La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.
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Articolo metodologico
Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biopsia Blastocyst viene eseguita per ottenere una diagnosi genetica affidabile durante i cicli di fecondazione in vitro con test genetici preimpianto. Quindi, il flusso di lavoro ideale comporta un protocollo di vitrificazione sicuro ed efficiente, a causa dei tempi di consegna delle tecniche diagnostiche e per trasferire l'embrione o gli embrioni selezionati su un endometrio fisiologico in un ciclo naturale successivo. Un approccio di biopsia che comprende l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 5-10 cellule trophectoderm (idealmente 7-8) limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali. Dopo un'adeguata formazione, la tecnica è stata riproducibile tra diversi operatori in termini di tempistica della biopsia (8 min, che vanno da 3 a 22 min in base al numero di embrioni alla biopsia per piatto), diagnosi conclusive ottenute (97,5%) e tassi di natalità vivi dopo il trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati (>40%). Il tasso di sopravvivenza dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento è stato del 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dal riscaldamento era alto come 97%, in gran parte dipende dalla tempistica tra biopsia e vitrificazione (idealmente , 30 min), qualità morfologica blastocista e giorno della biopsia. In generale, è meglio vitrificare una blastocisti collassata; pertanto, nei cicli non PGT, potrebbe essere eseguito un restringimento artificiale assistito al laser per indurre il collasso dell'embrione prima della crioconservazione. La prospettiva futura più promettente è l'analisi non invasiva dei media di coltura della fecondazione in vitro dopo la coltura della blastocisti come fonte putativa di DNA embrionale. Tuttavia, questa potenziale avanguardia è ancora in fase di studio e un protocollo affidabile deve ancora essere definito e convalidato.
Introduzione
L'obiettivo principale dell'embriologia umana moderna è quello di massimizzare il numero di nascite vive per ciclo stimolato e ridurre i costi, i tempi e gli sforzi per raggiungere una gravidanza. Per raggiungere questo obiettivo, dovrebbero essere utilizzati approcci convalidati per la selezione degli embrioni per identificare gli embrioni competenti riproduttivi all'interno di una coorte ottenuta durante un ciclo di fecondazione in vitro. Secondo le ultime evidenze, la cultura blastocisti1 combinata con test cromosomici completi e il trasferimento di embrioni euploidi vetrificati (ET) è il quadro più efficiente per aumentare l'efficienza dell....
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Protocollo
Il protocollo per la biopsia della blastocisti umana, qui descritto, segue le linee guida del Comitato Etico della ricerca umana G.EN.E.R.A.
NOT: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i materiali necessari. Ulteriori materiali necessari riguardano calzature e abiti da laboratorio, maschera chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinze e disinfettante. L'uso di abito chirurgico, guanti chirurgici usa e getta, maschera per il viso, copertura dei capelli è obbligatorio per prevenire il rischio di contaminazione. Tutte le aree di lavoro, così come le a....
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Risultati
La figura 6 rappresenta uno schema di tutti i risultati di una procedura di biopsia che può essere adottata per standardizzare il protocollo e monitorare le prestazioni di ciascun operatore. Il principale risultato procedurale è la tempistica per completare la biopsia/biopsia; il principale risultato tecnico è la qualità della trama prodotta dopo i test genetici che potrebbero portare a una diagnosi conclusiva o inconcludente, quest'ultima delle quali richied.......
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Discussione
Solo gli embriologi esperti di esperti che hanno completato il loro periodo di formazione dovrebbero eseguire sia la biopsia TE che la vitrificazione della blastocisti. Inoltre, un testimone è tenuto a monitorare le procedure e garantire un'efficiente tracciabilità durante i) i movimenti della blastocisti biopsied dal piatto di biopsia ( Figura supplementare1) alla parabola post-biopsia (Figurasupplementare 1 ), quindi alla targhetta di vitrificazione (figura supplementare 1
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
AG e RM hanno raccolto i dati e redatto il manoscritto. La DC analizzò i dati, redasse i risultati rappresentativi, eseguì le statistiche e rivedeva il manoscritto. FMU e LR hanno fornito una discussione critica dei risultati e dell'intero manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Rack per tubi freddi | Biocision | XTPCR96 | |
| Pipettatore elettronico | Fisher Scientific | 710931 | |
| Set di maniglie regolabili Flexipet | Cook | G18674 | Supporto per spogliarellista |
| Gilson Pipetman | Gilson 66003 | p20 | |
| IVF Sistema di Testimonianza Elettronico | CooperSurgical Fertilità & Soluzioni genomiche | RI Witness ART Sistema di gestione | |
| CSLQSPIN | per provette PCR da 0,2 mLl | ||
| Stereomicroscopio | Leica | Leica M80 | |
| Termostato | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Incubatore trigas | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumabili | |||
| Pipetta per biopsia | RI | 7-71-30FB35720 | 30 &; m ID, appartamento 35 gradi C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM completo | Irvine Scientific | 90165 | Terreno di coltura IVF integrato con |
| catetere per il trasferimento di embrioni | Cook | G17934 | |
| Pipetta Flexipet | Cook | G26712 | 140µ m puntale per pipetta stripping |
| Flexipet pipetta | Cook | G46020 | 300µ m strippaggio puntali per pipette |
| Pipetta di tenuta | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µ m ID, appartamento 35 gradi C |
| Albumina sierica umana | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF Piatto a un pozzetto | Falcon | 353653 | |
| Olio minerale per la coltura embrionale | Irvine Scientific | 9305 | |
| HTF modificato Medium | Irvine Scientific | 90126 | Terreno tamponato Hepes |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | Piatto IVF 4- piastra a pozzetti con coperchio scorrevole |
| Primaria Piastra per colture cellulari | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Pipetta sierologica | Falcon | 357551 | 10ml |
| Puntali Gilson sterili monouso | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 &; |
| Kit di tubi | Fornito dal laboratorio | Provette per PCR (0,2 mL), soluzione di caricamento, soluzione di lavaggio per biopsia | |
| Terreni di vetrificazione | Kitazato | VT801 | Soluzioni di equilibratura e vitrificazione |
| Terreni riscaldanti | Kitazato | VT802 | Soluzioni di scongelamento e diluizione |
Riferimenti
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A.
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Ristampe e permessi
