Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.
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Articolo metodologico
Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite
In questo articolo
Sommario
Abstract
La guarigione delle ferite cutanee alterate è una delle principali preoccupazioni per i pazienti affetti da diabete e per le persone anziane, e c'è bisogno di un trattamento efficace. Approcci appropriati in vitro e in vivo sono essenziali per l'identificazione di nuove molecole bersaglio per i trattamenti farmacologici per migliorare il processo di guarigione della ferita cutanea. Abbiamo identificato la sottounità n. 3 di canali di calcio legati alla tensione (Cav-3) come una potenziale molecola bersaglio per influenzare la guarigione della ferita in due saggi indipendenti, vale a dire il saggio di migrazione del graffio in vitro e il modello di camera in vivo dorsale skinfold. Fibroblasti embrionali murici primari (MEF) acutamente isolati da topi selvatici (WT) e cav-3-decisi (Cav-3 KO) o fibroblasti acutamente isolati dai topi WT trattati con siRNA per down-regolare l'espressione del gene Cacnb3 , codificacazione Cavn.3, sono stati utilizzati. Un graffio è stato applicato su un monostrato cellulare confluente e la chiusura del gap è stata seguita prendendo immagini microscopiche in punti temporali definiti fino al ripopolamento completo del divario da parte delle cellule che migrano. Queste immagini sono state analizzate e il tasso di migrazione delle cellule è stato determinato per ogni condizione. In un test in vivo, abbiamo impiantato una camera dorsale a pelli su topi WT e Cav-3 KO, abbiamo applicato una ferita circolare definita di 2 mm di diametro, coperto la ferita con un coperchio di vetro per proteggerla da infezioni e disidratazione, e monitorato la chiusura della ferita macroscopica nel corso del tempo. La chiusura delle ferite è stata significativamente più veloce nei topi carenti di Cacnb3. Poiché i risultati degli esami in vivo e in vitro sono correlati bene, il saggio in vitro può essere utile per lo screening ad alto rendimento prima di convalidare i colpi in vitro del modello di guarigione della ferita in vivo. Ciò che abbiamo mostrato qui per i topi o le cellule di tipo selvatico e Cav-3-deciziali potrebbe essere applicabile anche a molecole specifiche diverse da Cav.
Introduzione
La guarigione della ferita cutanea inizia immediatamente dopo la lesione cutanea al fine di ripristinare l'integrità della pelle e per proteggere l'organismo dalle infezioni. Il processo di guarigione della ferita passa attraverso quattro fasi sovrapposte; coagulazione, infiammazione, formazione di nuovi tessuti e rimodellamento dei tessuti1. La migrazione cellulare è fondamentale in queste fasi. Cellule infiammatorie, cellule immunitarie, cheratinociti, cellule endoteliali e fibroblasti vengono attivati in diversi punti temporali e invadono l'area della ferita2. I metodi per studiare la guarigione delle ferite in vitro ....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate ed eseguite in conformità con i regolamenti etici e i comitati per il benessere degli animali della Saarland e dell'Università di Saarland.
1 Coltura cellulare primaria e trasfezione del siRNA
NOTA: nel metodo descritto, vengono utilizzati fibroblasti primari. Queste cellule svolgono un ruolo cruciale nella guarigione delle ferite e nel rimodellamento dei tessuti11. In questo esperimento, il gene Cacnb3, che codifica la sottounità Cav3 dei canali di calcio ad alta tensione12 è stato abbassato, mostrando cos....
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Risultati
Il saggio di graffio è stato eseguito su un monostrato di cellule confluenti di MEF di tipo selvaggio e a 3 persone (Figura 1c). Dopo aver eseguito il "scratch" utilizzando una punta di pipetta da 200, le cellule di entrambi i genotipi migrano nell'area del graffio e chiudono il divario. Le immagini sono state scattate dopo 6, 10 e 30 h (Figura 1a). La migrazione cellulare è stata quantificata come percentuale (%) dell'area scra.......
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Discussione
In questo manoscritto, descriviamo un test di guarigione delle ferite in vitro e in vivo e correliamo i risultati ottenuti. Per il saggio in vitro, abbiamo usato fibroblasti di topo primari4,14,15 che svolgono un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nella ristrutturazione dei tessuti11. Possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule aderenti che crescono come monostrati (ad esempio, cel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Dott.ssa Petra Weissgerber e l'Unità Transgene dell'impianto animale SPF (progetto P2 di SFB 894) della Facoltà di Medicina e la struttura animale presso l'Istituto di Chirurgia Clinica e Sperimentale presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Saarland, Homburg. Ringraziamo il dottor Andreas Beck per la lettura critica del manoscritto. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, dal progetto A3 per A.B. e V.F.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,9 % NaCl | |||
| 1 ml siringhe | BD Plastipak | 303172 | |
| piastra a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Punzone per biopsia | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Crema | qualsiasi depilazione crema | ||
| Dexpantenolo 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Diidrossilidinotiazina cloridrato (xilazina) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Siero fetale bovino | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Dado | |||
| Ketamina cloridrato | Zoetis | KETASET | |
| Microscopio ottico | Keyence, Osaka, Giappone | BZ-8000 | Microscopi simili potrebbero essere utilizzati |
| Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forcipe | |||
| Micro-forbici | |||
| Mouse contentore | Forbici | ||
| Obiettivo | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Suture | |||
| Cacciavite | |||
| Pelle disinfettante (octeniderm) | Schü lke & Mayr GmbH | 118212 | |
| testa cilindrica con intaglio | |||
| Anello | |||
| Pinza | |||
| Microscopio operatorio con fotocamera | Leica | Leica M651 | |
| Telai in titanio per la camera delle pieghe cutanee | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire Piler |
Riferimenti
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M.
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Ristampe e permessi
