Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.
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Articolo metodologico
Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.
Introduzione
La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici....
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Protocollo
1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia
- Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.
- Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
- Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (Figura1b (i)).
- Ev....
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Risultati
Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccarosi.......
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Discussione
Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasferi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un'iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Cloroformio | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Vetro di copertura (18 &volte; 18 mm) | Matsunami Vetro Ind. | C018181 | spessore 0,13– 0,17 mm |
| Vetro di copertura (30 & 40 mm) | Vetro Matsunami Ind. | Spessore dell'ordine personalizzato | 0,25 ... Centrifuga da tavolo da 0,35 mm |
| Hi-Tech Co. | ATT101 | tipo di rotore oscillante | |
| Guarnizione bifacciale (10 & volte; 10 &volte; 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Fiala di vetro | AS ONE | 6-306-01 | Tubo di fermentazione Durham |
| Glucosio | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Microscopio invertito | Olympus | IX-73 | |
| Metanolo | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Sistema di riscaldamento microscopico | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Olio minerale | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-estrusore | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Obiettivo | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Membrane in policarbonato | Avanti Polar Lipids | 610005 | dimensione dei pori 100 nm |
| telecamera sCMOS | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| cloruro di sodio | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Saccarosio | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Bagno ad ultrasuoni | AS ONE | ASU-3D | |
| Estratto di lievito | BD Biosciences | 212750 | |
| Provetta in plastica con coperchio da 0,6 mL | Watson | 130-806C | |
| Provetta in plastica con coperchio da 1,5 mL | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
Riferimenti
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1....
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Ristampe e permessi
