Un nuovo e traslazionale modello di commozione cerebrale che combina forza e rotazione con la microdialisi cerebrale in vivo

Sommario

L'alterazione del neurotrasmettitore è un meccanismo di disfunzione neurale che si verifica dopo la commozione cerebrale e contribuisce alle conseguenze a lungo termine a volte catastrofiche. Questo modello di ratto combina la microdialisi, permettendo la quantificazione della neurotrasmettitore in vivo, con una tecnica di caduta di peso che esercita una rapida accelerazione e decelerazione della testa e del torso, un fattore importante del trauma craniocerebrale umano.

Abstract

I sintomi cognitivi e motori persistenti sono conseguenze note di commozioni cerebrali/lieve lesione cerebrale traumatica (mTBIs) che possono essere in parte attribuibili a una neurotrasmissione alterata. Infatti, studi di microdialisi cerebrale in roditori hanno dimostrato un eccessivo rilascio di glutammato extracellulare nell'ippocampo entro i primi 10 min a seguito di un trauma. La microdialisi offre il chiaro vantaggio del campionamento continuo del neurotrasmettitore in vivo senza dover sacrificare l'animale. Oltre alla tecnica di cui sopra, è necessario un modello di trauma cranico chiuso che esercita una rapida accelerazione e decelerazione della testa e del busto, in quanto tale fattore non è disponibile in molti altri modelli animali. Il modello di riduzione del peso di Wayne State imita questa componente essenziale del trauma craniocerebrale umano, consentendo l'induzione di un impatto sulla testa di un roditore sfrenato con un peso in diminuzione. Il nostro nuovo modello di ratto traslazionale combina la microdialisi cerebrale con il modello di caduta di peso Wayne State per studiare, in ratti adulti leggermente anestesizzati e sfrenati, i cambiamenti acuti nei livelli di neurotrasmettitore extracellulare dopo commozione cerebrale. In questo protocollo, la sonda di microdialisi è stata inserita all'interno dell'ippocampo come regione di interesse, ed è stata lasciata inserita nel cervello all'impatto. C'è un'alta densità di terminali e recettori nell'ippocampo, che lo rende una regione rilevante per documentare la neurotrasmissione alterata a seguito di commozione cerebrale. Se applicato ai ratti adulti Sprague-Dawley, il nostro modello combinato ha indotto aumenti delle concentrazioni di glutammato extracellulare ippocampale entro i primi 10 min, coerenti con la sintomialogia post-concussione segnalata in precedenza. Questo modello combinato di caduta del peso fornisce uno strumento affidabile per i ricercatori per studiare le risposte terapeutiche precoci alle commozioni cerebrali oltre a lesioni cerebrali ripetitive, poiché questo protocollo induce un trauma lieve a testa chiusa.

Introduzione

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire ai ricercatori uno strumento affidabile che riproduce fedelmente la biomeccanica del trauma craniocerebrale umano, consentendo la caratterizzazione longitudinale degli effetti molecolari delle commozioni cerebrali/lieve cervello traumatico lesioni (mTBI). Questo metodo combina la microdialisi cerebrale con il modello di caduta di peso Wayne State per documentare, in ratti adulti leggermente anestesizzati e sfrenati, i cambiamenti acuti nei livelli di neurotrasmettitore extracellulare a seguito di commozione cerebrale. Con questo metodo minimamente invasivo, neurotrasmettitori come glutammato, GABA, taurina, glicina e secina possono essere rapidamente e continuamente quantificati a seguito di trauma, in vivo, pur non dovendo sacrificare l'animale.

La commozione cerebrale/mTBI è un'interruzione patofisiologica che influenza il funzionamento del cervello causata da un meccanismo di forza esterna. La commozione cerebrale/mTBI è la forma più comune di lesione cerebrale traumatica, che rappresenta il 70-90% dei casi¹. La maggior parte delle interruzioni funzionali acute a seguito di una commozione cerebrale può essere attribuita a una lesione cerebrale primaria e secondaria^2,3: (1) la lesione cerebrale primaria è indotta dalla rapida accelerazione e decelerazione della testa e del torso che danneggia i tessuti cerebrali mediante compressione seguita dallo stiramento e dalla tosatura degli assoni durante il contraccolpo^4,5,6 e (2) la lesione cerebrale secondaria è la risposta cellulare indiretta al trauma. Si svolge ore e giorni dopo la lesione cerebrale primaria e svolge un ruolo importante nel danno motorio e conoscitivo osservato nel tempo. Molti dei sintomi possono essere attribuiti a neurotrasmissione alterata come il rilascio eccessivo di glutammato extracellulare dimostrato in precedenza nei primi 10 min a seguito della lesione^7,8,9. Data la sua alta densità di terminali e recettori, l'ippocampo è una struttura cerebrale particolarmente vulnerabile a questa risposta excitotoxic a seguito di lesioni. Essere fortemente coinvolti nella funzione cognitiva^10,11, studi in roditori hanno riferito che i danni ippocampali associati con commozione cerebrale possono portare a danni nella paura condizionamento e apprendimento della memoria spaziale^{12 , 13.}L'obiettivo primario di questa metodologia era quello di elaborare un modello di ratto di commozione cerebrale/mTBI, utilizzando la procedura di caduta del peso della testa chiusa Wayne State per riprodurre fedelmente i meccanismi della lesione cerebrale primaria, e incorporare microdialisi da studiare in vivo, il neurotrasmettitore extracellulare acuto cambia a causa della lesione cerebrale secondaria a seguito di una commozione cerebrale. Le concentrazioni di glutammato extracellulare e GABA sono state misurate nell'ippocampo per agire come risultati rappresentativi del nostro metodo.

Precedenti studi sui roditori hanno combinato la microdialisi e altri modelli di lesioni, come la goccia di peso a cranio aperto e l'impatto corticale controllato, per dimostrare i cambiamenti acuti nei livelli di neurotrasmettitore extracellulare a seguito di una lesione di gravità variabile gradi^14,15,16,17. Tuttavia, oltre agli alti gradi di variabilità, il valore traslazionale di modelli come la goccia di peso a cranio aperto e l'impatto corticale controllato è ostacolato da una intrinseca mancanza di validità ecologica dovuta a 2 fattori: (1) questi modelli inducono le lesioni molto più gravi delle commozioni cerebrali legate allo sport subite negli esseri umani, con carico cerebrale diretto e (2) questi modelli richiedono una craniectomia o una craniotomia, la testa del roditore è completamente trattenuta in un telaio stereotassico, impedendo la rapida accelerazione e decelerazione della testa e del torso, riproducendo così male la biomeccanica della commozione cerebrale.

La microdialisi è un metodo minimamente invasivo che offre il chiaro vantaggio di campionare neurotrasmettitori come glutammato, GABA, taurina, glicina e serina, in vivo e continuamente a seguito di traumi, pur non dovendo sacrificare l'animale. Oltre ai vantaggi offerti dalla microdialisi, la Wayne State University ha sviluppato un modello di caduta di peso a cranio chiuso (al contrario di open-skull da altri modelli), che consente l'induzione di un mTBI su un roditore leggermente anestesizzato e sfrenato, permettendo così la rapida accelerazione e decelerazione della testa e del busto¹⁸. Come accennato in precedenza, l'accelerazione e la decelerazione della testa e del torso è una caratteristica biomeccanica fondamentale delle commozioni cerebrali legate allo sport osservate negli esseri umani che i precedenti modelli mTBI del roditore non sono riusciti ad affrontare. La procedura di caduta del peso può essere eseguita molto rapidamente e non richiede alcun intervento chirurgico precedente o incisione del cuoio capelluto. A seguito dell'induzione della commozione cerebrale, i roditori recuperano il riflesso di raddrizzamento quasi spontaneamente e non sperimentano paralisi, convulsioni o afflizioni respiratorie dopo un singolo impatto. Le emorragie intracraniche e le fratture del cranio sono rare e solo piccoli deficit nella coordinazione motoria sono stati segnalati nei roditori. Questo modello di ratto è facile da usare, poco costoso e facilita la quantificazione dei neurotrasmettitori rilasciati nella fase acuta dopo una commozione cerebrale senza rimuovere la sonda di microdialisi durante l'impatto.

Il nostro modello di ratto che combina microdialisi e commozione cerebrale è appropriato per i ricercatori che cercano di caratterizzare longitudinalmente gli effetti molecolari della commozione cerebrale e potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di studi terapeutici. Infatti, nonostante diversi anni di ricerca e un bisogno travolgente, nessun farmaco per prevenire gli effetti a lungo termine delle commozioni cerebrali ha superato la fase di sperimentazione clinica¹⁹. Una delle possibili ragioni di questi fallimenti potrebbe essere l'uso di modelli animali che non riproducono fedelmente le forze biomeccaniche traumatiche delle commozioni cerebrali sperimentate dagli esseri umani. Il metodo qui presentato incontra la definizione di commozioni cerebrali umane che specifica che la lesione cerebrale primaria è indotta da un impatto smussato, nonché una rapida accelerazione e decelerazione della testa e del busto^2,3.

Inoltre, il nostro modello combinato è appropriato per i ricercatori che studiano gli effetti di ripetute lesioni cerebrali traumatiche ripetute (rmTBI) poiché una delle sue caratteristiche chiave che lo distingue dagli altri modelli animali di commozione cerebrale è che permette di indurre ferite ripetute e lievi allo stesso caso¹⁸. Nell'uomo, rmTBI è associato a sintomi post-traumatici più gravi, tempi di recupero più lunghi e disturbi motori e cognitivi aggravati che tendono a diffondersi nel tempo^20,21. Altri modelli animali rilevanti hanno anche permesso di comprendere meglio la fisiofisiologia post-traumatica di rmTBI^{22,23,24,25,26,27} . Aumento della vulnerabilità cerebrale è stato dimostrato in roditori dopo un minimo di 5 mTBI a intervalli di 24 h. La neuroinfiammazione aumenta con il numero di mTBI sperimentati e i marcatori di neurodegenerazione appaiono²⁸. MTBI ripetuto impedirebbe la transizione di microglia da una modalità proinfiammatoria a una modalità normale di recupero, con conseguente prolungata attività eccitotossico e l'attivazione di meccanismi neurodegenerativi ²⁹. Con il nostro modello, i ratti potrebbero essere esposti a 1 impatto al giorno nel periodo di 1 settimana per un totale di 5 esposizioni. Data la semplicità di questo modello animale, potrebbe facilitare la caratterizzazione degli effetti cumulativi del rilascio del neurotrasmettitore indiscriminato acuto che si verifica immediatamente dopo un mTBI.

Questo modello permette anche agli animali di essere facilmente esposti a 2 impatti al giorno, rendendo possibile studiare condizioni ancora più gravi come quando un atleta riceve un altro impatto traumatico in breve tempo dal primo colpo³⁰. Come dimostrato in uno studio precedente³¹, la tempistica di un secondo colpo alla testa può influenzare drammaticamente danni vascolari e assonali. Più vicino è il secondo colpo al primo colpo, più dannose sono le conseguenze. Questo modello è appropriato per studiare come questa particolare condizione influisce sul rilascio di neurotrasmettitore extracellulare.

In questo metodo, l'ippocampo è stato utilizzato come regione di interesse a causa della sua rilevanza nella ricerca a concussione, ma campioni di microdialisi possono essere raccolti anche da altre regioni di interesse. Tuttavia, qualsiasi altra regione del cervello deve essere considerata a causa dello spazio lasciato dal sito di impatto dalla cannula guida, compreso il cemento dentale che lo circonda, può occupare una notevole quantità di spazio sulla testa del ratto. In aggiunta a questo, i parametri di microdialisi presentati in questo metodo come il taglio del peso molecolare della membrana e la lunghezza attiva, gli intervalli di tempo di campionamento e la portata possono essere regolati in base al tipo di molecola studiata. L'efficiente raccolta di citochine pro-infiammatorie coinvolte in commozioni cerebrali, ad esempio, richiederebbe una membrana con una dimensione dei pori molto più grande.

Protocollo

Il protocollo sugli animali per questo progetto ha ottenuto l'approvazione da parte del Comitato per la cura degli animali dell'Hopital du Sacre-Càur de Montreal in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care.

NOTA: Uno schema del protocollo di ricerca è presentato nella Figura 1.

1. Preparazione degli animali

1. Ordinare ratti Sprague-Dawley da un fornitore di animali di laboratorio standard da consegnare tra 43 e 50 giorni di età e ad un peso compreso tra 151 e 200 g.
2. Casa tutti i ratti individualmente in un ciclo di 12:12 h luce: buio, a 24-26 gradi C con accesso ad libitum per l'acqua e il cibo.
3. Durante le 2 settimane prima di iniziare il protocollo, gestire i ratti per 5 min su base giornaliera per facilitare la loro abitudine a contatto con i ricercatori. I ratti devono essere invecchiati circa 10 settimane e il loro peso dovrebbe essere compreso tra 295 e 351 g al momento della commozione cerebrale o dell'induzione di lesioni da sussidio.

2. Guida alla microdianalisi Chirurgia dell'impianto di applicazione

1. Eseguire l'intervento chirurgico in condizioni sterili. Indossare guanti sterili, un cofano per capelli e una maschera chirurgica per tutta la procedura. Autoclave e sterilizzare tutti i materiali e gli strumenti chirurgici in anticipo. Pulire e disinfettare a fondo l'area di lavoro e l'apparato stereotassico con una soluzione di etanolo (70%).
2. Anestesizzare gli animali iniettando un cocktail di ketamina (70 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) perinperitonealmente. Asses profondità anestetica testando il riflesso per un pizzico di toe.
3. Rimuovere la pelliccia dalla testa dell'animale utilizzando clipper elettrici. Testa pulita con una soluzione del 2% di alcol isopropile e 2% di gloresidine gluconato (3 volte). Applicare unguento oculare lubrificante durante l'anestesia per prevenire la secchezza.
4. Drappo del campo chirurgico in modo che solo la testa dell'animale è esposta. Posizionare la testa del ratto in un apparato stereotassico, inserire le barre dell'orecchio nei gradini uditivi con grande cura quindi stringere il morsetto del naso. Fissare una cannula guida in acciaio inossidabile da 26 G al braccio di supporto sull'apparato stereotassico.
5. Iniettare localmente un cocktail anestetico di bupivacaina (1,5 mg/kg) e lidocaina (1,5 mg/kg) sottocutanea sulla testa, 10 minuti prima dell'incisione.
6. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura fornendo isoflurane di sodio (2,5%) a 0,5 L/min flusso di ossigeno con un cono naso.
7. Fare un'incisione mediana (3 cm) lungo il cuoio capelluto con un bisturi. Lasciare il cranio libero installando 4 morsetti intorno all'incisione.
8. Raschiare saldamente il periosteo dal cranio con una lama chirurgica fino a quando le suture Bregma e Lambda sono visibili. Mantenere una pressione ferma sul cranio con un tampone di garza o applicatore con punta di cotone se c'è sanguinamento.
9. Verificare se il cranio è correttamente allineato sull'apparato stereotassico confrontando le coordinate dorsoventrali delle suture Bregma e Lambda. Identificare le coordinate anteroposteriori, mediolaterali e dorsoventrali della sutura Bregma come punti di riferimento per le coordinate della cannula guida.
10. Prendendo le coordinate della sutura di Bregma come riferimenti, calcolare le coordinate del sito di impianto della cannula guida nell'ippocampo.
    NOT: Le seguenti coordinate sono state determinate in base all'atlante cerebrale del ratto di Paxinos e Watson (anteroposteriore: -0,60 cm; mediolaterale: 0,58 cm; dorsoventral: -0,16 cm, Figura 2A)³².
11. Contrassegnare il sito di impianto preciso utilizzando un pennarello.
12. Forare un foro di 0,5 mm attraverso il cranio nel sito di destinazione della cannula guida. Forare altri 3 fori circa 5 mm intorno a questo punto per infilare 3 viti di ancoraggio nel cranio che solidificheranno la cannula dopo l'applicazione di cemento dentale acrilico.
13. Inserire la cannula nell'ippocampo e fissarla con cemento dentale. Questa cannula sarà utilizzata per inserire la sonda nella regione di interesse 7 giorni dopo durante la procedura di microdialisi. Fare attenzione a non versare il cemento dentale in eccesso intorno al sito in cui il peso verrà lasciato cadere.
14. Lasciare asciugare il cemento per 2 min, quindi rimuovere il braccio di supporto dalla cannula. Inserire un obturatore rimuovente in acciaio inossidabile nel cannula per evitare indedie liquidi cerebrospinali e rischi di infezione.
15. Rimuovere i 4 morsetti, tirare indietro la pelle retratta e cucirla con un filo di sutura chirurgica 4-0.
16. Togliere il ratto dall'apparato e iniettare la buprenorfina sottocutanea per trattare il dolore (0,05 mg/kg, dopo l'intervento chirurgico poi una volta al giorno durante i successivi 2 giorni). Riporre il roditore nella sua gabbia con un pad di riscaldamento sotto fino a quando non diventa cosciente, quindi restituirlo all'impianto di cura degli animali per un periodo di recupero di 7 giorni sotto stretto monitoraggio.

3. Procedura di microdialisi

1. Durante l'esecuzione della procedura di microdialisi, indossare guanti sterili, un cofano per capelli e una maschera chirurgica. Sette giorni dopo l'intervento di impianto di cannula, anestesizzare il ratto con isoflurane di sodio (2,5%) a 0,5 l/min flusso di ossigeno.
2. Togliere l'obturatore dalla cannula e inserire lentamente una sonda di microdialisi, perfusa con liquido spinale cerebrale artificiale (ACSF) (26 mmol/L NaHCO₃, 3 mmol/L NaH₂PO₄, 1,3 mmol/L MgCl₂, 2,3 mmol/L CaCl₂, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-ascorbico acido), attraverso la cannula nell'ippocampo o in altre regioni di interesse.
   NOT: I ratti devono essere anestesizzati solo rimuovendo l'obturatore e inserendo la sonda di microdialisi, e durante l'induzione di commozione cerebrale o lesioni finte. Le sonde utilizzate qui sono costruite in laboratorio, a forma di I e comprendono linee di uscita di silice affiancate affiancate [diametro interno (ID): 50 m] racchiuse in tubi in polietilene (ID: 0,58-0,38 mm). L'estremità della cannula è fissata con una lunghezza di membrana di cellulosa cava rigenerata [peso molecolare cut-off: 13 kDa, diametro esterno (OD): 216 m; ID: 200 m] con adesivo cianoacrilato e la punta sigillata con resina epossidica. La membrana attiva misura 2,5 mm per l'impianto nell'ippocampo, ma può essere regolata in base alla profondità della regione di interesse. Il collegamento della cannula isolante del ratto alla sonda è fissato con un collare in acciaio inossidabile filettato montato.
3. Fissare il gruppo della sonda su una molla in acciaio inossidabile legata a un braccio girelle liquido e a una leva di controbilanciatura sospesa sopra la gabbia con un supporto ad anello e morsetti in modo che l'animale possa muoversi liberamente all'interno della sua gabbia. I ratti leterati trascorrono l'intera durata della procedura di microdialisi con accesso al libitum ad acqua e cibo.
4. Utilizzare una pompa di microinfusione per inviare il perferrore alle sonde e raccogliere il dialisato dalla linea di uscita di silice fusa (volume morto: 0,79 l).
5. Almeno 1 h e 30 min prima dell'inizio della procedura, alzare la sonda alla sua portata di lavoro (1 l/min). Verificare che la portata della sonda sia costante misurando il volume nel tempo con una pipetta.
   NOT: La portata può essere più o meno a seconda dei neurotrasmettitori campionati e della regione del cervello di interesse. I campioni di dialisi vengono prelevati prima, durante e dopo l'induzione di commozione cerebrale o di lesioni da simalenza. L'intervallo di campionamento dipende dalla regione di interesse del cervello, dai neurotrasmettitori analizzati, dalle concentrazioni di dialisati dell'analita e dalla sensibilità dell'apparecchiatura chimica analitica utilizzata. Le fasi di raccolta effettuate qui nell'ippocampo per il glutammato e il campionamento di GABA sono le seguenti:
   1. Base: All'inizio dell'esperimento, raccogliere campioni di dialisi a intervalli di 10 min per 60 min.
   2. Post-commozione cerebrale o lesioni da farsi: Dopo commozione cerebrale o lesioni da farsa, raccogliere campioni per ulteriori 90 min (9 campioni).
6. Raccogliere ogni campione di dialisato in una fiala frazionaria precaricata con 1,25 l'acido perclorrico 0,25 per prevenire la degradazione dell'analita. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi per l'analisi successiva.
7. Dopo la raccolta dell'ultimo campione di dialisato, anerare il ratto con un cono nasale che fornisce isoflurane di sodio (2,5%) a 0,5 l/min flusso di ossigeno.
8. Rimuovere la sonda di microdialisi dalla cannula, reinserire l'obturatore e quindi restituire il ratto all'impianto di cura degli animali.

4. Installazione di Concussion Apparatus

1. Prima dell'inizio della procedura, intagliare un peso da utilizzare per infliggere la commozione cerebrale (19 mm di diametro) da ottone solido per ottenere una massa di 450 g. Inserire un anello metallico nella parte superiore del peso dell'ottone. Fori preliminari ad una distanza di 1,0 m all'interno di un tubo guida di cloruro di polivinile verticale (PVC).
2. Taglio di un foglio di alluminio con una lama affilata. Il foglio di alluminio scanalato dovrebbe sostenere il peso del ratto (295 a 351 g) senza interferire con l'accelerazione del suo corpo dopo l'impatto della testa dal peso dell'ottone.
3. Nastro il foglio di alluminio scanalato strettamente a un telaio in plexiglas a forma di U (38 cm di lunghezza x 27 cm di profondità x 30 cm di profondità, Figura 3A,B) che contiene un cuscino di schiuma (37 cm di lunghezza x 26 cm di larghezza x 12 cm di profondità).
4. Posizionare il telaio Plexiglas sotto un tubo guida in PVC (20 mm di diametro x 1,5 m di lunghezza).
5. Tenere il tubo guida in PVC in posizione con un supporto di morsetto 3,5 cm sopra l'alluminio scanalato.
6. Fissare una linea di pesca a mosca in nylon (capacità di 9,1 kg, 0,46 mm di diametro) attraverso l'anello metallico in modo che il fondo del peso si appiccichi di 2,5 cm sopra l'alluminio scanalato per evitare più colpi quando il ratto cade sul cuscino di schiuma dopo l'impatto.
7. Attaccare la lenza di pesca a mosca in nylon al supporto del morsetto.
8. Tirare il peso attraverso il tubo in PVC con la linea di pesca a mosca in nylon, quindi tenerlo in posizione inserendo una chiave esagonale attraverso i fori preliminari forati a 1,0 m.

5. Induzione da commozione cerebrale

1. Dopo la fase di base della raccolta di campioni di dialisi, anendizzare leggermente il ratto posizionando un cono nasale che fornisce isoflurane di sodio (2,5% di isoflurane a 0,5 L/ min flusso di ossigeno) fino a quando non come nessuna risposta a un pizzico di toe (come menzionato nella sezione 3.1).
2. Posizionare l'animale sul petto sul foglio di alluminio scanalato in modo che la sua testa sia posizionata direttamente nel percorso del peso dell'ottone (Figura 3C,D). Mantenere l'anestesia con il cono del naso per assicurarsi che il ratto non si muova o si svegli prima che il peso lo colpisca.
3. Rimuovere il cono naso e tirare il tasto esadecimale. Il peso cadrà verticalmente attraverso il tubo in PVC e impatterà la testa del ratto. Il ratto subirà una rapida rotazione di 180 gradi e atterrerà sulla schiena (Figura3E).
4. Togliere il ratto dal cuscino di schiuma e posizionarlo sulla schiena nella gabbia.
5. Utilizzare un timer digitale per misurare il tempo di raddlogio raddgiusto come segno di recupero e gravità degli infortuni. Il tempo di raddorgzione del riflesso è il tempo totale dall'impatto fino a quando i roditori si svegliano e si rinnegano spontaneamente alla posizione prona dalla posizione supina, o iniziano a camminare. Notare eventuali segni di morte, frattura o sanguinamento.
   NOT: La procedura può essere ripetuta sullo stesso soggetto in diversi momenti per commozioni cerebrali ripetute.

6. Induzione Sham

1. Dopo la fase di base della raccolta di campioni di dialisi, anantezzare leggermente il ratto mettendo un cono naso che fornisce isoflurane di sodio (2,5%) a 0,5 L/min di flusso di ossigeno fino a quando non è risposta a un pizzico di dita dei tempi (come menzionato nella sezione 3.1).
2. Posizionare l'animale sul petto sul foglio di alluminio scanalato in modo che la sua testa si sdrai direttamente nel percorso del peso dell'ottone. Mantenere l'anestesia con il cono del naso per assicurarsi che il ratto non si muova o si svegli.
3. Rimuovere il cono naso e rimuovere l'animale dal foglio di alluminio senza tirare il tasto esadecimale. Il ratto non subirà una rapida rotazione di 180 gradi.
4. Mettere il topo sulla schiena nella sua gabbia.
5. Utilizzare un timer digitale per misurare il tempo di raddgiusto come indicatore del ripristino neurologico.

7. Cromatografia Liquida ad alte prestazioni

1. Determinare i livelli di neurotrasmettitore (ad esempio, glutammato e GABA) mediante derivazione della precolonna utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevamento della fluorescenza a separazione rapida e un sistema costituito da un autocampionatore a separazione rapida e una pompa accoppiata ad una colonna analitica di 3,0 x 50 mm di 5 m.
2. Preparare una fase mobile con 100 mmol/L fosfato disfato dibase dibase dibase dibase dibase dibase dibasedino (Na₂HPO₄), 3.5% acetonitrile e 20% di metanolo. Regolare il pH a 6,7 con acido fosforico (85%) in base alle esigenze.
3. Impostare la portata su 0,5 mL/min.
4. Preparare reagenti di derivazione giornaliera e standard di lavoro (100 ng/mL) da soluzioni azionarie. Caricarli in un autocampione refrigerato (10 oC) con campioni.
5. Mescolare ogni frazione in sequenza nella colonna analitica con 20 -L di 3-mercaptopropionic acid (0.071 mol/L) diluito con H₂O e 20 L di o-phthaldehyde (0,0143 mol/L) diluito con 0,1 mol/L tetraborate di sodio. Lasciare 10 min per il mix di reagire.
6. Per evitare la contaminazione dei campioni successivi, lavare il ciclo di iniezione con metanolo (20%), dopo ogni iniezione.
   NOT: Il tempo di ritenzione del glutammato sarebbe di 1 min approssimativamente in questo protocollo, per un tempo di esecuzione totale di 30 min per ogni campione.
7. Durante l'analisi dei picchi cromatografici, identificare i picchi sconosciuti utilizzando campioni corrispondenti in base al tempo di conservazione da standard noti. Esprimere i livelli di analiti come g/mL.

8. Istologia

1. Un mese dopo la procedura di microdialisi e la commozione cerebrale o l'induzione da lesioni cerebrali, anestesizzare gli animali iniettando un cocktail di ketamina (70 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) intraperitonelalmente ed eutonizzare con paraformaldeide (4%) e perfusione intracardiaca salina.
2. Decapitare i roditori poi sezionare il cervello.
3. Conservare i cervelli in paraformaldeide (4%) e successivamente li crioproteggere in una soluzione di saccarosio (30%).
4. Affettare il cervello in sezioni coronali di 50 m con un criostato.
5. Macchiare le fette di cervello con cresil viola per la verifica istologica della lesione e posizionamento sonda (nissl colorazione).

Risultati

Utilizzando il nostro modello di commozione cerebrale che combina forza e rotazione con microdialisi cerebrale in vivo, il glutammato extracellulare acuto e gabA cambia nel tempo a seguito di una commozione cerebrale o di lesioni sham sono stati studiati in 21 ratti maschi, adulti, Sprague-Dawley l'impianto di una guida cannula nella regione CA1 dell'ippocampo.

Verifica istologica del posizionamento e dell'infortunio della sonda
Nessun cambiamento morfologico come emorragie o contusioni intracerebrali massicce sono stati segnalati a seguito della verifica istologica del danno del tessuto ippocampo su sezioni macchiate di viola cresilo. Guidare l'impianto di cannula e microdialisi inserimento della sonda indotto minore e danni simili tra casi feriti e farsa. Inoltre, non rimuovere la sonda prima di lesioni finte o induzione di commozione cerebrale non ha prodotto alcun danno distinguibile del tessuto ippocampo visto sotto un microscopio (Figura 2B, C, rispettivamente), con la membrana della sonda ancora intatta successivamente (Figura 2D,E). Cervelli a concussione e finta lesione perfusa con paraformaldeide (4%) 1 mese dopo le procedure di microdialisi sono indistinguibili al momento dell'ispezione visiva (Figura2F, G).

Radddestrare il tempo riflesso
Gli animali del gruppo ferito hanno avuto un tempo di resecuzione significativamente aumentato in media rispetto acasisi di casi fittizi (test t di Student, p - 0,042801) (Figura 4) e sembravano storditi dopo aver ripreso conoscenza. Dei 10 casi del gruppo di commozione cerebrale, un singolo animale ha mostrato lievi segni di sanguinamento sotto il sito di impatto dopo la caduta di peso. Non sono stati osservati altri segni di frattura del cranio o sanguinamento intracranico.

Microdialisi cerebrale in vivo
Per fungere da risultati rappresentativi del nostro metodo, quindici campioni di dialisato da 10 ll sono stati estratti dall'ippocampo, in vivo, ad intervalli di 10 min e una portata di 1 livelli extracellulari di glutammato e GABA sono stati misurati da 6 campioni durante la linea di base ( 60 min) e da 9 campioni a seguito di induzione di lesioni finte o commozione cerebrale (90 min).

Concentrazioni extracellulari di glutammato
Sono stati osservati aumenti significativi delle concentrazioni di glutammato extracellulari nella regione CA1 dell'ippocampo durante i primi 10 min a seguito dell'induzione del trauma rispetto alla lesione fittizia (Mann-Whitney U Test, p - 0,009175) (Figura 5). Nessun'altra differenza nelle concentrazioni di glutammato è stata osservata tra i gruppi in qualsiasi altro momento.

Concentrazioni extracellulari di GABA
Non sono stati osservati cambiamenti significativi nelle concentrazioni di GABA nella regione CA1 dell'ippocampo durante i primi 10 min a seguito di induzione di traumi rispetto a lesioni fittizie (Mann-Whitney U Test, p - 0,943861) (Figura 6). Non c'era altra differenza significativa nelle concentrazioni di GABA in qualsiasi altro punto di tempo tra casi di commozione cerebrale e casi di lesioni fittizie.

Figura 1: Schema del protocollo di ricerca. Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Verifica istologica del posizionamento della sonda e delle lesioni. (A) Vista coronale della sonda di microdialisi e del sito di posizionamento della cannula guida nell'ippocampo utilizzando l'atlante stereotassico di Paxinos e Watson. (B) Fotomicrografia rappresentativa del danno del tessuto dell'ippocampo (cresil violet) prodotta da una sonda di microdialisi e guida la cannula da un caso di lesioni finte. (C) Fotomicrografia rappresentativa del danno del tessuto dell'ippocampo (cresil viola) prodotta da una sonda di microdialisi e guida la cannula da un caso di commozione cerebrale. (D) Fotomicrografo rappresentativo di una sonda di microdialisi prima dell'induzione di commozione cerebrale. (E) Fotomicrografia rappresentativa di una sonda di microdialisi dopo l'induzione della commozione cerebrale. La membrana è ancora intatta. (F-G). Rappresentante fotomicrografo di una farsa (F) e commozione cerebrale (G) ferito dopo perfusione con 4% paraformaldeide a 1 mese dopo lesioni cerebrali o commozione cerebrale. Al momento dell'ispezione visiva, i 2 cervelli sono indistinguibili. Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Apparecchi di commozione cerebrale e microdialisi componenti componenti componenti essenziali. (A) Una fotografia dell'intero assieme costituita da un tubo guida di cloruro di polivinil verticale (PVC) per il peso in caduta situato sopra lo stadio del ratto, telaio in plexiglas, cuscino di schiuma, pompa a microinfusione controllata da computer, siringhe a tenuta stagna, liquido girelle, e fianco a fianco fusa silice linee di presa di steglie. (B) Rappresentazione schematica del telaio in plexiglas e del cuscino di schiuma con tutte le dimensioni pertinenti. (C) Una fotografia del pezzo scanalato di foglio di alluminio che funge da palcoscenico di ratto sopra il cuscino di schiuma. (D) Una fotografia che mostra il posizionamento del ratto sullo stage immediatamente prima dell'impatto alla testa da parte del peso che cade. (E) Una fotografia che mostra il ratto dopo l'impatto della testa, illustrando la rotazione orizzontale di 180 gradi del corpo del ratto dopo l'impatto della testa e la conseguente accelerazione e rotazione. Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tempo di rinstallazione. Rappresentazioni dell'istogramma del tempo impiegato dai ratti per svegliarsi dall'anestetico e capovolgersi dalla posizione supina alla posizione prona o iniziare a camminare dopo la commozione cerebrale (diamanti rossi, n - 10) o lesioni finte (quadrati blu, n . 11). I ratti del gruppo di commozione cerebrale hanno richiesto molto più tempo per rincaro rispetto al gruppo di lesioni finte. I valori medi sono rappresentati come una linea orizzontale in ogni grafico. : p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001. Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Concentrazioni extracellulari di glutammato. Concentrazioni extracellulari medie di glutammato misurato dalla microdialisi nell'ippocampo durante la linea di base (60 min) e dopo la commozione cerebrale (diamanti rossi, n 10) o lesioni fittizie (piazze blu, n - 11) condizioni (90 min). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. - P < 0,05, . Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Concentrazioni extracellulari di GABA. Concentrazioni extracellulari medie di GABA (g/mL) misurate mediante microdialisi nell'ippocampo durante la linea di base (60 min) e dopo la commozione cerebrale (diamanti rossi, n - 10) o lesioni fittizie (quadrati blu, n - 11) condizioni (90 min). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. - P < 0,05, . Questa cifra è stata modificata da IO Masse 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Per la generazione di risultati affidabili, i passaggi critici di questo protocollo richiedono particolare attenzione. Durante l'intervento di impianto di cannula, evitare di utilizzare più cemento del necessario, soprattutto quando è molto liquido per prevenire la fuoriuscita sul sito di impatto. Per evitare di bloccare il sito di impianto, utilizzare un obturatore della stessa lunghezza della cannula. Durante la procedura di microdialisi, inserire lentamente la sonda nella cannula e assicurarsi che sia inserita completamente per il campionamento del dialisato. Prima dell'induzione della commozione cerebrale, assicurarsi che il foglio di alluminio sia correttamente scanalato con una lama affilata. In caso contrario, l'impatto dal peso dell'ottone non sarà sufficiente per strappare il foglio di alluminio e il ratto rimarrà petto verso il basso invece di subire una rotazione di 180 gradi e atterrare sulla schiena. Se questo è il caso, le lesioni indotte deriveranno dall'impatto smussato, non diversamente da quello che si vede nei modelli di goccia di peso open-skull ed essere significativamente più gravi. Durante l'induzione della commozione cerebrale, evitare di influenzare la cannula con il peso in quanto ciò genererebbe danni critici al cranio del ratto. Si consiglia vivamente di lavorare in team di 2 per limitare gli errori di manipolazione durante l'esperimento.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Durante la procedura di microdialisi, il flusso deve essere costante e produrre un volume appropriato alla velocità di perfusione, una volta che la sonda è collegata alla pompa. Volumi più bassi possono indicare la presenza di intasamento nella membrana della sonda o bolle d'aria nelle linee. In caso di intasamento, la sonda deve essere scartata e sostituita. Tuttavia, le bolle d'aria possono essere espulse facendo circolare ACSF nelle linee. Se non c'è nessun intasamento o bolle d'aria annotate e non c'è ancora alcun flusso, una piccola parte del tubo di flusso più vicino alla fine può essere tagliata.

Limitazioni del metodo
Altri studi che utilizzano la Wayne State University di peso-drop hanno valutato alcuni cambiamenti strutturali e molecolari fondamentali¹⁸. Tuttavia, un'indagine più approfondita manterrebbe la legittimità di questa procedura. Le informazioni riguardanti i cambiamenti biologici e neuroanatomici che avvengono a livelli epigenetici e cellulari solidificherebbero ulteriormente il valore affidabile e traslazionale del nostro metodo. Inoltre, la valutazione della funzione cognitiva è una misura affidabile del risultato relativo a mTBI nei modelli di roditori³³. Mentre il time-to-right è stato misurato in questo protocollo ed è stato significativamente ritardato nei casi feriti rispetto ai casi fittizi, gli studi in futuro dovrebbero concentrarsi sulla misurazione metodica della funzione conoscitiva in seguito all'induzione di traumi nei roditori.

Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi.
Il significato principale del metodo è duplice: in primo luogo, permette l'induzione di una commozione cerebrale con la procedura Wayne State University, che consente una rapida accelerazione e decelerazione della testa e del busto. Con questo metodo, sono stati evitati gravi esiti di lesioni come arresti cardiorespiratori, frattura del cranio, alta mortalità e segni di contusioni cerebrali visibili nel sito di impatto. In secondo luogo, questa tecnica di microdialisi ha replicato con successo il precedente dimostrato il rilascio di glutammato extracellulare acuto e di breve durata che si svolge entro i primi 10 min a seguito di induzione del trauma^14,16. Inoltre, mantenere la sonda inserita durante l'intera procedura riduce significativamente la probabilità di indurre danni alla barriera emato-encefalica sensibile al mTBI legata all'inserimento ripetuto della sonda di microdialisi³⁴.

Applicazioni future o indicazioni del metodo.
Considerati gli aspetti facili da usare della procedura di caduta di peso della Wayne State University e i cambiamenti acuti del livello del neurotrasmettitore extracellulare misurati dalla microdialisi, il nostro modello di ratto che combina microdialisi e commozione cerebrale fornisce ai ricercatori un strumento per riprodurre fedelmente la biomeccanica del trauma craniocerebrale umano e longitudinalmente caratterizzare gli effetti molecolari delle commozioni cerebrali. Il nostro modello di ratto potrebbe anche essere utilizzato in una vasta gamma di studi terapeutici in quanto offre una preziosa opportunità per studiare il meccanismo e l'efficacia degli agenti farmacologici in vivo, continuamente e senza dover sacrificare l'animale. Inoltre, la disponibilità di un modello di ratto come quello qui presentato potrebbe notevolmente facilitare la migliore comprensione della relazione tra gli squilibri del neurotrasmettitore e le conseguenze comportamentali delle commozioni cerebrali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione degli animali
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Guida alla microdialisi Impianto di cannula Chirurgia
Ketamina cloridrato (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xilazina cloridrato (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Soluzione di clorexidina gluconato 2% e alcool isopropilico 2%	Carefusion	260100C
Lidocaina cloridrato	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaina cloridrato	Hospira	1559
unguento oftalmico	Baussh e Lomb inc.
Telaio stereotassico	Stoelting	51600
Braccio portacannula stereotassica	Apparecchio Harvard	72-4837
Trapano	Dremel	8050-N/18
Filettatura di sutura rivestito Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Apparecchio odontoiatrico in cemento acrilico	Harvard	72-6906
Viti	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Cannula fittizia 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Procedura di microdialisi
CMA 402 Pompa a siringa Harvard Apparatus	Canada	CMA-8003110
Microsiringa 2.5ml	Glass Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Clip per siringa Medium per 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Girevole a doppio canale rivestito in quarzo a bassa coppia	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Supporto per anello di supporto in ghisa	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Morsetti ad angolo regolabile	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
MgCl2 Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaCl Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
KCl Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
CaCl2 Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Pneumatico		più leggero	per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Colla epossidica	Pneumatico		canadesePer sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Super Glue Gel	Pneumatico		canadese per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Tubo termorestringente Diametro interno 0,063" Gardner Bender	Pneumatico		per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Ruote da taglio Dremel #409	Canadian Tire		Per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
BD Ago 26 Calibro 0,5 pollici PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Per sonde costruite in laboratorio
Ago BD 21 Calibro 1,5 pollici PrecisionGlide sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Per sonde costruite in laboratorio
Tubo in acciaio inossidabile 26G One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Per sonde da laboratorio
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH/30S	per sonde costruite in laboratorio Polymicro
Technologies Tubo capillare flessibile in silice fusa Diametro interno 50µ m, diametro esterno 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	Per Sonde Costruite in Laboratorio Spectra
Por 132294 Micro-Dialisi Membrane a Fibra Cava 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	Per Sonde Costruite in Laboratorio
Collare in acciaio inossidabile	Sirnay In.c	304	Per Sonde Costruite in Laboratorio / Custome made
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Apparecchio per commozione cerebrale
Ottone Peso	Rapido Mé tal Inc.		Fissare l'anello di metallo alla base
Metal Loop	Rona Inc.		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Tubo guida in PVC	Rona Inc.		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Foglio di alluminio	Alcan		Disponibile nella maggior parte dei negozi di alimentari
Nastro			disponibile in commercio
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Telaio in plexiglas a forma di U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.
Cuscino in schiuma	Mousse D& R Schiuma Inc.
Lame di rasoio	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Cronometro
			Disponibile nella maggior parte dei rivenditori di
articoli sportiviPreparazione degli animali
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Guida alla microdialisi Chirurgia dell'impianto di cannula
Ketamina cloridrato (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
xilazina cloridrato (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Soluzione di clorexidina gluconato 2% e alcool isopropilico 2%	Carefusion	260100C
Lidocaina cloridrato	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaina Cloridrato	Hospira	1559
Unguento oftalmico	Baussh e Lomb inc.
Telaio stereotassico	Stoelting	51600
Braccio portacannula stereotassica	Apparecchio Harvard	72-4837
Trapano	Dremel	8050-N/18
Filettatura di sutura rivestito Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Apparecchio odontoiatrico in cemento acrilico	Harvard	72-6906
Viti	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Cannula fittizia 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Procedura di microdialisi
CMA 402 Pompa a siringa Harvard Apparatus	Canada	CMA-8003110
Microsiringa 2.5ml	Glass Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Clip per siringa Medium per 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Girevole a doppio canale rivestito in quarzo a bassa coppia	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Supporto per anello di supporto in ghisa	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Morsetti ad angolo regolabile	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
MgCl2 Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaCl Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
KCl Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
CaCl2 Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	per liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Pneumatico		più leggero	per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Colla epossidica	Pneumatico		canadesePer sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Super Glue Gel	Pneumatico		canadese per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Tubo termorestringente Diametro interno 0,063" Gardner Bender	Pneumatico		per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Ruote da taglio Dremel #409	Canadian Tire		Per sonde costruite in laboratorio / Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
BD Ago 26 Calibro 0,5 pollici PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Per sonde costruite in laboratorio
Ago BD 21 Calibro 1,5 pollici PrecisionGlide sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Per sonde costruite in laboratorio
Tubo in acciaio inossidabile 26G One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Per sonde costruite in laboratorio
Tubi in polietilene PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Per sonde da laboratorio
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH/30S	per sonde costruite in laboratorio Polymicro
Technologies Tubo capillare flessibile in silice fusa Diametro interno 50µ m, diametro esterno 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	Per Sonde Costruite in Laboratorio Spectra
Por 132294 Micro-Dialisi Membrane a Fibra Cava 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	Per Sonde Costruite in Laboratorio
Collare in acciaio inossidabile	Sirnay In.c	304	Per Sonde Costruite in Laboratorio / Custome made
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Apparecchio per commozione cerebrale
Ottone Peso	Rapido Mé tal Inc.		Fissare l'anello di metallo alla base
Metal Loop	Rona Inc.		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Tubo guida in PVC	Rona Inc.		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
Foglio di alluminio	Alcan		Disponibile nella maggior parte dei negozi di alimentari
Nastro			disponibile in commercio
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Telaio in plexiglas a forma di U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.
Cuscino in schiuma	Mousse D& R Schiuma Inc.
Lamette da barba	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb.	Berkley Canadian Tire		Disponibile nella maggior parte dei negozi di ferramenta
	Cronometro
			Disponibile nella maggior parte dei rivenditori di articoli sportivi