Method Article

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

DOI:

10.3791/59576

⸱

April 27th, 2019

 ,  ,  , 
1Integrated Science Center, Biology Department, College of William & Mary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.

Abstract

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Qui presentiamo un nuovo metodo per studiare la sumoilazione delle proteine e la loro localizzazione subcellulare nelle cellule dei mammiferi e negli ovociti nematodi. Questo metodo utilizza un frammento di proteina di SUMO-trapping modificato ricombinante, kmUTAG, derivato dalla proteasi di SUMO Ulp1 del lievito in erba tollerante allo stress Kluyveromyces marxianus. Abbiamo adattato le proprietà del kmUTAG allo scopo di studiare la sumoilazione in una varietà di sistemi di modelli senza l'uso di anticorpi. Per lo studio di SUMO, KmUTAG ha diversi vantaggi rispetto agli approcci basati su anticorpi. Questo reagente a tolleranza di SUMO è prodotto recombinantly, riconosce le isoforme di SUMO native di molte specie e, a differenza degli anticorpi disponibili in commercio, Mostra una ridotta affinità per il SUMO libero e non coniugato. I risultati rappresentativi qui riportati includono la localizzazione dei coniugati SUMO nelle cellule di coltura tissutale dei mammiferi e negli ovociti nematodi.

Introduction

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Lo scopo di questo metodo è quello di facilitare lo studio e l'analisi delle proteine coniugate con SUMO utilizzando la proteina ricombinante SUMO-trapping UTAG ( tagULP Domain). Come descritto di seguito, UTAG può essere utilizzato al posto di altri reagenti e approcci per purificare, rilevare e visualizzare le proteine di SUMO modificate. A seconda delle condizioni di crescita, le cellule possono contenere centinaia o migliaia di proteine che vengono modificate con le catene SUMO o SUMO (per la revisione vedere Kerscher et al. 20061 e kerscher 20162). Questo rappresenta una notevole difficoltà per le analisi funzionali di specifiche proteine SUMO-modificate, soprattutto perché solo una frazione di un particolare bersaglio di SUMOilazione è effettivamente modificato3. Oltre ai loro ruoli nei processi cellulari essenziali come la regolazione trascrizionale, l'omeostasi proteica, la risposta allo stress cellulare e il rimodellamento della cromatina durante la mitosi e la meiosi; Ora è diventato sufficientemente chiaro che il Sumo, le proteine modificate dal sumo e i componenti del pathway di Sumo hanno anche un potenziale come biomarcatori per patologie come il cancro e le patologie neurodegenerative4,5,6 ,7. Ciò sottolinea la necessità di strumenti robusti, affidabili e prontamente disponibili e di approcci innovativi per la rilevazione e l'analisi funzionale delle proteine di SUMO modificate in una varietà di cellule e campioni.

In molti sistemi, gli anticorpi specifici per Sumo sono i reagenti di scelta per le analisi di rilevazione, isolamento e funzionale delle proteine di Sumo-modificate8,9. Tuttavia, alcuni anticorpi specifici per SUMO disponibili in commercio sono costosi, limitati in quantità o disponibilità, inclini ad esporre affinità selvaggiamente variabili e cross-reattività, e in alcuni casi mancano riproducibilità10. Un approccio alternativo è l'espressione di SUMO con tag epitopo in cellule e organismi trasformati, ma il collegamento di tag epitopi a SUMO può ridurre artificialmente la sua coniugazione agli obiettivi proteici11. Inoltre, gli epitopi non sono utili quando vengono valutate cellule o tessuti non trasformati.

Ulp1 è una proteasi di SUMO conservata da S. cerevisiae che entrambi elabora il precursore di sumo e desumoylates proteine coniugate con Sumo12. Abbiamo sviluppato il reagente UTAG in base all'osservazione serendipitous che una mutazione della cisteina catalitica (C580S) in Ulp1's Sumo ULP dominio (UD) non solo previene la scissione del Sumo, ma anche intrappola le proteine coniugate con sumo con elevate avidità12. Per semplicità, abbiamo fatto riferimento a questo frammento carboxy-terminale SUMO-trapping Ulp1 (C580S) come UTAG (abbreviazione di UD TAG). UTAG è una proteina di intrappolamento Pan-SUMO ricombinante che rappresenta un'utile alternativa agli anticorpi anti-SUMO utilizzati per l'isolamento e il rilevamento di proteine di SUMO-modificate. È importante sottolineare, in particolare, il SUMO coniugato in modo nativo e non solo uno o più epitopi su SUMO. Per migliorare sia la stabilità proteica che la forza legante SUMO di UTAG, abbiamo generato una variante di UTAG dal lievito a tolleranza di stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lega saldamente i coniugati di SUMO con l'affinità nanomolare13. Inoltre, kmUTAG è resistente a temperature elevate (42 ° c), agenti riducenti (5 mM TCEP-tris (2-carbossimetilico) fosfina cloridrato), denaturanti (fino a 2 M di urea), agenti ossidanti (0,6% di perossido di idrogeno) e detergenti non ionici. Questa tolleranza allo stress è utile durante le dure condizioni di purificazione e i tempi di incubazione prolungati, assicurandone la stabilità e l'attività di cattura di SUMO. Non sorprende tuttavia che l'attività di KmUTAG di SUMO-trapping sia incompatibile con i reagenti modificanti la cisteina, i detergenti ionici e gli estratti proteici completamente denaturati. La notevole affinità e proprietà di KmUTAG indicano che questo reagente può diventare parte del repertorio standard per lo studio delle proteine SUMOilate in più specie.

Qui forniamo un metodo semplice per rilevare le proteine di SUMO-modificate in cellule di mammiferi e nematodi utilizzando una proteina di fusione fluorescente mCherry-KmUTAG ricombinante (kmUTAG-FL).

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Protocol

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1. rilevazione di SUMO in cellule di coltura di tessuti fissi utilizzando proteina ricombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping

  1. Coltivare le cellule di coltura tissutale di scelta sui fogli di copertura rotonda di 22 mm in piastre TC a 6 pozzetti fino al 70% – 80% confluente. Eseguire i passaggi 1.2 – 1.8 nella piastra 6-well.
  2. Lavare brevemente le cellule con 1 mL di DPBS (soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)
  3. Per la fissazione, preparare una soluzione fresca di 4% paraformaldeide (PFA) soluzione (diluita in DPBS). Per correggere le cellule, aggiungere 2 mL 4% PFA in DPBS a ciascun pozzo. Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Nota: tutti i passaggi che utilizzano PFA devono essere eseguiti in un cappuccio di sicurezza di laboratorio e PFA deve essere smaltito correttamente.
  4. Lavare le celle fisse 3x in 1 mL di DPBS mentre Nutri la piastra, 5 min ogni lavaggio.
  5. Per permeabilizzare le cellule, incubare per 15 min con 0,1% Triton X-100 in DPBS
  6. Lavare le cellule 3x in 1 mL di DPBS mentre Nutri la piastra, 5 min ogni lavaggio
  7. Incubare le cellule con 500 μL di 0,1 M di glicina-HCL (pH 2,0) per 10 s, quindi neutralizzare immediatamente il pH con 500 μL di 10X tampone di proteasi di SUMO (SPB).
  8. Lavare le cellule 3x in 1 ml di DPBS mentre la piastra nutanti, 5 min ogni lavaggio
  9. Rimuovere i coprioggetti dal pozzo e metterli in una camera umida. Quindi procedere con le incubazioni sul vetrino coprioggetti come segue:
    1. Solo per la colorazione UTAG-FL: miscelare 1 μg UTAG-FL con 100 μL di 1x SPB contenente 5 mM di TCEP in un tubo, pipettare il mix sulle celle del vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h nella camera di umidità.
    2. Facoltativamente, per la co-colorazione degli anticorpi UTAG-FL e anti SUMO1, procedere come segue:
      1. Mescolare in un tubo 1 μg UTAG-FL e 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (ottenuto per studi sullo sviluppo Hybridoma Bank9) con 100 μl di tampone bloccante, pipettare il mix sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
      2. Lavare le celle sul vetrino coprioggetti 3 volte con 200 μL di DPBS, 5 min per ogni lavaggio.
      3. Mescolare in un tubo 0,5 μL anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo coniugato con 100 μL Tampone bloccante, pipettare il mix sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  10. Per lavare i coprioggetti, Pipettare 200 μL di DPBS su ciascun vetrino coprioggetti e lasciare in posizione per 10 minuti. Ripetere il lavaggio 2 volte.
  11. Rimuovere il vetrino coprioggetti dall'ultimo lavaggio e invertirlo su una slitta di microscopia pre-pulita con una goccia di supporto di montaggio (vedere tabella dei materiali).
  12. Conservare la notte in un congelatore da-20 ° c prima di visualizzarla al microscopio. Visualizza utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e Alexa Fluor 488 (se viene eseguita la co-colorazione opzionale SUMO2/3).

2. rilevazione SUMO in gonadi nematode fisse con UTAG-FL

  1. Trasferire gli ermafroditi adulti a una gocciolina di 8 μL di tampone di uovo14 su una slitta più caricata che è stata rivestita con poli-L-lisina. Rilasciare gonadi dai vermi utilizzando 27,5 aghi G. Procedere con l'etichettatura degli anticorpi o l'etichettatura UTAG-FL.
  2. Per i campioni di etichettatura degli anticorpi, procedere come segue:
    1. Congelare-rompere i campioni in azoto liquido e quindi fissare durante la notte in-20 ° c metanolo in un barattolo Coplin.
    2. Anche in vasi Coplin, lavare i vetrini per 3 volte in 1X PBS, quindi bloccare per 20 minuti in PBS contenente 0,5% BSA e 0,1% Tween 20.
    3. Aggiungere 30 μL di anticorpo anti-SUMO 6F2 (1:10) ad ogni vetrino che copra i campioni. Incubare durante la notte in una camera umida a 4 ° c.
      Nota: SUMO 6F2 è stato ottenuto dallo studio sullo sviluppo Hybridoma Bank15.
    4. Nei vasi Coplin, lavare i vetrini per 2 minuti in 1X PBS, quindi coprire e incubare i campioni con 30 μL di anticorpo secondario di capra-anti-topo DyLight 488 (1:200) per 1,5 ore in una camera umida a temperatura ambiente.
    5. In barattoli di Coplin, lavare i vetrini per 2 minuti in 1X PBS, eseguire un tuffo rapido in dH20, quindi montare le diapositive con il supporto di montaggio (vedere la tabella dei materiali).
  3. Per l'etichettatura KmUTAG-FL, procedere come segue:
    1. Per fissare le cellule, aggiungere 1 volume di 8% PF ai campioni per una concentrazione finale del 4% PF. fissare per 10 minuti in una camera di umidità e poi dissetare la reazione trasferendo le diapositive in un barattolo Coplin contenente 1X PBS con 0,1 M di glicina per almeno 5 min.
    2. Nei vasi di Coplin, lavare le cellule per 5 minuti in 1X PBS, quindi permeabilizzare i campioni in 1X PBS contenente 0,1% Triton-X per 10 min.
    3. Lavare in un barattolo di Coplin per almeno 5 minuti in 1X PBS, quindi aggiungere 200 μL di 0,1 M di glicina-HCl (pH = 2,0) ai campioni sulla slitta per 10 secondi. Aggiungere immediatamente 200 μL di 10x SPB per neutralizzare il pH.
    4. Lavare la slitta in 1X PBS in un barattolo Coplin per 5 min.
    5. Rimuovere la slitta dal lavaggio e pipettare 100 μL di 1x SPB + 5mM TCEP contenente 2 μg di UTAG-FL ai nematodi sui vetrini e incubare in camera umida per 1 h senza dondolo.
    6. Riportare la slitta nella vaschetta Coplin e lavare per 15 minuti in 1X PBS
    7. Rimuovere la slitta dal lavaggio, utilizzare un panno di laboratorio per asciugare intorno al campione, quindi montare le diapositive con 5 μL di supporto di montaggio (vedere tabella dei materiali). Conservare le diapositive a 4 ° c. Visualizzare utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e DyLight 488 (SUMO2/3).

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Results

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KmUTAG-FL è una proteina ricombinante, con etichetta mCherry, che cattura il SUMO. Per produrre kmUTAG-FL, abbiamo clonato un mCherry-kmUTAG ottimizzato per il codone nel plasmide di iperespressione batterica pSPOT1 (Figura 1). Dopo l'induzione, la proteina kmUTAG-FL è stata purificata su spot-TRAP, eluita e congelata fino a ulteriore uso. Per garantire l'attività di intrappolamento di SUMO di KmUTAG-FL, abbiamo confermato il legame con le perle coniugate SUM...

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Discussion

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Qui introduciamo l'uso di kmUTAG-FL, una proteina ricombinante, per gli studi funzionali del SUMO in cellule di mammiferi fisse e delle gonadi nematode dissezionate. KmUTAG-FL è un reagente specifico Pan-SUMO a tolleranza di stress che riconosce e intrappola le proteine native del SUMO e le catene di SUMO. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti di SUMO di sistemi aggiuntivi e non modello possano essere analizzate con il reagente kmUTAG-FL. In quanto tale, KmUTAG-FL...

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Disclosures

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I reagenti kmUTAG ricombinanti vengono forniti alla comunità di ricerca tramite Kerafast.com.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Kerscher per il loro sostegno, Nathalie Nguyen per la lettura critica del manoscritto, e Lidia EPP per il sequenziamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di commercializzazione del Commonwealth Research MF16-034-LS a OK. Il sostegno alla ricerca per gli studenti W & M è stato fornito dal fondo Bailey-Huston Research e dalle borse di studio di Charles Center Honors a RY e CH.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldeide (formaldeide) soluzione acquosaMicroscopia elettronicaScienze 30525-89-4
Piastre per colture cellulari a 6 pozzettiGenesee Scientific/Olympus Plastics25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-545-003Utilizzato come anticorpo secondario per l'anticorpo monoclonale di topo
DPBS, senza calcio, no magnesioFisher ScientificGibco 14190144
Dylight 488 coniugato AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-485-146Utilizzato come anticorpo secondario per l'anticorpo monoclonale di topo
Fisherbrand Coverglass per occhiali di copertura per la crescita Fisherbrand12545101
FLUORO-GEL II con DAPIMicroscopia elettronica Scienze50-246-93)Mezzi di montaggio al passaggio 1.11
FLUORO-GEL con DABCOMicroscopia ElettronicaSciences 17985-02Con DAPI aggiunto a 1 µ g/mL; terreni di montaggio nel passaggio 2.2.5
Glicina-HClFisher BioReagentiBP3815
Glicina-HClACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flKerafastI reagenti KmUTAG sono disponibili su Kerafast.com
tampone bloccante Oneblock Western-CLPrometheus20-313
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato, 10X SolutionFisher BioReagentiBP3994
PNT2 linea cellulareSigma-Aldrich95012613Epitelio prostatico normale immortalizzato con SV40.
pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2SUMO 6F2 è stato depositato nel DSHB da Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO proteasi tampone [10x]500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Anticorpo 8A2DSHBSUMO-2 8A2SUMO-2 8A2 è stato depositato nel DSHB da Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCLGoldBio51805-45-9Utilizzato come agente riducente a una concentrazione di 5mM
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1Utilizzato per la permeablizzazione allo 0,1% in DPBS/PBS (per vermi)

References

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