Articolo metodologico

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

DOI:

10.3791/59624

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25 maggio 2019

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1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un approccio per purificare l'mRNA legato al ribosoma dalle cellule endoteliali vascolari (EC) direttamente nel cervello del topo, nei polmoni e nei tessuti cardiaci attraverso il tag genetico specifico della Proteina di fluorescenza verde avanzata (EGFP) nei ribosomi in combinazione con la purificazione dell'RNA .

Abstract

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Molti studi si sono limitati all'utilizzo di saggi cellulari in vitro e tessuti interi o all'isolamento di specifici tipi di cellule da animali per l'analisi in vitro del trascrittoma e dell'espressione genica mediante qPCR e sequenziamento dell'RNA. Il trascrittoma completo e l'analisi dell'espressione genica di specifici tipi di cellule in tessuti e organi complessi sarà fondamentale per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari con cui i geni sono regolati e la loro associazione con l'omeostasi dei tessuti e l'organo Funzioni. In questo articolo, dimostriamo la metodologia per l'isolamento dell'RNA legato al ribosoma direttamente in vivo nell'endotelio vascolare dei polmoni animali come esempio. Saranno descritti i materiali e le procedure specifici per la lavorazione dei tessuti e la purificazione dell'RNA, compresa la valutazione della qualità e della resa dell'RNA, nonché qPCR in tempo reale per i saggi genici arteriogenici. Questo approccio, noto come tecnica di purificazione dell'affinità ribosomiana (TRAP), può essere utilizzato per la caratterizzazione dell'espressione genica e l'analisi del trascrittoma di alcuni tipi di cellule direttamente in vivo in qualsiasi tipo specifico nei tessuti complessi.

Introduzione

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Nei tessuti complessi come il cervello, il cuore e il polmone dei mammiferi, gli alti livelli di eterogeneità cellulare complicano l'analisi dei dati di espressione genica derivati da campioni di tessuto intero. Per osservare i profili di espressione genica in un particolare tipo di cellula in vivo, recentemente è stata sviluppata una nuova metodologia, che consente l'interrogatorio dell'intero complemento di mRNA tradotto di qualsiasi tipo di cellula geneticamente definita. Questa metodologia è nota come tecnica di purificazione dell'affinità del ribosoma di traduzione (TRAP)1,2. È uno strumento utile per studiare la biologia endoteliale e l'angiogenesi quando combinato con la manipolazione genetica di altri geni associati all'angiogenesi negli animali.

Abbiamo dimostrato che la segnalazione angiogenica del PKD-1 e la trascrizione del gene angiogenico CD36 sono fondamentali per la differenziazione delle cellule endoteliali (EC) e l'angiogenesi funzionale3,4,5,6. Per determinare i meccanismi molecolari della segnalazione angiogenica e metabolica nella trascrizione genica e nella trasdifferenza EC, abbiamo creato topi TRAP geneticamente ingegnerizzati con geni angiogenici specificamente eliminati sulla base della tecnica TRAP1 , 2. Inoltre, nei nostri animali TRAP, non solo hanno pkd-1 o cd36 carenza genica nell'endotelio vascolare o deduzione globale del gene cd36, ma una proteina di fluorescenza verde migliorata (EGFP) è anche geneticamente etichettata su La CE sta traducendo i ribosomi. Il TRAP consente la purificazione dell'affinità dell'mRNA legato al ribosoma direttamente dall'endotelia vascolare dei tessuti mirati, consentendo l'analisi dell'espressione genica e l'identificazione di nuovi trascrittomi associati alla differenziazione e angiogenesi direttamente in condizioni in vivo. Abbiamo isolato con successo l'RNA legato al ribosoma dagli endoti in questi animali geneticamente modificati. L'RNA purificato può essere utilizzato per un'ulteriore caratterizzazione dei geni angiogenici o arteriogenici nella regolazione della differenziazione e delle funzioni CE. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per implementare l'approccio TRAP per l'isolamento dell'mRNA in EC direttamente in vivo.

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Protocollo

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Per gli esperimenti sugli animali, tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Medical College of Wisconsin.

1. Preparare i reagenti

  1. Preparare il buffer di lisi a concentrazioni di 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cicloxeximide, inibitori della proteasi e inibitori RNaseor ricombinanti alle concentrazioni come descritto di seguito.
    1. Aggiungere i seguenti reagenti a 500 mL di acqua dionizzata senza RNase: 1,19 g di HEPES, 5,59 g di KCl, 0,24 g di MgCl2, 35 mg di DTT, 0,5 mL di cicloseximide e NaOH in base alle esigenze fino a pH 7,4, inibitori della proteasi senza EDTA (una mini compressa per 10 mL) e inibitore di RNase (1 0 l/mL).
    2. Conservare in un frigorifero di 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
  2. Preparare un buffer di lavaggio in poliso ad alto contenuto di sale a concentrazioni di 10 mHe, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2,1% vol/vol CA-630, 0,5 mM DTT e 100 mg/mL di cicloxeximide.
    1. Aggiungere i seguenti reagenti a 500 mL di acqua dionizzata senza RNase: 1,19 g di HEPES, 13,05 g di KCl, 0,24 g di MgCl2, 5 mL di detergente non ionico, detergente non denatura, 5 dei tubi da 7,7 mg di DTT e 0,5 mL di cicloseximide e NaOH in base alle esigenze fino a pH 7.4.
    2. Conservare in frigorifero a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
  3. Legare l'anticorpo anti-GFP alle perle magnetiche Protein G prima di iniziare l'esperimento.
    1. Aggiungere 10 mg di anticorpo anti-GFP diluito in 200 mL di PBS alle perline proteiche G.
    2. Incubare con rotazione finale superiore alla fine per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Posizionare le perline su un rack magnetico e rimuovere il supernatante.
    4. Sospendere le perline in 200 mL di PBS e conservarle in frigorifero da 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
  4. Preparare PBS ghiacciato con 100 mg/mL di ciclosessimide.
    1. Aggiungere 1 volume di soluzione cycloheximide (100 mg/mL) a 99 volumi di PBS ghiacciato.

2. Isolare e lizzare i tessuti desiderati

  1. Topi eutanasi per iniezione IP di ketamina (500 mg/kg/peso corporeo) e xilanina (10 mg/kg/peso corporeo) e isolare i tessuti desiderati (cioè cuore, polmone). Procedere immediatamente al passaggio successivo.
  2. Collocare i tessuti desiderati in 500 mL di PBS ghiacciato con 100 mg/mL di ciclossomi.
  3. Tessuto tritato in una sospensione cellulare con un omogeneizzatore a motore o un omogeneizzatore in vetro di piccole dimensioni. Se si utilizza un omogeneizzatore a motore, limitare l'omogeneizzazione a meno di 1 minuto a bassa frequenza (<15,000 Hz) per evitare la denaturazione dell'RNA.
  4. Sospendere il pellet cellulare in 200 mL di lisi tampone pipettando e ridisegnando buffer più volte. Omogeneizzare ulteriormente le sospensioni cellulari con 10 colpi in un omogeneizzatore in vetro a piccola distanza o per 15 secondi a bassa frequenza (<15,000 Hz) in un omogeneizzatore a motore.
  5. Centrifuga omogenea per 10 min a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per pellet nuclei e grandi detriti cellulari, e mantenere il supernatante.
  6. Aggiungere detergente nonionico e non denatura all'1% vol/vol e DHPC a 30 mM al sovrinnabile. Incubare sul ghiaccio per 5 min.
  7. Centrifuga lisata per 10 min a 16.000 x g al materiale insolubile in pellet. Trasferire e mantenere 15% di lisate chiaro come input per i passaggi futuri.

3. Isolare i complessi ribosomi/mRNA

  1. Aggiungere 50 mL di perline anticorpali al supernatante al lisidi cellulare e incubare la miscela a 4 gradi centigradi con rotazione end-over-end per 30 min. È qui che gli anticorpi anti-GFP legheranno i ribosomi etichettati con GFP, permettendoci di isolare ulteriormente l'RNA da questi ribosomi.
  2. Raccogliere perline su un rack magnetico e lavare 5 volte con tamponi polisome ad alto contenuto di sale.
    1. Redigere e scartare il liquido una volta che le perline sono state raccolte sul lato del tubo. Quindi pipetta e ridisegnare fino a 200 mL di lavaggio polisome ad alto sale tampone più volte. Ripetere questo passaggio 5 volte ed eliminare tutto il buffer dopo la ripetizione finale. Procedere immediatamente al passaggio successivo.

4. Isolare l'mRNA

  1. Inserire perline nel buffer RLT. Le seguenti misure sono prese direttamente dal protocollo mini kit RNeasy e non sono state ampliate in alcun modo.
    AMMONIENZA: il buffer RLT contiene sali di guanidina; NON mescolare con candeggina.
  2. Centrifuga lisata per 3 min a piena velocità 13.000 rpm o 16.000 g a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione il supernatante di 350 mL con il pipettaggio e trasferirlo in un nuovo tubo di microfuge. Utilizzare solo questo supernatante (lysate) nei passaggi successivi.
  3. Aggiungere un volume uguale del 70% di etanolo nel tubo di microfuge.
  4. Trasferire fino a 700 mL del campione, incluso qualsiasi precipitato che potrebbe essersi formato, in una colonna di spin collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Eliminare il flusso attraverso.
  5. Aggiungere 350 mL di buffer RW1 alla colonna di selezione. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Eliminare il flusso attraverso e riutilizzare il tubo di raccolta nel passaggio successivo.
    AVVISO: Buffer RW1 contiene sali di guanidina; NON mescolare con candeggina.
  6. Aggiungere 350 mL di buffer RW1 alla colonna di selezione. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il flusso attraverso.
  7. Aggiungere 500 mL di RPE del buffer alla colonna di selezione. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Eliminare il flusso attraverso.
  8. Aggiungere 500 mL di RPE del buffer alla colonna di selezione. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 2 min a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Quindi rimuovere con attenzione la colonna di rotazione dal tubo di raccolta, assicurandosi che la colonna non contatti il flow-through.
  9. Posizionare la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare il vecchio tubo con il flow-through. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare a tutta velocità per 1 min per rimuovere il buffer residuo.
  10. Posizionare la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungere 30-50 mL di acqua senza RNase direttamente alla membrana della colonna di spin. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 1 min a 8.000 x g per eluire l'RNA.
  11. Se la resa prevista dell'RNA è >30 mg, ripetere il passaggio 4.10 con altri 30-50 mL di acqua priva di RNase, o utilizzare elute dal passo 4.10 (se è richiesto alto [RNA]). Riutilizzare il tubo di raccolta dalla fase 4.10.
  12. Utilizzare l'RNA purificato per l'analisi a valle, tra cui L'RNA-sequenziamento o la PCR quantitativa in tempo reale o memorizzare l'RNA sciolto in RNase-free H2O a -80 gradi centigradi per un massimo di 1 anno.

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Risultati

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I nostri studi precedenti4,7 suggeriscono che CD36 può funzionare come un interruttore per la differenziazione arteriolar e arterializzazione capillare tramite la via di segnalazione LPA/PKD-1. Per studiare se l'asse di segnalazione LPA/PKD-1-CD36 è essenziale per l'arteriogenesi in vivo, abbiamo stabilito le nuove linee TRAP che non solo hanno carenza globale di cd36 o endoteliano specifico-cd36- o pkd-1-deficizione, ma permettono anche l'isolamento selettivo di...

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Discussione

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L'angiogenesi è un complesso processo a più fasi, in cui la trascrizione e l'espressione genica angiogenica specifica della CE svolgono un ruolo essenziale nella differenziazione CE e nella riprogrammazione angiogenica3,4. Per superare le barriere della diversità cellulare e della complessità architettonica per comprendere meglio la funzione del sistema vascolare dei mammiferi a livello molecolare in vivo, abbiamo creato topi TRAP specifici per eC, accompagnati d...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Il lavoro del dottor Ren è sostenuto dall'American Heart Association (13SDG14800019; BR), ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), l'American Cancer Society (86-004-26; il MCW Cancer Center to BR), e il National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer è supportato dal 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship Program; P. Moran è supportato da una borsa di studio institutional research Training di NHLBI (5T35 HL072483-34).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bioanalizzatore per elettroforesi 2100 con nanochip e picochipAgilentG2939AA, 5067-1511 e 5067-1513
Raschietti cellulariSarstedt83.1832
OmogeneizzatoriFisher ScientificK8855100020
Magnete (Dynamag-2)Invitrogen123-21DDipenderà dalla scala di purificazione; i campioni in provette da 1,5 mL possono essere concentrati su una minicentrifuga DynaMag-2
Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C spettrofotometroThermo Scientific ND-2000C
Centrifuga refrigerataEppendorf5430Rcon rotore per provette per microcentrifuga da 1,5 mL
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL senza RNasiApplied Biosystems 
Provette coniche da 50 mL prive di RNASIApplied Biosystems 
senza RNasi 1000-μ l punte del filtroRaininRT-1000F
senza RNasi 200-μ l punte del filtroRainin RT-200F
senza RNasi 20-μ l punte del filtroRainin RT-20F
Rotore per omogeneizzatoriYamatoLT-400D
Rotatore per tubi, marca LabquakeThermo Fisher13-687-12Q
AM12450AM12501

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

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