Viene presentato un protocollo per creare pseudoislets umani modificati in gene da cellule di isole umane disperse che vengono tradusse da lentivirus che trasportano RNA a forcina corta (shRNA). Questo protocollo utilizza vasi enzimatici e di coltura prontamente disponibili, può essere eseguito facilmente e produce pseudoislets umani geneticamente modificati adatti per studi funzionali e morfologici.
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Articolo metodologico
Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono disponibili vari strumenti genetici per modulare i geni nelle isole pancreatiche dei roditori per sezionare la funzione dei geni dell'isolotto per la ricerca sul diabete. Tuttavia, i dati ottenuti dalle isole di roditori spesso non sono completamente riprodotti o applicabili alle isole umane a causa di ben note differenze nella struttura e nella funzione delle isole tra le specie. Attualmente, le tecniche disponibili per manipolare l'espressione genica delle isole umane sono molto limitate. L'introduzione del transgene in isole intatte mediante adenovirus, plasmide e oligonucleotidi spesso soffre di bassa efficienza e di elevata tossicità. La bassa efficienza è particolarmente problematica negli studi di downregulation genica in isole intatte, che richiedono un'elevata efficienza. È noto che le cellule di isole enzimaticamente disperse si riaggregano nella coltura formando sferoidi chiamato pseudoislets. La riaggregazione controllata dalle dimensioni delle cellule dell'isolotto umano crea pseudoislets che mantengono la secrezione dinamica dell'insulina della prima fase dopo una coltura prolungata e forniscono una finestra per introdurre in modo efficiente l'RNA a tornante corto lentivirale (shRNA) con bassa tossicità. Qui, viene descritto un protocollo dettagliato per la creazione di pseudoislets umane dopo la trasduzione lentivirale utilizzando due piastre multiwell disponibili in commercio. Il protocollo può essere facilmente eseguito e consente una svalutazione efficiente dei geni e la valutazione del dinamismo della secrezione di insulina utilizzando cellule di isolazione umana. Pertanto, gli pseudoislets umani con modulazione genica mediata lentivirale forniscono un modello potente e versatile per valutare la funzione genica all'interno delle cellule dell'isolele umana.
Introduzione
La perdita di massa funzionale delle cellule beta è la patologia centrale sia per il diabete di tipo 1 che per il diabete di tipo 21. Mentre le cellule beta sono i produttori di insulina in isole pancreatiche, la comunicazione tra le cellule beta e le cellule non beta svolge un ruolo critico nella regolazione della secrezione di insulina2. Inoltre, la disregolazione della secrezione glucagone contribuisce all'iperglicemia nel diabete3. Quindi, c'è un forte interesse a modulare l'espressione genica delle cellule all'interno delle isole pancreatiche per affrontare il meccanismo alla base dello svilu....
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Protocollo
Prima dell'inizio degli studi, l'University of Iowa Institutional Review Board ha determinato che lo studio non soddisfaceva i criteri per la ricerca sui soggetti umani. Consultare il comitato di revisione locale prima dell'avvio dello studio per determinare se la fonte delle issolte e lo studio pianificato richiedono l'approvazione preventiva.
NOT: Tipicamente, sono necessari 1.200-1.400 isolotti equivalenti (IEQ) di isolotti umani per la formazione di 192 pseudoislets delle dimensioni di 3.000 cellule / pseudoislets in un attacco ultra-basso 96-well o 1.200 pseudoislets delle dimensioni di 500 cellule / pseudoislets in un ....
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Risultati
La figura 1 illustra i passaggi chiave nella produzione di pseudoislets utilizzando una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti e una piastra di coltura microwell. La figura 2a mostra cambiamenti sequenziali nella morfologia durante la formazione di pseudoislets da 3 x 103 cellule di isolotto umano in una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti. Il monostrato o i ciuffi sciolti di cellule osservate nel .......
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Discussione
Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per generare pseudoislets umani che vengono tradotti da lentivirus utilizzando una piastra di fissaggio ultra-bassa 96-pozzetti o una piastra di coltura microwell. Gli pseudoislets sono stati segnalati per dimostrare la morfologia e le funzioni secretorie simili agli isolotti umani nativi e possono essere coltivati per un tempo prolungato in vitro5,11,18. A differenza delle isole u.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) e dall'American Diabetes Association a Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. e Y.I. sono supportati dal Centro di ricerca sul diabete dell'Ordine Fraterno delle Aquile. A.B. è sostenuto da una sovvenzione di formazione dei National Institutes of Health (T32NS45549). Gli autori hanno utilizzato isole pancreatiche umane fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) finanziato dalla NIDDK a City of Hope (2UC4DK098085).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di risciacquo antiaderente | Stemcell technologies | 7919 | |
| Cabina di sicurezza biologica | Thermo Scientific | Serie 1300 Tipo A2 | |
| Filtro cellulare, 40 micrometri | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubatore | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Provetta da centrifuga conica, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Provetta da centrifuga conica, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher | 26140079 | |
| Reagente per l'estrazione dell'RNA tiocianato di guanidinio | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutammina | ThermoFisher | 25030164 | |
| Emocitometro | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Albumina sierica umana | Sigma | A1653 | |
| Microscopio invertito | Fisher marca | 11-350-119 | |
| Microcentrifuga | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Provetta per microcentrifuga, 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Piastra di coltura per micropozzetti | Tecnologie delle cellule staminali | 34411 | Aggrewell 400, 24 pozzetti |
| Pestello a motore | GAMUT | ||
| Piatto trattato per coltura non tissutale, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillina-streptomicina | ThermoFisher | 10378016 | |
| Piastra di Petri, | Pipetta Celltreat | 229638 | |
| , 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| VWR | #613-5253 | 8 canali | |
| VWR | 667210B | da 10 mL | |
| P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| , P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Miscela di enzimi proteolitici e collagenolitici | Sigma | A6965 | accutasi |
| , 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Filtro reversibile, 37 micrometri | Tecnologie Stemcell | 27251 | |
| Centrifuga a piastra a secchio oscillante | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Rotore a secchiello oscillante | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Siringa per tubercolina, 1 mL | BD | 309659 | |
| Micropiastra a bassissimo attacco, 96 pozzetti | Corning | 4515 |
Riferimenti
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J.
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Ristampe e permessi
