfondo del ricercatore dell'organismo modello. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration)4 è uno strumento progettato per entrambi i gruppi di utenti per semplificare il flusso di lavoro.

MARRVEL (http://marrvel.org) è stato progettato come un motore di ricerca centralizzato che raccoglie i dati in modo sistematico e coerente per medici e ricercatori. Con informazioni da 20 o più database pubblicamente disponibili, questo programma consente agli utenti di raccogliere rapidamente informazioni e accedere a un gran numero di database di esseri umani e di organismi modello senza ricerche ripetitive. Le pagine dei risultati di ricerca contengono anche collegamenti ipertestuali alle fonti di informazioni originali, consentendo agli utenti di accedere ai dati grezzi e raccogliere informazioni aggiuntive fornite dalle fonti.

A differenza di molti degli strumenti di definizione delle priorità varianti che richiedono l'input di dati di sequenziamento di grandi dimensioni sotto forma di file VCF o BAM e installazioni di software spesso proprietario/commerciale, MARRVEL opera su qualsiasi browser web. Può essere utilizzato gratuitamente e compatibile con dispositivi portatili (ad esempio smartphone, tablet) finché si è connessi a Internet. Abbiamo scelto questo formato poiché molti medici e ricercatori in genere hanno bisogno di cercare uno o pochi geni e varianti alla volta. Si noti che stiamo sviluppando funzionalità di download in batch e API (application programming interface) per MARRVEL per consentire alla fine agli utenti di curare centinaia di geni e varianti alla volta attraverso strumenti di query personalizzati, se necessario.

Grazie all'ampia gamma di applicazioni, in questo protocollo verrà descritto un approccio ampiamente globale su come spostarsi tra diversi set di dati visualizzati da MARRVEL. Esempi più mirati su misura per le esigenze specifiche degli utenti saranno descritti nella sezione Risultati rappresentativi. È importante notare che l'output di MARRVEL richiede ancora un certo livello di conoscenze di base nella genetica umana o negli organismi modello per estrarre informazioni preziose. I lettori fanno riferimento alla tabella che elenca i documenti principali che descrivono la funzione di ciascuno dei database originali che sono curati da MARRVEL (Tabella 1). Il seguente protocollo è suddiviso in tre sezioni: (1) Come iniziare una ricerca, (2) come interpretare i risultati di genetica umana MARRVEL e (3) come utilizzare i dati dell'organismo modello in MARRVEL. Nella sezione Risultati rappresentativi vengono descritti approcci più mirati e specifici. MARRVEL è attivamente aggiornato, quindi si prega di fare riferimento alla pagina FAQ del sito web corrente per i dettagli sulle fonti di dati. Consigliamo vivamente agli utenti di MARRVEL di registrarsi per ricevere notifiche di aggiornamento tramite il modulo di invio e-mail nella parte inferiore della home page di MARRVEL.

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Protocollo

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1. Come iniziare una ricerca

  1. Per il gene umano e la ricerca basata sulle varianti, andare ai passaggi 1.1.1.-1.1.2. Per la ricerca umana basata su geni (nessun input di variante), andare al passaggio 1.2. Per la ricerca basata su geni dell'organismo modello, fare riferimento ai passaggi 1.3.1.-1.3.2.
    1. Vai alla home page di MARRVEL4 allhttp://marrvel.org/. Inizia inserendo un simbolo genetico umano. Assicurarsi che i nomi dei geni candidati siano elencati sotto la casella di input per ogni voce di carattere. Se la ricerca risulta negativa, assicurarsi che il simbolo genico utilizzato sia aggiornato utilizzando il sito web5 (HGNC; https://www.genenames.org/) del Comitato per la nomenclatura del gene HUGO.
    2. Immettere una variante umana. La barra di ricerca è compatibile con due tipi di nomenclatura delle varianti: la posizione del genoma simile a quella delle varianti vengono visualizzate su ExAC e GnomAD6 e la nomenclatura basata sulla trascrizione secondo le linee guida HGVS. Esempi di tali formati sono visualizzati in testo grigio all'interno della casella di ricerca. Per la nomenclatura genomica, utilizzare le coordinate in base a hg19/GRCh37. Procedere al passaggio 2.
      NOTA: Se una ricerca restituisce un errore, i problemi più comuni sono il simbolo genico non aggiornato o la nomenclatura della variante non è corretta. In questi casi, i siti Web HGNC (https://www.genenames.org/), Mutalyzer7 (https://www.mutalyzer.nl/) e TransVar8 (https://bioinformatics.mdanderson.org/transvar/) sono ottime risorse per correggere l'errore. HGNC fornisce simboli genici ufficiali e i loro alias per tutti i geni umani.
    3. Se i messaggi di errore continuano a riscontrare messaggi di errore dopo aver confermato che il nome del gene è aggiornato, utilizzare Mutalyzer e TransVar per controllare e convertire la nomenclatura delle varianti.
    4. In alcune situazioni, ad esempio una modifica molto recente del simbolo genico in HGNC, provare a utilizzare un sinonimo per il gene e contattare il team operativo di MARRVEL utilizzando la scheda "Feedback" in modo da aggiornare i dati di origine, in quanto MARRVEL potrebbe non fornire le informazioni corrette a causa di un ritardo nei dati data.
  2. Inserisci un simbolo del gene umano e lascia vuota la barra di ricerca delle varianti umane. Se si verifica un errore, andare all'HGNC (https://www.genenames.org/) per verificare la presenza del simbolo genico ufficiale o provare un simbolo genetico più vecchio.
    1. Fare clic sulla scheda Ricerca organismi modello nel banner superiore (Figura 1) o passare a http://marrvel.org/model. Selezionare l'organismo modello di scelta e immettere un simbolo genico dell'organismo modello. Fare clic sul simbolo del gene quando il nome viene completato automaticamente e quindi fare clic su Cerca. Se il risultato della ricerca è negativo, controllare il simbolo genetico ufficiale utilizzato nelle banche dati degli organismi modello (Tabella 1).
    2. Se il risultato della ricerca è ancora negativo, accedere diSTA-EOPT (DRSC Integrative Ortholog Prediction Tool, https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl) e HCOP (https://www.genenames.org/tools/hcop/) per valutare se non sono presenti ortologhi il gene di interesse. DIOPT è un motore di ricerca di previsione ortologo gestito dal DRSC (Drosophila RNAi Screening Center) e HCOP è una suite simile sviluppata da HGNC.
      NOTA: ulteriori ricerche che utilizzano BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) possono consentire agli utenti di trovare ortologi che potrebbero essere persi dagli algoritmi di stima utilizzati in DIOPT e HCOP.
    3. Fare clic sul MARRVEL in basso per l'ortologo umano previsto di scelta. Controllare il punteggio DIOPT9 e il miglior punteggio dal gene umano all'organismo modello? per la selezione del gene umano. Procedere al passaggio 2.
      NOTA: Il punteggio DIOPT9 (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl) è un valore di quanti algoritmi di previsione ortologeria predicono che una coppia di geni in due organismi sia ortologa l'uno con l'altro. Per ulteriori informazioni su questi valori e sugli algoritmi specifici utilizzati per calcolare questo punteggio, fare riferimento a Hu et al9. Quando il punteggio migliore dal gene umano all'organismo modello? è Sì, indica che il gene umano è più probabile un vero ortologo umano del gene di interesse, ma ci potrebbero essere eccezioni, soprattutto quando più geni umani sono ortologhi più geni dell'organismo modello a causa di eventi di duplicazione genica durante l'evoluzione. Se il gene di interesse è membro di una famiglia genica complessa che ha subito un'evoluzione divergente in più specie, gli utenti devono identificare una pubblicazione che ha eseguito un'ampia analisi filogenetica della famiglia genica di interesse per identificare probabile gene candidato dell'ortologeo.

2. Come interpretare i risultati di genetica umana MARRVEL per una ricerca genica e variante

NOTA: nella pagina dei risultati sono visualizzati sette database umani (Tabella 1, Figura 1). Per ogni casella di output, è presente un pulsante Collegamento esterno (piccolacasella con una freccia diagonale)nell'angolo superiore destro che verrà collegato al database originale per ulteriori dettagli.

  1. Fare clic su OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, https://www.omim.org/)10, il primo database visualizzato.
    NOTA: OMIM è un database curato manualmente che aggrega e riepiloga le informazioni sulle malattie genetiche e sui tratti nell'uomo.
    1. Utilizzare la casella Descrizione del gene umano dell'OMIM per un breve riepilogo di ciò che è noto sul prodotto genico e genetico.
    2. Utilizzare la casella Relazioni gene-fenotipo per determinare se questo gene è un gene noto che causa la malattia o meno. Questa casella fornisce associazioni di malattie note o fenotipi curate manualmente con il gene di interesse.
    3. Utilizzare la casella Alleli segnalati da OMIM per ottenere un elenco di varianti patogene curate da OMIM.
      NOTA: Poiché la cura manuale di una pubblicazione riguardante la scoperta di una nuova malattia genetica è necessaria affinché qualsiasi associazione di malattie genetiche compaia in OMIM, un certo ritardo temporale e/o pubblicazioni perse può portare a un equivoco. È consigliabile che gli utenti eseguano ricerche PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) anche per esaminare la letteratura recente (vedere la pagina 4.1.2.). Per ulteriori informazioni curate in OMIM, fare riferimento a Amberger10,11.
  2. schioccareExAC(Exome Aggregation Consortium, http://exac.broadinstitute.org/)6e gnomAD(genome Aggregation Database, http://gnomad.broadinstitute.org/), grandi database genomici della popolazione basati su WES e WGS di persone che sono selezionate per escludere gravi malattie pediatriche.
    NOTA: ExAC contiene 60.000 WES, mentre gnomAD contiene 120.000 WES e 15.000 WGS. Sia ExAC e gnomAD può essere utilizzato come un database di popolazione di controllo, soprattutto per gravi disturbi pediatrici, ma la sua interpretazione richiede un certo grado di cautela. In generale, gnomAD può essere considerato come una versione aggiornata ed espansa di ExAC poiché la maggior parte delle coorti incluse in ExAC è inclusa anche in gnomAD. Tuttavia, poiché esistono alcune eccezioni (vedere le informazioni di coorte rispettivamente nelle http://exac.broadinstitute.org/about e http://gnomad.broadinstitute.org/about), MARRVEL visualizza i dati provenienti da entrambe le origini.
    1. Utilizzare la casella Control Population Gene Summary per ottenere statistiche a livello genico, ad esempio la probabilità di trovare gli alleli di perdita di funzione (LOF) nella popolazione generale. Questo è chiamato il punteggio pLI (probabilità di intolleranza LOF) in ExAC e può essere utilizzato per dedurre quanto probabile una singola copia di un allele LOF per un gene specifico può causare una malattia dominante attraverso meccanismi aplo-insufficienti.
      NOTA: Guardando il punteggio pLI di un gene ha valore, soprattutto quando si tratta di disturbi dominanti che presentano come gravi malattie pediatriche associate alle varianti de novo. Se un gene ha un punteggio di pLI di 0,00, significa che è altamente tollerante nei pressisti delle varianti LOF, quindi il gene improbabile causa di malattia attraverso un meccanismo dominante di aploinsufficienza. Ciò, tuttavia, non esclude necessariamente che altri meccanismi dominanti di funzione (GOF) o mediati negativi dominanti possano causare malattie. Inoltre, i geni che causano le malattie recessive possono avere punteggi bassi di PLI poiché ci si aspetta che le carriere si trovino nella popolazione generale. D'altra parte, se un gene ha un punteggio pLI di 1,00, è possibile che la perdita di una copia di questo gene sia dannosa per la salute umana. Ulteriori ricerche in siti web come DOMINO (https://wwwfbm.unil.ch/domino/) possono essere utilizzate anche in combinazione per valutare la probabilità di una variante in un gene specifico che causa un disturbo dominante.
    2. Utilizzare le due caselle successive per ottenere le frequenze alleli della variante di interesse in ExAC e gnomAD, rispettivamente per aiutare a interpretare se la variante può essere patogena a seconda se il paziente ha la malattia dominante o resimale. Questa casella verrà visualizzata solo quando l'utente immette informazioni sulle varianti quando viene eseguita l'avvio della ricerca.
      NOTA: Se si ipotizza uno scenario di malattia recessiva e il punteggio pLI del gene di interesse è basso, si dovrebbe prestare attenzione alla frequenza allele elencata qui. Alcuni genetisti possono stabilire un punto di taglio da 0,005 a 0,0001 come frequenza massima di allele per le varianti patogene che possono causare una grave malattia ereditaria recessiva2. D'altra parte, se si ipotizza uno scenario di malattia dominante, è meno probabile trovare la variante identica o simile in una popolazione di controllo. Ancora una volta, questo richiede cautela perché gli individui con disturbi ad esordio tardivo, malattie con presentazione lieve, disturbi psichiatrici o malattie non sottoposte a screening dai ricercatori ExAC/gnomAD possono essere ancora inclusi e la variante può ancora essere un variante f. Inoltre, ci sono stati alcuni casi di varianti legate alle condizioni pediatriche trovate in alcuni individui in questi database12,13,14, potenzialmente a causa di penetrazione incompleta o mosaicismo somatico13 , 15 Mi lasa del sistema , 16.Inoltre, anche se ExAC e gnomAD mostreranno varianti che si trovano in uno stato omozino, non indicherà se una delle varianti si trovano in uno stato eterozio composto. Infine, alcune varianti trovate in questi database sono contrassegnate come scarsa fiducia a causa di sfide tecniche nel sequenziamento (ad esempio, copertura a bassa sequenza, sequenza ripetitiva). Per esaminare più attentamente questi set di dati, si consiglia agli utenti di utilizzare il pulsante di collegamento esterno per visitare i siti Web ExAC e gnomAD originali per ottenere ulteriori informazioni.
  3. Fare clic su Geno2MP (Genotype to Mendelian Phenotype Browser, http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/), una raccolta di dati basati su WES dall'Università di Washington Center for Mendelian Genetics. Contiene circa 9.600 esomi (al 1/18/2019) di individui affetti e parenti non interessati con alcune descrizioni fenotipiche (Figura 1).
    1. Utilizzare la casella Popolazione malattia per ottenere la frequenza allele della variante di interesse in questa coorte.
    2. Utilizzare la casella Relazioni Gene-Fenotipo per ottenere17 termini HPO (ontologia del fenotipo umano) per gli individui con la variante di interesse. Questo è uno dei tanti modi per uno di cercare i pazienti che possono avere la stessa malattia.
      NOTA: Se si sospetta che un gene di interesse sia associato alla malattia di un paziente e si trovano corrispondenze in Geno2MP, ulteriori informazioni importanti potrebbero essere presenti nell'origine dati oltre a ciò che viene visualizzato.
      1. Fare clic sul pulsante di collegamento esterno alla pagina gene-specific su Geno2MP, filtrare le mutazioni simili a quelle del paziente (ad esempio, missense, LOF) e rivedere attentamente gli elenchi delle varianti. Prendere nota delle varianti con alti punteggi CADD18 e fare clic nei profili HPO. Ad esempio, i punteggi CADD superiori a 20 sono all'interno dell'1% superiore di tutte le varianti previste per essere deleteri, punteggi CADD superiori a 10 sono all'interno del 10% superiore. I termini HPO forniscono una descrizione standardizzata dei fenotipi umani. Qui, assicurati di controllare se la variante è stata identificata in un individuo interessato o in un parente.
      2. Se le varianti si trovano in pazienti affetti nello stesso sistema di organi del paziente, prendere in considerazione l'utilizzo del modulo e-mail per contattare il medico che ha inviato questi casi a Geno2MP utilizzando la funzione fornita sul sito Web Geno2MP.
        NOTA: Non tutti i medici rispondono a tali domande, quindi si dovrebbe esplorare altre vie di matchmaking paziente. Altri modi per raccogliere una coorte di pazienti affetti dalle stesse malattie consiste nell'utilizzare strumenti quali GeneMatcher19 (https://www.genematcher.org/) e altri database che fanno parte del Matchmaker Exchange19,20 ( https://www.matchmakerexchange.org/). Vedere l'articolo di accompagnamento JoVE per ulteriori informazioni sul matchmaking21.
  4. Utilizzare la banca dati ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)22, supportata dai National Institutes of Health (NIH), dove ricercatori e medici presentano varianti con o senza determinazione della patogenicità, per il controllo varianti a singolo nucleotide (SNV), piccoli indel e varianti di numero di copie più grandi (CNV).
    1. Utilizzare la riga superiore per esaminare un riepilogo del numero di ogni tipo di varianti riportato in ClinVar (Figura 1).
    2. Selezionare l'elenco delle varianti riportato di seguito nella casella Alleli segnalati da ClinVar.
      NOTA: Se una variante è stata inclusa nella ricerca iniziale, le varianti evidenziate in teal sono tutte varianti che includono la posizione genomica della variante di interesse [comprese le grandi CnV, che sono spesso etichettate come; coordinata genomica... x1 (eliminazione) e ... x3 (duplicazione)].
  5. Utilizzare DGV23 (Database delle varianti genomiche, http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home) e DECIPHER24 (DatabasE della varIazione genomic e Fenotipo negli esseri umani utilizzando Ensembl Resources, https://decipher.sanger.ac.uk/), entrambi collezioni di CNV. DGV è la più grande collezione di accesso pubblico di varianti strutturali da più di 54.000 individui. Questo database include campioni di individui, riferiti, sani, al momento dell'accertamento, da un massimo di 72 studi diversi. Analogamente, i dati visualizzati da DECIPHER includono varianti comuni della popolazione di controllo.
    NOTA: poiché MARRVEL non dispone dell'autorizzazione per visualizzare i dati derivati dal paziente da DECIPHIER, gli utenti sono invitati a visitare direttamente il sito Web DECIPHER per accedere a informazioni CNV potenzialmente patogene.
    1. Fare clic sulla casella Copia variazione numero nella popolazione di controllo (database DGV) per ottenere varianti che contengono il gene di interesse. Informazioni quali la dimensione, il sottotipo e il riferimento della variante del numero di copia sono disponibili nella stessa casella.
    2. Fare clic sulla casella Varianti numero di copia comune (DECIPHER Database) per ottenere varianti che contengono la posizione genomica della variante di interesse. Queste informazioni possono aiutare a determinare se il gene è duplicato o eliminato negli individui di controllo.
      NOTA: Se il gene di interesse viene eliminato in molti individui nella popolazione di controllo, significa che è probabile che questo gene sia altamente tollerante nei punti LOF. Come i punteggi bassi di PLI, questo suggerisce che una singola perdita di copia di questo gene ha meno probabilità di causare una grave malattia tramite un meccanismo di aploinsufficienza. Questo, tuttavia, non esclude necessariamente altri guadagni dominanti di funzione o meccanismi negativi dominanti (ad esempio alleli antimorfici, ipermorfici e neomorfici) causati da specifici alleli di fraspremento e troncamento.  Le possibili limitazioni a questi dati includono variazioni nella fonte e nel metodo dei dati acquisiti, mancanza di informazioni sulla penetrazione incompleta di CPV patogeni e se gli individui hanno sviluppato determinate malattie dopo la raccolta dei dati.

3. Come utilizzare i dati dell'organismo modello in MARRVEL

  1. Utilizzare la tabella delle funzioni gene per ottenere le seguenti informazioni per otto organismi modello, tra cui umano (umano, ratto, topo, pesce zebra, Drosophila, C elegans, lievito in erba e lievito di fissione):
    1. Nome del gene: Poiché ogni nome genetico è collegato a pagine genetiche sui rispettivi database dell'organismo modello, fare clic su questi collegamenti per saperne di più sulle informazioni fenotipiche e sulle risorse disponibili per ogni organismo modello. Ad esempio su FlyBase25 (http://flybase.org/), ci sarà un elenco di tutti gli alleli che sono stati generati, i loro rispettivi fenotipi e la disponibilità di ogni allele dai centri di stock pubblici.
    2. Link PubMed: Clicca sul link PubMed per andare a un elenco di pubblicazioni che si riferisce al gene di interesse per ogni organismo. Senza l'uso di questi legami, la ricerca del gene umano direttamente in PubMed può portare alla mancanza di alcune pubblicazioni che hanno usato un vecchio alias genetico per riferirsi al gene umano. Allo stesso modo, i nomi genici dell'organismo modello possono aver fluttuato storicamente.
    3. DIOPTA 9 punteggio: Controllare questa colonna per un punteggio di quanti algoritmi di previsione ortologeria stimano che il gene sia probabilmente un ortologo del gene umano di interesse. Si può utilizzare un punteggio DIOPT di 3 o superiore come un ragionevole cut-off per identificare i candidati di ortologia solida. Tuttavia, ci sono casi in cui gli ortologhi genuini hanno solo un punteggio DIOPT pari a 1 a causa della limitata omologia. Nella parte superiore della tabella delle funzioni geniche, deseleziona la casella "Mostra solo il miglior gene del punteggio DIOPT" per visualizzare tutti i candidati che in genere includono geni omologhi che non sono necessariamente ortoghi.
    4. Espressione: Controllare questa colonna per l'elenco dei tessuti in cui il gene o la proteina di interesse è stato riportato per essere espresso in database di esseri umani o modelli. I dati sull'espressione dei geni umani e delle proteine provengono rispettivamente da GTEx26 (https://gtexportal.org/) e Human Protein Atlas27 (https://www.proteinatlas.org/). Alcuni hanno un pulsante con collegamenti pop-up, ad esempio per gli esseri umani e per volare che visualizzano il modello di espressione utilizzando una mappa termica, mentre altri sono collegati alle rispettive pagine di database dell'organismo del modello.
    5. Ontologia genetica 28 (GO) termini: Filtrare in base a codici di prova sperimentali e ottenere da rispettivi database di organismi umani o modello. I termini GO basati su "codici di prova di analisi computazionale" e "codici di prova di annotazione elettronica" (previsioni) non vengono visualizzati. Si prega di visitare ogni sito web dell'organismo modello per raccogliere queste informazioni, se necessario.
    6. Altri link come Monarch Initiative29 (https://monarchinitiative.org/) e IMPC30 (http://www.mousephenotype.org/): utilizzare il collegamento ipertestuale Monarch Initiative per navigare alla pagina Phenogrid per il gene umano specifico, un grafico che fornisce un rapido confronto tra i fenotipi associati al gene di interesse per le malattie umane conosciute e i mutanti dell'organismo modello che hanno sovrapposizioni fenotipiche. Se un gene del topo ha un topo knockout fatto o pianificato dall'International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC), l'"IMPC" si collega alla pagina che dettaglia il fenotipo del topo knockout e la sua disponibilità dai centri di stock pubblici.
  2. Umano Domini proteici: Utilizzare la casella dei domini proteici genetici umani per ottenere i domini proteici previsti del gene umano. I dati derivano da DIOPT, che utilizza Pfam (https://pfam.xfam.org/) e CCD (Conserved Domains Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). Un singolo residuo può essere annotato più di una volta a causa di una certa sovrapposizione nei domini annotati nelle due origini.
  3. Utilizzare la casella Allineamento di proteine multiple per ottenere l'allineamento multiplo di aminoacido generato da DIOPT9 che include umano (hs), ratto (rn), mouse (mm), pesce zebra (dr), mosca della frutta (dm), verme (ce) e lieviti (sc e sp). Per evidenziare l'amminoacido di interesse, scorrere verso il basso fino alla fine della casella e immettere i numeri di aminoacidi sotto e gli aminoacidi di interesse saranno evidenziati in verde acqua. L'allineamento è fornito da DIOPT e utilizza l'allineatore MAFFT (programma di allineamento multiplo per sequenze di aminoacidi o nucleotidi, https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/31).
    NOTA: Se l'amminoacido evidenziato in base al numero non è quello previsto, potrebbe essere dovuto a diversi isoformi di giunzione utilizzati per l'allineamento. In linea di principio, DIOPT utilizza l'isoforme più lunga per essere visualizzato in questa casella. Inoltre, per i segmenti di geni che non sono ben conservati, l'allineamento delle sequenze multispecie utilizzando parametri predefiniti potrebbe non essere ottimale. Si consiglia di utilizzare altri siti web e software come Clustal Omega e ClustalW/X (http://www.clustal.org/)32 per ottimizzare i parametri di allineamento e le matrici di conseguenza.

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Risultati

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Genetisti umani e scienziati dell'organismo modello utilizzano ciascuno MARRVEL in modi distinti, ognuno con diversi risultati desiderati. Di seguito sono riportate tre vignette di possibili usi per MARRVEL.

Valutazione della patogenicità di una variante in una malattia dominante
La maggior parte degli utenti che visitano MARRVEL utilizzano questo sito web per analizzare la probabilità che una variante umana rara può causare una certa malattia. Ad esempio, una variante erra...

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Discussione

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I passaggi critici di questo protocollo includono l'input iniziale (passaggi 1.1-1.3) e la successiva interpretazione dell'output. Il motivo più comune per cui i risultati della ricerca sono negativi è a causa dei molti modi in cui un gene e/o una variante possono essere descritti. Mentre MARRVEL viene aggiornato su base pianificata, questi aggiornamenti possono causare disconnessioni tra i diversi database a cui MARRVEL si collega. Pertanto, il primo passo nella risoluzione dei problemi consiste in vari a controllare se...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i dottori Rami Al-Ouran, Seon-Young Kim, Yanhui (Claire) Hu, Ying-Wooi Wan, Naveen Manoharan, Sasidhar Pasupuleti, Aram Comjean, Dongxue Mao, Michael Wangler, Hsiao-Tuan Chao, Stephanie Mohr e Norbert Perrimon per il loro sostegno allo sviluppo e allo sviluppo e manutenzione di MARRVEL. Siamo grati a Samantha L. Deal e J. Michael Harnish per il loro contributo su questo manoscritto.

Lo sviluppo iniziale di MARRVEL è stato sostenuto in parte dal Centro di screening degli organismi modello di rete delle malattie non diagnosticate attraverso il NIH Commonfund (U54NS093793) e attraverso l'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (ORIP) (R24OD022005). JW è supportato dal NIH Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development (F30HD094503) e dal Robert and Janice McNair Foundation McNair MD/PhD Student Scholar Program presso BCM. HJB è inoltre supportato dal NIH National Institute of General Medical Sciences (R01GM067858) ed è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute. L è supportato dal NIH National Institute of General Medical Science (R01GM120033), dal National Institute of Aging (R01AG057339) e dalla Huffington Foundation. SY ha ricevuto ulteriore sostegno dal NIH National Institute on Deafness and other Communication Disorders (R01DC014932), la Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), l'Alzheimer's Association (New Investigator Research Grant: 15-364099), Naman Family Fondo per la ricerca di base e Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Genetica umanaClinVarPMID: 29165669 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
Genetica umanaDECIPHERPMID: 19344873 https://decipher.sanger.ac.uk/
Genetica umanaDGVPMID:  24174537http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
Previsione dell'ortologiaDIOPTPMID: 21880147 https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Gene/Trascrizione umana NomenclaturaEnsemblPMID: 29155950 https://useast.ensembl.org/
Genetica umanaExAC PMID: 27535533http://exac.broadinstitute.org/
Database di organismi modello primariFlyBase (Drosophila)PMID:26467478http://flybase.org
Strumenti di integrazione del database di organismi modelloGene2Function PMID: 28663344http://www.gene2function.org/search/
Human GeneticsGeno2MPN/Ahttp://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/
Genetica umanagnomADPMID: 27535533 http://gnomad.broadinstitute.org/
Gene OntologyGO CentralPMID: 10802651, 25428369 http://www.geneontology.org/
Espressione genica/proteica umanaGTExPMID: 29019975, 23715323 https://gtexportal.org/home/
Nomenclatura dei geni umaniHGNCPMID: 27799471 https://www.genenames.org/
Database di organismi modello primariIMPC (topo)PMID: 27626380 http://www.mousephenotype.org/
Database di organismi modello primariMGI (topo)PMID:25348401Strumenti di
integrazione del database di organismi modelloMonarch Initiative: 27899636https://monarchinitiative.org/
Human Variant NomenclatureMutalyzerPMID: 18000842 https://mutalyzer.nl/
Genetica UmanaOMIMPMID: 28654725https://omim.org/
Database di organismi modello primariPomBase (lievito di fissione)PMID:22039153https://www.pombase.org/
LetteraturaPubMedN/Ahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Database di organismi modello primariRGD (ratto)PMID:25355511https://rgd.mcw.edu/
Database di organismi modello primariSGD (lievito in gemmazione)PMID: 22110037https://www.yeastgenome.org/
Espressione genica/proteina umanaL'atlante delle proteine umanePMID: 21752111https://www.proteinatlas.org/
Database di organismi modello primariWormBase (C. elegans)PMID:26578572http://wormbase.org
Database di organismi modello primariZFIN (zebrafish)PMID:26097180https://zfin.org/
http://www.informatics.jax.org/

Riferimenti

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