Articolo metodologico

Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O

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DOI:

10.3791/59562

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7 ottobre 2020

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1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

In questo articolo

Sommario

Viene fornita in dettaglio una serie di metodi per determinare il tasso potenziale di DNRA basato+ su 14NH4/15NH4. L'NH 4viene convertito in N2O attraverso diversi passaggi e analizzato utilizzando la cromatografia a gas quadrupole- spettrometria di massa.

Abstract

L'importanza di comprendere il destino del nitrato (NO3-), che è la specie dominante N trasferita dagli ecosistemi terrestri a quello acquatico, è aumentata perché i carichi globali di azoto sono aumentati drammaticamente dopo l'industrializzazione. La riduzione del nitrato dissimile all'ammonio (DNRA) e la denitrificazione sono entrambi processi microbici che utilizzano NO3per la respirazione. Rispetto alla denitrificazione, le determinazioni quantitative dell'attività dell'ANRA sono state effettuate solo in misura limitata. Ciò ha portato a una comprensione insufficiente dell'importanza del DNRA nelle trasformazioni NO3− e dei fattori di regolazione di questo processo. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso di DNRA nei campioni ambientali. In breve, il tasso potenziale di DNRA può essere calcolato a partire dal tasso di accumulo di ammonio 15N -15NH4-in 15NO3- incubazione aggiunta. La determinazione delle concentrazioni 14NH4e 15NH4 , descritte in questo documento, comprende le seguenti fasi. In primo luogo,l'NH 4nel campione viene estratto e intrappolato su un filtro di vetro acidificato come sale di ammonio. In secondo luogo, l'ammonio intrappolato viene elizzato e ossidato a NO3- tramite ossidazione persulfata. In terzo luogo, il NO3- viene convertito in N2O tramite un denitrifier N2O. Infine, il N2O convertito viene analizzato utilizzando un sistema di spettrometria di gas quadrupolo-massa precedentemente sviluppato. Abbiamo applicato questo metodo ai sedimenti delle paludi salate e calcolato i loro potenziali tassi di DNRA, dimostrando che le procedure proposte consentono una determinazione semplice e più rapida rispetto ai metodi descritti in precedenza.

Introduzione

La sintesi artificiale del fertilizzante azotato e la sua applicazione diffusa hanno notevolmente perturbato il ciclo globale dell'azoto. Si stima che il trasferimento di azoto reattivo dai sistemi terrestri ai sistemi costieri sia raddoppiato dai tempi preindustriali1. Una porzione significativa di fertilizzanti applicati a un determinato campo viene lavata via dal suolo ai fiumi o alle acque sotterranee, principalmente come NO3- 2. Ciò può causare problemi ambientali come l'inquinamento dell'acqua potabile, l'eutrofazione e la formazione di ipossia. NO3- in ambienti idrici viene rimosso o mantenuto nell'ecosistema tramite assimilazione biologica e vari processi dissimilivi microbici. Denitrificazione e anammox sono noti per essere i principali processi di rimozione microbica per NO3. La denitrificazione è la riduzione microbica di NO3- a prodotti gassosi N (NO, N2O e N2) accoppiata con l'ossidazione di un donatore di elettroni, come le sostanze organiche, riducendo così il rischio dei problemi di cui sopra. Anammox produce anche N2 da NO2e NH4; pertanto, rimuove n inorganico da un ecosistema. Al contrario, DNRA lavora per mantenere N in un ecosistema; è generalmente accettato che il DNRA sia eseguito principalmente da batteri fermentanti o chemiolithoautotrofici e che riducano la dissimiltoria NO3- a NH4biodisponibile e meno mobile .+

Studi sul DNRA sono stati condotti principalmente in ecosistemi marini o estuari, come sedimenti oceanici o estuari e acqua, sale o terreno paludoso sal brasato e suolo di mangrovie. Gli ecosistemi costieri o marini sono importanti in quanto i serbatoi per la rimozionedel NO3dagli ecosistemi terrestri, e in studi precedenti DNRA ha dimostrato di contribuire su una gamma molto ampia di NO3-rimozione (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Inoltre, l'esistenza di DNRA è stata dimostrata in una vasta gamma di ambienti tra cui ambientid'acqua dolce 19, risaie20e terreniforestali 21. Mentre questi studi hanno dimostrato che il DNRA è potenzialmente paragonabile alla denitrificazione per la rimozione di NO3,− gli studi che misurano l'attività del DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione.

Il tasso DNRA è stato valutato utilizzando 15tecniche di etichettatura N in combinazione con l'analisi dei dati tramite modelli analitici o numerici. Una soluzione analitica per calcolare il tasso di DNRA si basa sull'aumento dell'arricchimento 15N del pool NH4dopo l'aggiunta di 15NO3- come tracciante. 15 anni Il N-labeled NO3- viene aggiunto a un campione e incubato, e il tasso DNRA può quindi essere calcolato in base alle variazioni del rapporto di concentrazione e isotopo in NH4- prima e dopo un certo periodo di tempo. In questo documento, viene descritto in dettaglio un metodo per quantificarela concentrazione NH 4+ e il rapporto isotopi, necessari per calcolare il tasso DNRA. Fondamentalmente, il metodo riportato qui è una combinazione di diverse tecniche precedentemente riportate22,23,24,25,26 con modifiche aggiunte ad alcune procedure. Il metodo è costituito da una serie di cinque procedure componenti: (1) l'incubazione di un campione ambientale con la modifica di un tracciante isotopo stabile, 15NO3,(2) l'estrazione e il recupero di NH4+ , utilizzando una "procedura di diffusione" con modifiche, (3) persulfare l'ossidazione di NH4- nel campione, costituito da indigeni NH4e 15NH4- derivati da 15NO3- tramite attività DNRA, in NO3- e 15NO3,(4) successiva trasformazione microbica di NO3− e 3 15NO3- a N2O isotopomers tramite il metodo denitrifier modificato, e (5) la quantificazione degli isotopomi N2O utilizzando la cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC/MS).+ Nella sezione seguente, in primo luogo, viene descritta la preparazione per le procedure (2) e (4) e successivamente, tutte e cinque le procedure dei componenti sono descritte in dettaglio.

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Protocollo

1. Preparazione di una busta PTFE per la cattura quantitativa di NH3 gassosa

  1. Posizionare un pezzo di nastro di politetrafluoroetilene (PTFE) (25 mm di larghezza) su un piccolo foglio di lamina di alluminio (circa 300 mm x 450 mm di dimensione, pulito con etanolo).
  2. Applicare un filtro in fibra di vetro (10 mm di diametro con una dimensione di poro di 2,7 m) a 450 gradi centigradi per 4 h in un forno a muffolo. Posizionare il filtro in fibra di vetro un po 'sopra il punto medio dell'asse più lungo del nastro (Figura 1a).
  3. Individuare 20 L di 0,9-mol/L H2SO4 al centro di un filtro GF/D e piegare immediatamente il nastro PTFE utilizzando due pinzette: pinzette a stampa piatta e pinzette a fine retta. I passaggi seguenti, i passaggi 1.4–1.7, sono illustrati nella Figura 1 e devono essere condotti rapidamente.
  4. Capovolgere il nastro PTFE sul filtro GF/D sulla linea tratteggiata illustrata nella figura 1a per formare la forma illustrata nella Figura 1b.
  5. Sigillare entrambi i lati piegando e quindi premendo saldamente il bordo con le pinzette (Figura 1c). Non premere troppo forte e non graffiare il nastro PTFE.
  6. Piegare l'estremità aperta con le pinzette, quindi premere il bordo con le pinzette (Figura 1d).
  7. Sigillare l'estremità aperta premendo strettamente il bordo con le pinzette (Figura 1e). Il filtro GF/D non deve essere premuto durante questa procedura.

2. Preparare la biomassa di un denitrifier carente di ossido di azoto, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, per il metodo del denitrifier

  1. Streak un 20% di glicerolo stock di Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 su 1/4 forza di brodo di soia prova (TSB) piastre di agar. Incubare le piastre a 25 gradi centigradi per 2-3 giorni.
  2. Trasferire una colonia singola di P. chlororaphis in una piccola provetta contenente 5 mL di mezzo TSB autoclaved e coltura aerobicamente (senza agitare) per un giorno a 25 gradi centigradi al buio fino ad ottenere la massima crescita; questo verrà utilizzato come precultura.
  3. Trasferire 3 mL della precoltura in una bottiglia da 1 L con un tappo di gomma di silicio contenente 1 L di TSB modificato autoclaved appena preparato integrato con 10 mmol/L KNO323. Incubare la bottiglia mentre si agita utilizzando un agitatore in condizioni scure a 25 gradi centigradi. Dopo aver coltivato per 8 h, sostituire il tappo di gomma di silicio con un tappo a vite e chiudere saldamente. Continuare la coltivazione in anossia durante la notte.
  4. Centrifugare la coltura a 18.800 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per ottenere pellet di biomassa.
  5. Lavare la biomassa confezionata tre volte con 30 mL della salina tamponata di fosfato di Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), per eliminare completamente il NO3. Le condizioni della centrifugazione sono le stesse del punto 2.3.
  6. Dopo il lavaggio, sospendere nuovamente la biomassa imballata con 30 mL di D-PBS (-). Utilizzare 1 mL della sospensione per determinare la densità delle cellule misurando OD600. Pipette 1 mL aliquots della sospensione rimanente in criovials sterili contenenti 0,8 mL del 45% glicerolo. Conservare le scorte di glicerolo preparate a 80 gradi centigradi fino all'uso (c'è la sezione 6).

3. Eliminazione di ossigeno, nitrito e nitrato dal sedimento del campione

  1. Pesare 3,0 g (peso umido) di sedimenti in una fiala di vetro da 20 mL e aggiungere 9,0 mL di acqua di superficie per sospenderlo (25% w/w liquame).
  2. Sigillare la fiala con un tappo di gomma butile nero (lavato con acqua scambiata agli ioni e sterilizzato tramite autoclaving) e un tappo di alluminio.
  3. Eliminare la sospensione e sostituire l'aria headspace con Ar (>99,99%) a 0,6 L/min per 20 min utilizzando un collettore.
  4. Sostituire il gas headspace Ar con ultra-puro (>99.99995%) Egli aspirando per 90 s e caricando Lui per 30 s. Ripetere questa procedura quattro volte. Impostare la pressione del gas headspace su 1,5 atm.
  5. Incubare le fiale a 20 gradi centigradi durante la notte con tremori a 150 giri/min in condizioni di buio utilizzando uno shaker a temperatura costante per eliminare l'ossigeno, il nitrato e il nitrito rimanenti nelle sospensioni dei sedimenti e nel gas headspace.

4. Esperimento del corso di tempo per determinare il tasso di DNRA

  1. Sostituire il gas headspace con fresco ultra-puro Egli utilizzando la stessa procedura come al punto 3.5, ma senza le quattro ripetizioni.
  2. Aggiungere substrati etichettati e non etichettati a ciascuna fiala secondo la tabella 1 attraverso il tappo di gomma butile utilizzando una siringa gastight. Eliminare le soluzioni di substrato precedentemente preparate in fiale di vetro di dimensioni adeguate utilizzando l'acqua ultra-pura He con la pressione dello spazio della testa impostata su 1,5 atm per evitare la contaminazione dell'aria. Evitare l'iniezione involontaria di qualsiasi quantità di aria durante le procedure di iniezione.
  3. Incubare fiale a 20 gradi centigradi con agitazione a 150 rpm. Aggiungere i substrati a ciascuna fiala secondo la tabella 1 e incubare per 1 h, 3 h e 5 h. Dopo l'arresto dell'incubazione, sottopone la sospensione dei sedimenti nelle fiale alle seguenti procedure: punti 4.4–4.9.
  4. Rimuovere il tappo di alluminio e il tappo di gomma butile da ogni fiala. Quindi, aggiungere KCl (cenere a 450 gradi centigradi per 4 h) alla sospensione dei sedimenti fino a una concentrazione finale di circa 2 mol/L per garantire il recupero di NH4- dal sedimento. Chiudere le fiale con un tappo di gomma butile e una chiusura in alluminio.
  5. Agitare il sedimento a 150 giri/min per 1 h a 4 gradi centigradi in condizioni scure per estrarre l'NH4+.
  6. Trasferire l'intera sospensione dei sedimenti nella fiala in un tubo di centrifuga di plastica da 50 mL e la centrifuga a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  7. Sciacquare la parete interna di una siringa usa e getta da 10 mL appena aperta e attaccarla a un filtro a membrana in acetato di cellulosa usa e getta appena aperto (dimensione pore 0,22 m, 25 mm di diametro). Quindi, sciacquare il filtro a membrana con 1 mL di supernante. Posizionare l'unità di filtro della siringa sciacquata su una bottiglia di polipropilene a bocca larga (PP) da 20 mL.
  8. Filtrare il supernatant rimanente attraverso un filtro a membrana acetato nella bottiglia PP da 20 mL. Conservare gli estratti estratti a 20 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.

5. Catturare NH4 diffuso- in 2M H2SO4 assorbito al filtro GF/D nella busta PTFE e l'ossidazione persulfata di NH4+ - a NO3−

  1. Preparare soluzioni standard di 14NH4Cl con gradienti di concentrazione di 0 mol/L, 10 mol/L, 40 mol/L, 100 mol/L, 200 mol/L, 400 zmol/L e 500 mol/L. Per l'analisi del rapporto 15N, fissare la concentrazione totale di NH4+ - a 200 mol/L e preparare i rapporti isotopi di 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 e 10:90 con puro 14 NH4Cl e 15NH4Cl soluzioni standard.
  2. Trasferire 30 mg di MgO (cenere a 450 gradi centigradi per 4 h) in una fiala di vetro da 20 mL e inserire la busta PTFE nella fiala.
  3. Trasferire 5 mL di un campione o di uno standard nella fiala contenente l'MgO e la busta PTFE e chiudere immediatamente con un tappo di gomma grigio butile. Sigillare con un tappo di alluminio. Se si prevede che la concentrazione di NH4+ s.l.a. superi i 500 mol/L, diluire il campione al di sotto di 500 mol/L.
  4. Agitare le fiale a 150 giri/min per 3 h a 4 gradi centigradi in condizioni di buio.
  5. Rimuovere il tappo di alluminio e il tappo di gomma butile. Togliere la busta PTFE dalla fiala utilizzando una pinzetta a punta, sciacquare accuratamente la busta e le pinzette con acqua scambiata agli ioni, asciugarle con una carta da asciugatura, quindi mettere la busta su una carta da asciugatura fresca.
  6. Aprire la busta PTFE con un paio di pinzette (si consiglia l'uso di entrambe le pinzette a fine piatta e puntate) nell'ordine esatto inverso della piegatura eseguita nei passaggi 1.4–1.7.
  7. Tenere l'area periferica del filtro GF/D, dove l'H2SO4 dovrebbe essere non assorbito, con le pinzette piatte, e trasferirlo in una provetta a vite da 11 mL con un tappo ptFE- foderato. Sciacquare le pinzette con acqua scambiata agli ioni e pulirle con carta da pulire.
  8. Ripetere i passaggi da 5.5 a 5.7 per le buste rimanenti.
  9. Aggiungere 1 mL di acqua scambiata a ioni a ciascuna delle provette, chiudere il tappo della vite e mantenerlo senza agitare per almeno 30 min a temperatura ambiente per esentare completamente l'NH4dal filtro GF/D. Durante questo passaggio, eseguire il passaggio successivo (passaggio 5.10) in parallelo.
  10. Preparare il reagente 25 ,,26.25
    1. Poiché non può essere conservato, preparare l'esatta quantità di POR necessaria per il trattamento di un singolo giorno di campioni.
    2. Per preparare il POR per il trattamento di 50 campioni, versare 100 mL di acqua scambiata agli ioni in una bottiglia di tappo a vite da 200 mL e aggiungere 1,52 g di NaOH (grado di analisi composta da azoto), 3 g di acido borico e 5 g di K2S2O8 (grado di analisi dell'azoto e del fosforo) in questo ordine. Immediatamente dopo aver aggiunto ogni reagente, agitare la soluzione fino a quando non è completamente disciolto.
    3. Se necessario, immergere la bottiglia in acqua tiepida per aiutare la dissoluzione delle sostanze chimiche; tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione per quanto riguarda la contaminazione di NO3- perché l'acqua del rubinetto normalmente contiene NO3.
  11. Dopo il punto 5.8, aprire il tappo a vite, aggiungere 2 mL del reagente POR alla provetta e chiudere il tubo con un tappo a vite per evitare perdite o contaminazioni durante le seguenti fasi.
  12. Resistere alle provette su un rack, avvolgerle in un foglio di alluminio a doppio strato e autoclave per 1 h a 121 gradi centigradi. Mantenere i tubi in posizione eretta durante questa fase ed evitare rapidi cambiamenti di temperatura dopo aver terminato l'autoclaving.

6. Determinazione del NO3, convertito da NH4,+ mediante il metodo del denitrifier mediante quadrupole GC/MS

  1. Mescolare 100 mL di tampone sterile di fosfato 40-mmol/L (pH 7.2) e 100 mL di glucosio sterile da 30 mmol/L asepticamente (20-mmol/L fosfato e glucosio 15-mmol/L; finale).
  2. Aggiungere un volume di 1/7,2 di stock di glicerolo di P. chlororaphis a 200 mL della soluzione di glucosio tamponato al fosfato in una fiaschetta Erlenmeyer da 300 mL ed epurare con un egli ultra puro (>99,995%) flusso per 1 h.
  3. Erogare 2,0 mL della sospensione del denitrifier in ogni fiala da 5 mL. Tappa le fiale con un tappo di gomma butile grigio e una chiusura in alluminio.
  4. Sostituire l'aria headspace con l'acqua ultra-pura He aspirando per 3 minuti e caricando l'He per 1 min. Impostare la pressione positiva del gas headspace su 1,3 atm per evitare la contaminazione involontaria dell'aria.
  5. Iniettare 1 mL di un campione o di uno standard attraverso il tappo di gomma butile utilizzando una siringa usa e getta da 1 mL. Si noti l'esatta quantità del campione effettivamente iniettato.
  6. Incubare le fiale durante la notte a 25 gradi centigradi in condizioni di buio.
  7. Iniettare 0,3 mL di 6-mol/LL NaOH per fermare la denitrificazione e assorbire lo spazio headspace CO2, che altrimenti disturberà seriamente l'analisi N2O di GC/MS perché CO2 e N2O hanno lo stesso peso molecolare.
  8. Determinare le quantità di 44N2O, 45N2O e 46N2O nel gas headspace utilizzando quadrupole GC/MS con una porta di iniezionemodificata 25. Le condizioni operative utilizzate per l'analisi GC/MS sono illustrate nella tabella 2.

7. Analisi dei dati

  1. Derivare la curva di taratura per l'NH4- concentrazione dalla relazione lineare tra la concentrazione nota di 14NH4e l'intensità del segnale misurato del totale prodotto 44N2O - 45N2O 46N2O. Derivare la curva di calibrazione per il contenuto di 15N dalla relazione linearetra l'atomo noto%( cioè, 15N /14N, 15N) e l'atomo calcolato% utilizzando un'equazionefornita in precedenza 27. Calcolare la concentrazione di 15NH4, moltiplicando il totale NH4per il rapporto 15N di NH4.
  2. Calcolare il tasso di DNRA potenziale utilizzando equazioni fornite altrove28,29,30.

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Risultati

I risultati rappresentativi presentati in questo documento sono stati ricavati da 15 esperimentidi N-tracing di sedimenti di paludi salate. La palude salata campiova è stata appena creata all'indomani del terremoto del 2011 nel Grande Giappone orientale nella zona di Moune della città di Kesen-numa nella prefettura di Miyagi, in Giappone. Nel settembre 2017, i sedimenti superficiali (0-3 cm) sono stati raccolti in due siti nelle zone subtidale e intertidale. In primo luogo, sub...

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Discussione

Il rapporto di concentrazione e isotopo di NH4per l'analisi DNRA è stato quantificato utilizzando diversi metodi. Le concentrazioni e i rapporti isotopi di NH4sono generalmente misurati separatamente. La concentrazione NH4è in genere misurata utilizzando metodi colorimetrici tra cui un autoanalyzer4,10,15,16,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Naoto Tanaka per aver aiutato la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo. La raccolta di campioni è stata supportata da JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
Flacone in PP da 20 mlSANPLATEC61-3210-18a bocca larga
Maruemu1307-13n. 20, con foro
AcidoboricoWako021-02195
CentrifugaHITACHIHimac CR21G II
Gas Deossigenato Pressione & Sostituire l'iniettoreSANSIN INDUSTRIALIP-12
Filtro a membrana monouso in acetato di cellulosaADVANTEC25CS020ASDimensione dei pori 0,22 & micro; m, diametro 25 mm
Siringa monousoTermoSS-10SZ10 mL
Siringa monousoTermoSS-01T1 mL
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Siringa a tenuta di gasVICI Valco Instruments4075-15010Serie A-2, 100 &; L
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm di diametro
Fiala di vetroMaruemu0501-0620 mL
Tappo in gomma butilica grigiaMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Reagente garantito
K2S2O8Wako169-11891Grado di analisi di azoto e fosforo
KClWako163-03545Reagente garantito
KNO3Wako160-04035Reagente garantito
NaOHWako191-08625Grado di analisi dei composti azotati
NH4ClWako017-02995Reagente garantito
Provetta da centrifuga in plasticaASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Liofilizzato, il ceppo tipo di Pseudomonas aureofaciens
Nastro sigillante in PTFESigma-AldrichZ22188025 mm di larghezza
Agitatore alternativoTAITEC0000207-000NR-10
Provetta con tappo a viteIWAKI84-025211 mL
Tappo rivestito in PTFE per provettaIWAKI84-0262
Brodo di soia tripticoDifco Laboratories211825
Tappo in alluminio

Riferimenti

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