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Articolo metodologico

Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

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DOI:

10.3791/59555

⸱

30 aprile 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

In questo articolo

Sommario

Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.

Abstract

Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.

Introduzione

La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici10,11. A causa dei recenti progressi nelle tecniche di coltura, la coltura di singoli batteri può essere raggiunta all'interno di uno spazio confinato, come in un pozzo4,7,8, goccia di gel12,13 e gocciolatore acqua in olio (W/O)5,11. Per promuovere la comprensione o l'utilizzo di singole cellule batteriche, sono necessari ulteriori sviluppi tecnici delle tecniche di coltivazione.

Le vescicole che imitano la membrana cellulare biologica sono compartimenti sferici costituiti da molecole anfifile e possono contenere vari materiali. Le vesciche sono classificate in base alle dimensioni e includono piccole vesciche (SV, diametro < 100 nm), grandi vescicle (LV, <1 m) e vescicle giganti (GV, >1 m). SV o LV sono comunemente utilizzati come portatori di droga a causa della loro affinità con la membrana cellulare biologica14. I GV sono stati utilizzati anche come sistema di reattori per la costruzione di protocelle15 o cellule artificiali16. L'incapsulamento di cellule biologiche in GV è stato segnalato17,18, e quindi i GV mostrano il potenziale come sistema di coltura cellulare quando combinati con il sistema del reattore.

Qui, insieme a un video di procedure sperimentali, descriviamo come i GV possono essere utilizzati come nuovi vasi di coltura cellulare19. I GV contenenti batteri sono stati realizzati con il metodo di trasferimento delle goccioline20 e sono stati poi immobilizzati su una membrana supportata su un vetro di copertura. Abbiamo usato questo sistema per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula all'interno dei GV in tempo reale.

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Protocollo

1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia

  1. Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.
  2. Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
    1. Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (Figura1b (i)).
    2. Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e posizionare la pellicola in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico (Figura1b (ii)).
      NOT: È necessario far evaporare il solvente organico in un cappuccio fumatore.
    3. Aggiungere alla fiala del vetro 200 - L di olio minerale (0,84 g/mL, tabella deimateriali) alla fiala di vetro (Figura 1b (iii)).
    4. Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h (Figura1b iii )). Le concentrazioni finali di POPC e biotina-PEG-DSPE sono rispettivamente di 1 mM e 0,002 mM.
  3. Pre-coltura di cellule batteriche
    1. Inoculare E. coli in 1x LB medio (1 g di estratto di lievito, 2 g di bacto tryptone, e 2 g di cloruro di sodio in 200 mL di acqua deionizzata) da una piastra LB e incubare a 37 gradi centigradi per 12-14 h (peruna pernotata).
    2. Dopo l'incubazione, raccogliere 20 l della soluzione di coltura e trasferire a 1,98 mL di mezzo fresco 1x LB, e ricolturare le cellule per 2 h.
    3. Controllare la densità ottica a 600 nm (OD600) valore della soluzione di pre-coltura (preparata nel passaggio 1.3.2). Deve essere utilizzata una soluzione pre-cultura di OD600 - 1,0 – 1,5.
  4. Preparazione delle soluzioni acquose esterne e interne dei GV
    1. Sciogliere il glucosio in 1x lB medio per preparare una soluzione acquosa esterna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di glucosio a scorta (500 mM).
    2. Diluire la soluzione di glucosio stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabella 1).
    3. Sciogliere il saccarosio in 1 x lb medio per preparare una soluzione acquosa interna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di saccarosio di riserva (500 mM).
    4. Mescolare la soluzione di pre-coltura (OD600 - 1,0–1,5), la soluzione di saccarosio (500 mM) e il supporto 1x LB (tabella1). Il valore finale oD600 della soluzione di coltura deve essere 0,01–0,015 e la concentrazione finale di saccarosio dovrebbe essere 200 mM.
      NOT: Fare attenzione a evitare la pressione osmotica. È necessario bilanciare la concentrazione tra la soluzione acquosa interna ed esterna.
  5. Preparazione di goccioline acqua-in-olio (W/O) contenenti cellule batteriche
    1. Aggiungete 2 -L della soluzione acquosa interna dei GV (preparati al punto 1.4.4) a 50 -L della soluzione di olio contenente lipidi (olio minerale con POPC e biotina-PEG-DSPE) in un tubo di plastica laidded da 0,6 mL (Figura1b (iv)).
    2. Emulsionare i due componenti nel tubo di plastica toccando il tubo a mano (Figura1b (v)).
  6. Formazione di GV contenenti cellule batteriche
    1. Aggiungere 50 l di soluzione esterna abossesy dei GV (preparati al punto 1.4.2) in un tubo di plastica con coperchio da 1,5 ml (Figura1b (vi)) e strato delicatamente 150 l della soluzione ad olio contenente lipidi (olio con POPC e biotina-PEG-DSPE) sulla superficie dell'esterno acquoso (Figura1b (vii)). Incubare questo campione a temperatura ambiente (RT, 25 gradi centigradi) per 10-15 min. Verificare che l'interfaccia dell'olio e le soluzioni acquose siano piatte.
    2. Aggiungere 50 l della soluzione di gocciolina W/O (preparata al punto 1.5.2) sull'interfaccia dell'olio e soluzione acquosa utilizzando una pipetta (Figura1b (viii)).
    3. Centrifugare il tubo di plastica coperchiato 1,5 mL (dal punto 1.6.2) per 10 min a 1.600 x g a RT in una centrifuga desktop (Figura 1b (ix)). Dopo la centrifuga, aspirare l'olio (strato superiore) dal tubo di plastica scartato da 1,5 ml usando una pipetta e raccogliere i GV contenenti cellule batteriche (Figura 1b (x)).

2. Preparazione di un sistema di osservazione GV (sistema di coltura cellulare batterica)

  1. Preparazione di piccole vesciche (SV) per constructi ng a membrana bistrato supportato
    1. Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (utilizzando la stessa composizione lipidica utilizzata per la preparazione del GV nel passaggio 1.1).
    2. Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e mettere questo campione in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico.
    3. Aggiungere alla fiala di vetro 200 ml di glucosio 200 mM nel mezzo 1x LB (la soluzione acquosa esterna dei gV).
    4. Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h.
    5. Preparare gli SV con il metodo di estrusione21 utilizzando una membrana mini-estrusore e policarbonato con dimensioni dei pori di 100 nm.
  2. Preparazione di una camera fatta a mano
    1. Forare un foro di 7 mm con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Incollare la guarizione bifronte con il foro su un vetro di copertura (30 mm x 40 mm, spessore 0,25–0,35 mm).
  3. Preparazione di una membrana bistrato supportata sul vetro di copertura nel foro della camera
    1. Aggiungere 30 l della soluzione SV al foro della camera (preparato nella sezione 2.2) e incubare RT per 30 min.
    2. Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.
  4. Immobilizzazione dei membrana bistrato supportato sul vetro di copertura nel foro della camera
    1. Introduci 10 L di neutravidina con la soluzione aquessa esterna dei GV (1 mg/mL) nel foro e incuba a RT per 15 min.
    2. Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.
    3. Aggiungere tutta la soluzione contenente i GV (preparati al punto 1.6.3) nel foro della camera e sigillare con un vetro di copertura (18 mm x 18 mm, spessore 0,13–0,17 mm) (Figura 2b).
  5. Osservazione microscopica della crescita delle cellule batteriche all'interno dei GV
    1. Impostare un microscopico sistema di fase di riscaldamento con un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad apertura numerica 40x/0.6 (NA) con una lunga distanza di lavoro (Figura 2b).
    2. Posizionare la camera sul sistema di fase di riscaldamento microscopico (Figura 2b). Incubare i GV contenenti cellule batteriche nella camera in una condizione statica per 6 h a 37 .
    3. Cattura e registra immagini al microscopio della crescita delle cellule batteriche all'interno di GV ogni 30 min utilizzando una telecamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS).

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Risultati

Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccarosi...

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Discussione

Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasferi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un'iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BactotryptoneBD Biosciences211705
CloroformioWako Pure Chemicals032-21921
Vetro di copertura (18 &volte; 18 mm)Matsunami Vetro Ind.C018181spessore 0,13– 0,17 mm
Vetro di copertura (30 & 40 mm)Vetro Matsunami Ind.Spessore dell'ordine personalizzato0,25 ... Centrifuga da tavolo da 0,35 mm
Hi-Tech Co.ATT101tipo di rotore oscillante
Guarnizione bifacciale (10 & volte; 10 &volte; 1 mm)NitomsT4613
Fiala di vetroAS ONE6-306-01Tubo di fermentazione Durham
GlucosioWako Pure Chemicals049-31165
Microscopio invertitoOlympusIX-73
MetanoloWako Pure Chemicals133-16771
Sistema di riscaldamento microscopicoTOKAI HITTP-110R-100
Olio mineraleNacalai Tesque23334-85
Mini-estrusoreAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
ObiettivoOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membrane in policarbonatoAvanti Polar Lipids610005dimensione dei pori 100 nm
telecamera sCMOSAndorZyla 4.2 plus
cloruro di sodioWako Pure Chemicals191-01665
SaccarosioWako Pure Chemicals196-00015
Bagno ad ultrasuoniAS ONEASU-3D
Estratto di lievitoBD Biosciences212750
Provetta in plastica con coperchio da 0,6 mLWatson130-806C
Provetta in plastica con coperchio da 1,5 mLSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotin-PEG-DSPE

Riferimenti

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

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