Presentiamo un approccio per purificare l'mRNA legato al ribosoma dalle cellule endoteliali vascolari (EC) direttamente nel cervello del topo, nei polmoni e nei tessuti cardiaci attraverso il tag genetico specifico della Proteina di fluorescenza verde avanzata (EGFP) nei ribosomi in combinazione con la purificazione dell'RNA .
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Articolo metodologico
Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti studi si sono limitati all'utilizzo di saggi cellulari in vitro e tessuti interi o all'isolamento di specifici tipi di cellule da animali per l'analisi in vitro del trascrittoma e dell'espressione genica mediante qPCR e sequenziamento dell'RNA. Il trascrittoma completo e l'analisi dell'espressione genica di specifici tipi di cellule in tessuti e organi complessi sarà fondamentale per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari con cui i geni sono regolati e la loro associazione con l'omeostasi dei tessuti e l'organo Funzioni. In questo articolo, dimostriamo la metodologia per l'isolamento dell'RNA legato al ribosoma direttamente in vivo nell'endotelio vascolare dei polmoni animali come esempio. Saranno descritti i materiali e le procedure specifici per la lavorazione dei tessuti e la purificazione dell'RNA, compresa la valutazione della qualità e della resa dell'RNA, nonché qPCR in tempo reale per i saggi genici arteriogenici. Questo approccio, noto come tecnica di purificazione dell'affinità ribosomiana (TRAP), può essere utilizzato per la caratterizzazione dell'espressione genica e l'analisi del trascrittoma di alcuni tipi di cellule direttamente in vivo in qualsiasi tipo specifico nei tessuti complessi.
Introduzione
Nei tessuti complessi come il cervello, il cuore e il polmone dei mammiferi, gli alti livelli di eterogeneità cellulare complicano l'analisi dei dati di espressione genica derivati da campioni di tessuto intero. Per osservare i profili di espressione genica in un particolare tipo di cellula in vivo, recentemente è stata sviluppata una nuova metodologia, che consente l'interrogatorio dell'intero complemento di mRNA tradotto di qualsiasi tipo di cellula geneticamente definita. Questa metodologia è nota come tecnica di purificazione dell'affinità del ribosoma di traduzione (TRAP)1,2. È uno strumento utile per stu....
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Protocollo
Per gli esperimenti sugli animali, tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Medical College of Wisconsin.
1. Preparare i reagenti
- Preparare il buffer di lisi a concentrazioni di 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cicloxeximide, inibitori della proteasi e inibitori RNaseor ricombinanti alle concentrazioni come descritto di seguito.
- Aggiungere i seguenti reagenti a 500 mL di acqua dionizzata senza RNase: 1,19 g di HEPES, 5,59 g di KCl, 0,24 g di MgCl2, 35 mg di DTT, 0,5 mL di cicloseximide e NaOH in base alle e....
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Risultati
I nostri studi precedenti4,7 suggeriscono che CD36 può funzionare come un interruttore per la differenziazione arteriolar e arterializzazione capillare tramite la via di segnalazione LPA/PKD-1. Per studiare se l'asse di segnalazione LPA/PKD-1-CD36 è essenziale per l'arteriogenesi in vivo, abbiamo stabilito le nuove linee TRAP che non solo hanno carenza globale di cd36 o endoteliano specifico-cd36- o pkd-1-deficizione, ma permettono anche l'isolamento selettivo di.......
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Discussione
L'angiogenesi è un complesso processo a più fasi, in cui la trascrizione e l'espressione genica angiogenica specifica della CE svolgono un ruolo essenziale nella differenziazione CE e nella riprogrammazione angiogenica3,4. Per superare le barriere della diversità cellulare e della complessità architettonica per comprendere meglio la funzione del sistema vascolare dei mammiferi a livello molecolare in vivo, abbiamo creato topi TRAP specifici per eC, accompagnati d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Il lavoro del dottor Ren è sostenuto dall'American Heart Association (13SDG14800019; BR), ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), l'American Cancer Society (86-004-26; il MCW Cancer Center to BR), e il National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer è supportato dal 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship Program; P. Moran è supportato da una borsa di studio institutional research Training di NHLBI (5T35 HL072483-34).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bioanalizzatore per elettroforesi 2100 con nanochip e picochip | Agilent | G2939AA, 5067-1511 e 5067-1513 | |
| Raschietti cellulari | Sarstedt | 83.1832 | |
| Omogeneizzatori | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnete (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Dipenderà dalla scala di purificazione; i campioni in provette da 1,5 mL possono essere concentrati su una minicentrifuga DynaMag-2 |
| Fisher Scientific | 05-090-100 | ||
| NanoDrop 2000C spettrofotometro | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5430R | con rotore per provette per microcentrifuga da 1,5 mL |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL senza RNasi | Applied Biosystems | ||
| Provette coniche da 50 mL prive di RNASI | Applied Biosystems | ||
| senza RNasi 1000-μ l punte del filtro | Rainin | RT-1000F | |
| senza RNasi 200-μ l punte del filtro | Rainin | RT-200F | |
| senza RNasi 20-μ l punte del filtro | Rainin | RT-20F | |
| Rotore per omogeneizzatori | Yamato | LT-400D | |
| Rotatore per tubi, marca Labquake | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
Riferimenti
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al.
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Ristampe e permessi
