Method Article

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

DOI:

10.3791/59544

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April 23rd, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.

Abstract

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Cholangiopathies, che interessano i dotti biliari extrahepatic (EHBDs), includono atresia biliare, colangite sclerosante primitiva e colangiocarcinoma. Non hanno nessuna opzione terapeutica efficace. Strumenti per studiare EHBD sono molto limitati. Il nostro scopo era di sviluppare un modello dei colangiociti preclinici, derivati da cellule staminali organo-specifiche, versatile, adulto che può essere facilmente generato da wild type e topi geneticamente modificati. Quindi, segnaliamo sulla nuova tecnica di sviluppare un sistema di coltura EHBD organoid (EHBDO) da EHBDs di topo adulto. Il modello è costo-efficiente, in grado di essere facilmente analizzati, e ha molteplici applicazioni a valle. In particolare, descriviamo la metodologia di isolamento EHBD mouse e dissociazione singola cella, organoid cultura iniziazione, propagazione e mantenimento a lungo termine e deposito. Questo manoscritto descrive anche EHBDO elaborazione per immunoistochimica, microscopia fluorescente e quantificazione di abbondanza del mRNA da reazione a catena della polimerasi in tempo reale di trascrizione d'inversione quantitativa (qRT-PCR). Questo protocollo ha significativi vantaggi oltre a produrre organoids EHBD specifici. L'uso di un medium condizionato dalle cellule L-WRN riduce significativamente il costo di questo modello. L'uso del mouse EHBDs fornisce quasi illimitato del tessuto per la generazione di cultura, a differenza di tessuto umano. EHBDOs del mouse generati contengono una popolazione pura di cellule epiteliali con marcatori del progenitore endodermico e biliare cellule differenziate. Colta organoids mantenere omogenea morfologia attraverso passaggi multipli e possono essere recuperate dopo un lungo periodo di conservazione in azoto liquido. Il modello consente lo studio di proliferazione delle cellule progenitrici biliare, può essere manipolato farmacologicamente e può essere generato da topi geneticamente modificati. Gli studi futuri sono necessari per ottimizzare le condizioni di coltura al fine di aumentare l'efficienza di placcatura, valutare la maturità funzionale delle cellule e differenziazione cellulare diretto. Sviluppo di modelli di co-coltura e una matrice extracellulare più biologicamente neutra sono anche auspicabile.

Introduction

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Cholangiopathies sono incurabili disordini progressivi cronici che colpiscono le cellule biliari situate in intra e dotti biliari extrahepatic (EHBDs)1. Alcuni cholangiopathies, come colangite sclerotica primaria, colangiocarcinoma, atresia biliare e le cisti del coledoco, interessano principalmente EHBDs. Sviluppo di terapie per cholangiopathies è limitato dalla disponibilità limitata di modelli preclinici. Inoltre, studi precedenti incentrato su cholangiopathies raggruppati: fegato, intra- ed EHBDs. Tuttavia, intra - ed EHBDs hanno un'origine embrionale distinta e, quindi, dovrebbe essere considerata come patologie molecolari distinte. Dotti ....

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Michigan.

1. preparazione di attrezzature e materiali per l'isolamento EHBD Mouse

  1. Preparare mezzo semina e tampone di lavaggio (Tabella materiali) in 50 mL provette coniche e conservare a 4 ° C o su ghiaccio fino all'utilizzo.
  2. Istituito un tavolo chirurgico (Figura 1B). Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati (Figura 1).
  3. Posizionare una piastra a 24 pozzetti sterile nell'incubatore 37 ° C coltura tissutale....

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Results

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Il nostro protocollo descrive la generazione di mouse EHBD organoids che sono tessuto-specifici e adulto derivati da cellule staminali. Dopo il organoids sono coltivate, una formazione di struttura cistica può essere osservata più presto 1 giorno dopo l'isolamento EHBD. Contaminazione con i fibroblasti non è osservata tipicamente durante la generazione di cultura. EHBDO efficienza di placcatura è di circa il 2% quando isolato da neonatale o adulto (età superiore a 2 mesi) topi (

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Discussion

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Questo lavoro descrive la generazione di un modello 3-dimensionale organotipiche del mouse EHBD colangiociti. Passi importanti nella generazione di cultura EHBDO includono dissezione meticolosa EHBD per evitare la contaminazione delle cellule di pancreas, mantenimento di condizioni di sterilità per evitare contaminazioni batteriche e fungine e un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione per evitare il perdita di materiale cellulare. Una stretta aderenza alle condizioni di temperatura descritto è necessaria. Ci sono .......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dalla associazione americana per il premio di studio del fegato malattie Pinnacle (di N.R.) e il National Institutes of Health, National Institute of Diabetes e digestivo e delle malattie renali (premi P30 DK34933 di N.R., P01 DK062041 a J.L.M.). Ringraziamo il dottor Ramon Ocadiz-Ruiz (Università del Michigan) per la sua assistenza con lo sviluppo di questa metodologia.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
L-WRN terreno per colture cellulari
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Siero fetale bovino (FBS)1%Life Technologies10437-028
Penicillina-streptomicina100 U/mLLife Technologies15140-122
Tampone di lavaggio
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)50 mLLife Technologies10010-023
Penicillina-streptomicina125 U/mLLife Technologies15140-122
Amfotericina B 6.25 µ g/mLLife Technologies15290-018
Terreno di coltura per organoidi
L-WRN Terreno condizionato 1:1ATCCCRL-3276
Advanced DMEM/F121:1Life Technologies12634-010
Penicillina-Streptomicina100 U/mLLife Technologies15140-122
N-Glutammina10 &; l/mLLife Technologies35050-061
N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico, HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 &; l/mLGibco17504-044
N210 µ l/mLGibco17502-048
Terreno di semina per organoidi
Terreno di coltura per organoidi 
Fattore di crescita epidermico (EGF)50 ng/mLInvitrogenPMG8041
Fattore di crescita dei fibroblasti-10 (FGF10)100 ng/mLPeproTech100-26
Anticorpi primari
Anti-Citocheratina 19 (CK19), Coniglio1:250Abcamab53119
Regione determinante il sesso Anticorpo Y-Box 9 (SOX9), Anticorpo Coniglio1:200Santa Cruzsc-20095
Anticorpo Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1), AnticorpoRabbit 1:2000DSRBF109-D12
Anticorpo E-caderina Capra1:500Santa Cruzsc-31020
Acetilato,
488 marcato anti-coniglio, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 marcato anti-capra, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 marcato anti-topo, Goat IgG2b1:500InvitrogenA-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell lineKit
per il dosaggio della luciferasiBiotium30003-2
0,05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
0,4% Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Materiali e reagenti aggiuntivi
Matrice basale, senza fenoli MatrigelCORNING356237
Tampone di dissociazione, AccutaseGibcoA1110501
Terreno di congelamento per colture cellulari, RecoveryLife Technologies12648010
Filtro cellulare (70 &; micro; Fisherbrand22363548
05-408-129
da 24 pozzettiUSA ScientificCC7682-7524
Provetta da centrifuga conica da 50 mLFisher scientific14-432-22
E-caderina , Anticorpi secondari Sigma-Aldrich T6793 Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793 ATCC CRL-1573 Estrazione di RNA tiocianato-fenolo guanidinio, TRIzol Invitrogen 15596026 Gel per la lavorazione dei campioni, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 Kit universale per il rilevamento del micoplasma ATCC 30-1012K Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL Fisherbrand Piastra Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E800 Microscopio invertito Biotium 30003-2 Vassoio per necroscopia Fisherbrand 13-814-61

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  2. Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
  3. DiPaola....

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Extrahepatic Bile DuctOrganoid CultureMouse EHBD IsolationOrganoid PropagationOrganoid StorageImmunohistochemistry AnalysisqRT PCR QuantitationBasement MatrixOrganoid PassageCryogenic Storage

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