Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Summary

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Abstract

La spettroscopia a forza cellulare atomica (AFM-SCFS) è un potente strumento per studiare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Questa tecnica consente di sondare i punti di forza e la dinamica di interazione su una membrana cellulare viva, compresi quelli tra le cellule, il recettore e i ligandi, e insieme a molte altre variazioni. Funziona anche come meccanismo per fornire uno stimolo fisico o biochimico su singole cellule in modo spatiotemporalmente controllato, consentendo così l'attivazione di cellule specifiche e i successivi eventi cellulari da monitorare in tempo reale quando combinati con le cellule vive l'imaging a fluorescenza. Il passo chiave in queste misurazioni AFM-SCFS è la funzionalizzazione a sbalzo AFM, o in altre parole, allegando un argomento di interesse al cantilever. Qui, presentiamo metodi per modificare i cantilever AFM con una singola cellula T e una singola perla di polistirolo rispettivamente per gli studi immunologici. Il primo prevede una colla biocompatibile che associa singole cellule T alla punta di uno sbalzo piatto in una soluzione, mentre la seconda si basa su una colla epossidica per l'adesione a perline singola nell'ambiente atmosferico. Vengono fornite anche due applicazioni immunologiche associate a ogni modifica a sbalzo. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati a diversi tipi di cellule e particelle solide.

Introduction

La microscopia a forza atomica (AFM), uno strumento versatile, ha trovato molte applicazioni nella ricerca sulla biologia cellulare^1,2,3,4,5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione, la funzione nativa di sonda di forza consente di studiare direttamente le proprietà biofisiche delle cellule viventi in situ al livello a cella singola^6,7. Questi includono le rigidità delle strutture subcellulari o anche le cellule intere

Protocol

Il protocollo di sperimentazione dei topi segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Tsinghua

1. Funzionalizzazione a sbalzo con singole cellule T

1. Preparazione delle cellule di milza del topo
   1. Sacrificare il topo (8-16 settimane di età (entrambi i sessi); ceppo C57BL/6) utilizzando anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale.
   2. Pulire il mouse con il 75% di etanolo e fare un'incisione della pelle midline seguita da splenectomia.
   3. Omogeneizzare la milza in 4 mL di PBS contenente 2% siero bovino fetale (FBS) utilizzando vetrini di vetro e rimuovere gli aggregati e detriti pass....

Results

La figura 4A mostra le tipiche curve di distanza della forza dall'interazione di legame tra cella a T singola e single-DC in un ciclo di avvicinamento-retratto. La curva rosso chiaro è la curva di estensione e quella rossa scura è la curva di retrazione. Poiché la curva di estensione viene in genere utilizzata per l'indentazione o l'analisi della rigidità, qui si tratta solo della curva di retrazione per l'adesione cellulare. Il valore minimo (il cerchio verd.......

Discussion

La spettroscopia a forza singola basata su AFM si è evoluta per essere un potente strumento per affrontare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Per tali applicazioni, il cantilever deve essere funzionalizzato correttamente al fine di sondare interazioni o proprietà specifiche sulle cellule di interesse. Qui, i metodi per l'accoppiamento di una singola cellula T e di un singolo tallone di dimensioni micron al cantilever senza punta sono descritti rispettivamente. Per attaccare una singola cellula T al cantilever.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale
10 μ l puntale per pipetta	Thermo Fisher	104-Q
Tubo da 15 ml	Corning	430791
Piastra di coltura da 6 cm di diametro	NALGENE nunc	150462
Piastra di coltura a 6 pozzetti	JET	TCP011006
AFM Cantilever	NanoWorld	Arrow-TL1-50	cantilever senza punta
β-Mercaptoetanolo	Sigma	7604
Colla biocompatibile	BD Cell-Tak	354240
CD4+ Isolamento delle cellule T Cocktail	STEMCELL	19852C.1
Linea cellulare DC2.4	Un regalo da K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Particelle magnetiche rivestite di destrano	STEMCELL	SV30010
EDTA	GENEray	Generay-E1101-500 ml
Epossidico	ERGO	7100
Etanolo	twbio	00019
FBS	Ex Cell Bio	FSP500
FcR bloccante	STEMCELL	18731
Vetrino coprioggetto	venditore locale (Hai Men Lian Sheng)	HX-E37	24 mm di diametro, spessore 0,17 mm
Vetrini	JinTong dipartimento di laboratorio e gestione delle attrezzature, Haimen	N/A	personalizzato
H2O2 (30%)	Sino pharm	10011218
H2SO4	Sino pharm	80120892
HEPES	Sigma	51558
Magnete	STEMCELL	18000
Filtro in nylon a rete	BD Falcon	REF 352350
Moesin-EGFP	N/A		clonato in laboratorio
Kit di isolamento positivo per cellule Treg CD25 di topo	STEMCELL	18782	Componente: Blocco FcR, cocktail di selezione positiva per cellule T regolatorie, cocktail di selezione PE, destrano RapidSpheres,
topo CD4+ Kit di isolamento delle cellule T	STEMCELL	19852	Componente: Cocktail di isolamento delle cellule CD4+T, streptavidina RapidSpheres, siero di ratto
NaOH	Lanyi prodotti chimici co., LTD? Pechino	1310-73-2
PBS	Solarbio	P1022-500
PE selezione	cocktail STEMCELL	18151
Penicillina-Streptomicina	Hyclone	SV30010
PLCδ-PH-mCherry	Addgene	36075
Microsfere di polistirene 6.0μ m	Polysciences	07312-5
tubo a fondo tondo in polistirene	BD Falcon	352054
Siero per ratti	STEMCELL	13551
RAW264.7	ATCC
Interleuchina-2 umana ricombinante	Peprotech	Peprotech, 200-02-1000
Tampone per lisi dei globuli rossi	Beyotime	C3702
Cocktail di selezione positiva delle cellule T regolatorie	STEMCELL	18782C
RPMI 1640		Life C11875500BT
Camera del campione	Fatto in
Particelle magnetiche rivestite di streptavidina	STEMCELL	50001
Kit di trasfezione	Clontech	631318
Tripsina 0,25% EDTA	Life	25200114
Pinzette	JD	N/A
Name	Company	Numero di catalogo	< strong>Comments
Equipment
20x obiettivo NA 0.8	Zeiss	420650-9901	Plan-Apochromat
Microscopio a forza atomica		JPK cellHesion200
Centrifuga	Beckman coltro	Allegra X-12R
Imaging	a fluorescenzamicroscop a fluorescenza a riflessione interna totale di tipo obiettivo fatto in casa basato su un supporto
Incubatore umidificato CO2 Thermo	Fisher	HERACELL 150i
Microscopio a luce invertita	Zeiss	Observer A1 manuale