Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

Sommario

Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella; tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.

Abstract

Un indice competitivo è un metodo comune utilizzato per valutare la forma fisica batterica e/o la virulenza. L'utilità di questo approccio è esemplificata dalla sua facilità di esecuzione e dalla sua capacità di standardizzare la forma fisica di molti ceppi per un organismo di tipo selvaggio. La tecnica è limitata, tuttavia, dai marcatori fenotipici disponibili e dal numero di ceppi che possono essere valutati simultaneamente, creando la necessità di un gran numero di esperimenti di replica. In concomitanso con un gran numero di esperimenti, i costi di lavoro e materiali per quantificare i batteri basati su marcatori fenotipici non sono insignificanti. Per superare questi aspetti negativi pur mantenendo gli aspetti positivi, abbiamo sviluppato un approccio molecolare per quantificare direttamente i microrganismi dopo aver progettato marcatori genetici su cromosomi batterici. Unico, 25 coppia di base codici a barre DNA sono stati inseriti in un locus innocuo sul cromosoma di ceppi selvatici e mutanti di Salmonella. Gli esperimenti di competizione in vitro sono stati eseguiti utilizzando inocula costituiti da ceppi in pool. In seguito alla competizione, il numero assoluto di ogni ceppo è stato quantificato utilizzando la PCR digitale e gli indici competitivi per ogni ceppo sono stati calcolati in base a tali valori. I nostri dati indicano che questo approccio alla quantificazione della Salmonella è estremamente sensibile, preciso e preciso per rilevare sia i microrganismi altamente abbondanti (alta forma fisica) che rari (bassa forma fisica). Inoltre, questa tecnica è facilmente adattabile a quasi tutti gli organismi con cromosomi in grado di modificarsi, nonché a vari progetti sperimentali che richiedono la quantificazione assoluta dei microrganismi.

Introduzione

Valutare la forma fisica e la virulenza degli organismi patogeni è un aspetto fondamentale della ricerca microbiologica. Consente di confrontare tra ceppi o tra organismi mutati, il che consente ai ricercatori di determinare l'importanza di determinati geni in condizioni specifiche. Tradizionalmente, la valutazione della virulenza utilizza un modello animale di infezione utilizzando diversi ceppi batterici e osservando l'esito dell'animale infetto (ad esempio Contagiosa₅₀, Dose letale₅₀, tempo a morte, gravità dei sintomi, mancanza di sintomi, ecc.). Questa procedura fornisce preziose descrizioni della virulenza, ma richiede che i ceppi causino notevoli differenze nei risultati al fine di rilevare variazioni da wild-type. Inoltre, i risultati sono semi-quantitativi perché mentre la progressione della malattia e la gravità dei sintomi possono essere soggettivamente quantificate nel tempo, l'interpretazione della virulenza rispetto al tipo selvaggio è più qualitativa (cioè più, meno o ugualmente virulenzia). Un'alternativa comune ai saggi di infettività degli animali per animali di esecuzione consiste nel generare indici competitivi (CI), valori che confrontano direttamente la forma fisica o la virulenza di un ceppo con una controparte di tipo selvatico in un'infezione mista¹. Questa tecnica ha numerosi vantaggi rispetto a un modello animale tradizionale di infezione standardizzando la virulenza su un ceppo di tipo selvatico e determinando un valore quantificabile per riflettere il grado di attenuazione. Questa tecnica può anche essere adattata per analizzare le interazioni geniche nei batteri determinando un indice competitivo cancellato (COI)². Il calcolo di un COI per un gruppo di organismi mutati consente ai ricercatori di determinare se due geni contribuiscono in modo indipendente alla patogenesi o se sono coinvolti nella stessa via di virulenza e dipendono l'uno dall'altro. Inoltre, il calcolo di una CI richiede l'enumerazione di batteri che possono fornire preziose informazioni sulla patogenesi degli organismi. Cite e COI consentono inoltre ai ricercatori di valutare ceppi avirulenti che non causano malattie cliniche ma hanno ancora differenze di forma fisica. Questa tecnica è limitata dall'uso di marcatori di resistenza agli antibiotici tradizionali per identificare i ceppi, limitando così il numero di ceppi di ingresso a uno o due alla volta. A causa di questa limitazione, è necessario un gran numero di gruppi sperimentali e repliche, che oltre ad aumentare i costi di manodopera e materiali, aumenta anche le opportunità di variabilità in condizioni sperimentali e risultati imprecisi. (Per un esame approfondito dei benefici e delle applicazioni dell'uso di infezioni miste per studiare la virulenza, la forma fisica e le interazioni geniche, vedere C.R. Beuzàn e D.W. Holden ¹)

Si è cercato di superare questa limitazione, come l'uso di cellule fluorescenti quantificate tramite citometria di flusso^3,4,5. Questa tecnica quantifica le cellule utilizzando 1) etichettate anticorpi contro i marcatori fenotipici o 2) prodotte endogenamente proteine fluorescenti. L'uso di anticorpi etichettati ha un limite di rilevamento di 1.000 cellule /mL, e quindi richiede un numero elevato di cellule per analizzare³. Le cellule che esprimono proteine fluorescenti hanno una fisiologia alterata e sono suscettibili ai cambiamenti di fitness derivanti dall'espressione ad alte proteine⁶. Entrambi i metodi sono limitati dal numero di marcatori fluorescenti rilevabili utilizzando la citometria di flusso. Un progresso nella quantificazione molecolare è stato raggiunto attraverso lo sviluppo di una tecnica di microarray che ha rilevato l'attenuazione in 120 ceppi da un'infezione mista iniziale di oltre 1.000 ceppi in un modello murino⁷. Questa tecnica ha utilizzato un'analisi microarray dell'RNA da ceppi mutati, che portano a una notevole variabilità nel risultato.  Tuttavia, ha stabilito che grandi pool di infezioni miste possono essere uno strumento utile e che utilizzando tecniche di rilevamento sensibili, possono essere identificate differenze nella virulenza batterica. Con lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione, Tn-seq ha ampliato l'utilità delle mutazioni trasposoni, consentendo un potente metodo per quantificare i batteri che sono stati mutati casualmente^{8,9,10, 11}. Recentemente è stato sviluppato un protocollo alternativo che elimina la necessità di trasposoni e utilizza invece i codici a barre del DNA per identificare e monitorare più facilmente i cambiamenti genomici e il loro impatto sulla forma fisica¹². Questa tecnologia è un importante progresso, ma l'inserimento dei codici a barre genomici è ancora un processo casuale. Per superare la casualità degli esperimenti precedenti, Yoon e altri hanno sviluppato un metodo per calcolare i ceppi di Codi di Salmonella utilizzando codici a barre specifici del DNA inseriti in posizioni precise sui cromosomi dei batteri¹³. Sono stati rilevati ceppi in codice a barre unici utilizzando un metodo basato su qPCR con verde SYBR e primer specifici per ogni codice a barre univoco. La tecnica era limitata da vincoli imposti da qPCR, comprese le differenze nell'efficienza dei primer e dalla bassa sensibilità, evidenziate dalla necessità di pcR nidificati prima di qPCR. Tuttavia, questo approccio ha dimostrato che le modifiche genomiche mirate potrebbero essere sfruttate per rilevare e potenzialmente quantificare pool di ceppi batterici multipli.

Nel seguente protocollo, descriviamo una nuova metodologia per eseguire esperimenti di competizione batterica con grandi pool di inocua misti seguiti da una quantificazione accurata utilizzando una tecnica PCR digitale altamente sensibile. Il protocollo prevede ceppi batterici geneticamente etichettanti con un codice a barre DNA unico inserito su una regione innocua del cromosoma. Questa modifica consente di quantificare rapidamente e con precisione i ceppi utilizzando la moderna tecnologia molecolare invece delle tradizionali diluizioni seriali, la placcatura delle repliche e il conteggio delle unità formanti della colonia che si basano su marcatori fenotipici (cioè la resistenza agli antibiotici ). Le modifiche consentono la valutazione simultanea di molti ceppi in un unico inoculo raggruppato, riducendo sostanzialmente la possibilità di variabilità sperimentale perché tutti i ceppi sono esposti alle stesse condizioni esatte. Inoltre, mentre questa tecnica è stata sviluppata in Salmonella enterica sierovar Typhimurium, è altamente adattabile a qualsiasi organismo geneticamente malleabile e quasi qualsiasi progetto sperimentale in cui sono necessari conteggi batterici accurati, fornendo un nuovo strumento per aumentare la precisione e la produttività nei laboratori di microbiologia senza i vincoli imposti dai metodi precedenti.

Protocollo

1. Incorporare codici a barre unici del DNA su un plasmide contenente i componenti necessari per lo scambio allelico

NOT: È stato creato un nuovo plasmide, denominato pSKAP, con un numero di copie elevato e una maggiore efficienza di trasformazione rispetto al plasmide di scambio allelico pKD13 esistente. Questa operazione è descritta nei passaggi 1.1-1.12 (Figura 1). I plasmidi finalizzati contenenti codici a barre e componenti specifici del DNA per lo scambio allelico sono disponibili attraverso un deposito plasmico (Tabella dei materiali).

1. Utilizzando un kit di miniprep plasmida commerciale, purificare pKD13¹⁴ e pPCR Script Cam SK^- da colture batteriche overnight coltivate in luria-Bertani (LB) brodo integrato con 50g/mL kanamycin o 25 g /mL chloramphenicol (per pKD13 e pPCR Cam Script Rispettivamente la Chiave MAIUSCOLA) (Tabella 1).
2. Eseguire digestione di restrizione su entrambi i plasmidi utilizzando enzimi di restrizione commerciale HindIII e BamHI secondo le specifiche del produttore.
3. Rimuovere gli enzimi di restrizione e il DNA asciso dalla reazione pPCR Script Cam SK e purificare la spina dorsale plasmid della coppia di 3.370 basi (bp) utilizzando un kit di pulizia del DNA disponibile in commercio secondo le specifiche del produttore.
4. Separare i frammenti dalla digestione di restrizione pKD13 su un gel di agarose 1% utilizzando una camera di elettroforesi.
5. Visualizzare le bande utilizzando un transilluminatore di luce blu e accisare il frammento di 1.333 bp dal gel (Figura 1C).
   NOT: Questo frammento contiene il gene di resistenza alla kanamicina fiancheggiato da FRT necessario per la sostituzione allelica cromosomica.
6. Purificare il DNA asciso dal punto 1.5 utilizzando un kit di estrazione gel commerciale.
7. Per creare pSKAP, legarsi il frammento purificato da pKD13 (dal punto 1.6) a pPCR Script Cam SK (dal punto 1.3) utilizzando una legature commerciali del DNA T4 secondo le specifiche del produttore.
8. Trasformare le cellule DH5 chimicamente competenti con il plasmid pSKAP ligate seguendo il protocollo del produttore (Tabella1).
9. Stendere i trasformativi su piastre di agar LB completate con 50 g/mL di kanamycin e incubare a 37 gradi durante la notte.
10. Scegli una colonia dal piatto e striscia su una nuova piastra di agar LB integrato con 50 g / mL kanamycin e incubare a 37 gradi durante la notte. Scegli una colonia da questo piatto e usa per inoculare il brodo LB integrato con 50 g/mL di kanamicicina. Incubare la coltura durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
11. Utilizzare un kit commerciale di miniprep plasmico per purificare pSKAP dalla coltura batterica durante la notte.
12. Eseguire una digestione diagnostica della restrizione del plasmide dal passaggio 1.11 utilizzando Hind III e Bam HI in base alle specifiche del produttore. Visualizza i frammenti su un gel di agarose dell'1% come nei passi 1.4-1.5.
    NOT: La dimensione totale del pSKAP deve essere 4.703 bp. Frammenti dopo il passaggio 1.12 deve essere 3.370 e 1.333 bp.
13. Progettare i primer PCR per la mutagenesi indirizzata al sito di inserimento (SDM) (Tabella 2 e S1) in modo da inserire una sequenza di DNA unica di 25 coppie di basi nella posizione 725 di pSKAP (Figura 2).
    NOT: Il DNA del codice a barre viene inserito nel plasmide appena fuori dal gene di resistenza alla kanamica, quindi il codice a barre non viene perso durante la successiva rimozione della cassetta di resistenza alla kanamica. Se si generano nuove sequenze di codici a barre, utilizzare strumenti online per garantire che le sonde PCR specifiche del bersaglio con etichetta fluorescente (in seguito denominate semplicemente "probe") si leghino in modo efficiente alla nuova sequenza. Le sequenze di inserimento progettate in data, insieme ai primer necessari per crearle, sono disponibili nelle tabelle 2 e S1.
14. Preparare le reazioni SDM utilizzando una polimerasi di DNA adalta fedeltà commerciale, le coppie di primer desiderate (Tabella 2) e il modello pSKAP. Impostare il termociclore in modo che esegua le seguenti operazioni: 1) 98 Gradi centigradi per 30 s, 2) 98 S per 10 s, 56 S per 15 s, 72 gradi centigradi per 2 min, 3) ripetere i passaggi 2, 24, 4) 72 Gradi centigradi per 5 min, 5) tenere a 4 gradi centigradi.
15. Dopo il completamento della PCR, esaurisci il modello pSKAP aggiungendo l'enzima di restrizione Dpn I alla reazione. Incubare a 37 gradi centigradi per 20 min.
    NOT: I prodotti PCR devono essere visualizzati su un gel di agarose per verificare la dimensione e la purezza del prodotto. Un controllo Dpn I digestione costituito dal modello pSKAP non modificato può essere eseguito e utilizzato nei passaggi successivi per garantire che il DNA del modello sia completamente digerito.
16. Utilizzare 5 l del prodotto a partire da 1,15 per trasformare 100 -L di cellule Commerciali chimicamente competenti DH5, secondo le raccomandazioni del produttore.
17. Stendere i trasformativi su placche di agar LB completate con 25 g/mL di cloramramernico e incubare a 37 gradi durante la notte.
18. Selezionare una colonia (o colonie) da piatti notturni e striscia su singole piastre di agar LB completate con 25 g/mL cloramhenicl e incubare a 37 gradi durante la notte. Selezionare una colonia da piatti notturni e utilizzare per inoculare 5 mL di brodo LB integrato con 25 g/mL di cloramfenicolo. Incubare colture durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
19. Utilizzare un kit commerciale di miniprep plasmicono per purificare i plasmidi dalla cultura o dalle culture notturne.
20. Plasmidi purificati della sequenza di sanger utilizzando il primer di sequenza in avanti M13 (tabella 2). Confrontare l'area mutata con il plasmide originale e valutare la precisione di inserimento SDM.
21. Dopo aver confermato l'inserimento e la precisione del codice a barre, assegnare un nome a ciascun codice a barre e plasmid.
    NOT: Ai codici a barre generati fino ad oggi è stata assegnata una designazione di due lettere: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, ecc. Plasmids con codice a barre sono indicati come pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC e così via.
22. Ripetere i passaggi da 1,14 a 1,21 per generare il numero desiderato di codici a barre del DNA.

2. Introdurre il codice a barre del DNA sul cromosoma di S. Typhimurium

NOT: Inserimento di codici a barre del DNA sulla S. Il cromosoma di Typhimurium si ottiene utilizzando un metodo di scambio allelico descritto da Datsenko e Wanner¹⁴ che è stato modificato per l'uso in S. Typhimurium.

1. Determinare il locus sulla S. Genoma del ghimuro in cui inserire il codice a barre del DNA (Figura 3).
   NOT: Selezionare una grande regione intergenica del cromosoma. Evitare le regioni che producono RNA non codificante. Questo studio ha utilizzato un locus a valle del mettere P tra i residui 1.213.840 e 1.213.861 (determinato dall'assemblaggio del genoma GCA_000022165.1). Questa regione è stata precedentemente geneticamente manipolata nella traduzione dei geni¹⁵. In alternativa, un codice a barre del DNA potrebbe essere introdotto mentre contemporaneamente disturba un gene di interesse. Ciò richiederebbe modifiche minime a questo protocollo e semplificherebbe la creazione di mutanti.
2. Progettare i primer PCR per amplificare l'esclusivo codice a barre e il gene di resistenza alla kanamica fiancheggiato da FRT dal plasmide contenente il pSKAP desiderato del punto 1.21 (Tabella 2). Aggiungete le estensioni da 40 nucleotidi omologhe alla regione selezionata nel passaggio 2.1 fino alla fine 5' di ogni primer (tabella 2).
3. Eseguire l'amplificazione utilizzando una polimerasi commerciale ad alta fedeltà, i primer del passaggio 2.2 e il plasmide contenente il codice a barre pSKAP desiderato come modello. Impostare il termociclore in modo che esegua le seguenti operazioni: 1) 98 S per 30 s, 2) 98 S per 10 s, 3) 56 C per 15 s, 4) 72 C per 60 s, ripetere i passaggi 2-4 29, 5) 72 s C per 5 min, 6) tenere a 4 gradi centigradi.
4. Dopo il completamento della PCR, esaurire il DNA del modello utilizzando DpnI come descritto nel passaggio 1.15. Purificare e concentrare il DNA utilizzando un kit di pulizia del DNA commerciale secondo le specifiche del produttore.
5. Fare riferimento al protocollo pubblicato in precedenza per la generazione di mutanti in S. Ceppo di Typhimurium 14028s da prodotti PCR^14,16,17,18.
   NOT: Non è essenziale che il gene della resistenza alla kanamicicina venga assolto dal cromosoma. Tuttavia, l'escissione del gene è minimamente dirompente per il cromosoma batterico in quanto si traduce in una cicatrice di 129 bp che lascerebbe potenziali geni a valle nel telaio. Si raccomanda che il ceppo contenente il gene di resistenza alla kanamicina sia mantenuto in quanto può essere utilizzato per spostare i codici a barre tra i ceppi tramite la trasduzione mediata da P22.
6. Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.5 per creare i ceppi desiderati con i codici a barre appropriati.
   NOT: I codici a barre possono essere introdotti in un tipo selvaggio S. Il typhimurium che può poi essere sottoposto a ulteriore manipolazione genetica, o codici a barre possono essere introdotti in ceppi che sono stati precedentemente geneticamente modificati.

3. Condizioni di crescita batterica e analisi della concorrenza in vitro

1. Da batteri stock, striscia desiderata S. Ceppi di typhimurium che ospitano ciascuno un codice a barre unico di DNA sulle piastre di agar LB. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
2. Selezionare una singola colonia da ogni ceppo e inoculare 5 mL di brodo LB. Incubare per 20 h a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
   NOT: Utilizzando la coltura durante la notte, procedere al passaggio 3.5 per raccogliere il DNA genomico puro (gDNA) da ogni ceppo con codice a barre. Ciò è necessario per i successivi esperimenti di convalida e controllo nella sezione 6.
3. Per ogni analisi della concorrenza, trasferire un volume uguale di ogni coltura durante la notte in un tubo sterile di dimensioni adeguate. Mescolare accuratamente i ceppi vortice vigorosamente per almeno 5 s.
   NOT: Il volume di ogni coltura overnight da trasferire dovrebbe essere sufficiente per ogni condizione e replicare, così come per isolare gDNA per quantificare l'input. Sebbene non sia del tutto necessario misurare la densità ottica delle colture perché il numero assoluto di microrganismi di input sarà quantificato utilizzando la PCR digitale, il numero di batteri di input per ogni ceppo dovrebbe essere approssimativamente uguale per evitare colli di bottiglia o concorrenza diseguale all'inizio dell'esperimento. I saggi rappresentativi della concorrenza in questo protocollo hanno confrontato simultaneamente tassi di crescita di 8 tensioni. Per i singoli progetti sperimentali possono essere necessari ulteriori o meno ceppi.
4. Trasferire 100 l'inoculum misto nel brodo LB sterile da 4,9 mL. Incubare a 37 gradi centigradi per il tempo desiderato o ad una densità ottica desiderata.
5. Raccogliere 500 l dell'inoculum mediante centrifugazione a >12.000 x g per 1 min. Rimuovere e scartare il supernatante. Procedere immediatamente alla sezione 4 con le celle.
6. Nei punti temporali desiderati, rimuovere 500 lldi di coltura e raccogliere le cellule per centrifugazione a >12.000 x g per 1 min. Rimuovere e scartare il sovrnatale.
   NOT: Se si raccolgono aliquote in più momenti, congelare i pellet a -20 gradi centigradi o procedere immediatamente al passaggio 4.1 dopo ogni raccolta.

4. Raccolta e quantificazione gDNA da S. Typhimurium (da passaggi 3.5 e 3.6)

1. Raccogliere gDNA da cellule utilizzando un kit di purificazione gDNA commerciale. Se disponibile, eseguire la fase opzionale di esaurimento dell'RNA.
   NOT: L'esaurimento dell'RNA non è necessario; tuttavia, la presenza di RNA aumenterà artificialmente la concentrazione di DNA, portando a calcoli aberranti nelle fasi successive. Se si utilizza un kit di purificazione gDNA commerciale, seguire le raccomandazioni del produttore per assicurarsi che la colonna non sia sovraccarica di DNA. Non è richiesta alcuna concentrazione minima di DNA se il campione è quantificabile nelle fasi successive.
2. Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA in ogni campione.
   NOT: Il DNA può essere quantificato utilizzando qualsiasi metodo affidabile.
3. Calcolare il numero di copia gDNA in base alla dimensione del genoma batterico utilizzando la seguente equazione in cui: X è la quantità di DNA in ng e N è la lunghezza di una molecola di DNA a doppio filamento (la dimensione del genoma).
   
   NOTA: 660 g/mole viene utilizzato come massa media di 1 DNA bp. Piccole variazioni possono esistere a seconda della composizione nucleotide dell'organismo. Numerosi calcolatori sono disponibili online per eseguire il calcolo.

5. Progettare Primer e sonde per il rilevamento quantitativo dei codici a barre del DNA tramite dDigital PCR

1. Progettare primer per amplificare la regione con codice a barre della S. Typhimurium cromosoma a valle di putP (Figura 3C e Tabella 2).
   NOT: I progetti di Primer e sonda possono essere facilitati da numerosi programmi online (Tabella dei Materiali). Se i codici a barre sono tutti inseriti nello stesso loci, un singolo set di primer di amplificazione è universale per tutti i codici a barre.
2. Progettare sonde basate su 6 carboxyfluorescein (FAM) e/o basate su hexachlorofluorescein (HEX) specifiche per ogni codice a barre (Tabella 2 e S1).
   NOT: Il lettore di goccioline utilizzato in questo esperimento è in grado di rilevare simultaneamente sonde basate su FAM e HEX in una reazione multiplex. Progettare 1/2 delle sonde per utilizzare FAM e 1/2 per utilizzare HEX. Questo non è un passo necessario, ma ridurrà l'uso del reagente e i costi sperimentali se attuati.
3. Crea 20 x miscele master primer-probe contenenti 1) 20 mM di ogni primer di amplificazione in avanti e inversa, 2) 10 mM di una singola sonda FAM e 3) 10 mM di una singola sonda HEX (se multiplexing).

6. Convalidare la sensibilità e la specificità di ogni set di sonde Pprimer per ogni codice a barre genomico utilizzando la PCR digitale

NOT: Questo protocollo utilizza la convalida di otto codici a barre univoci con otto sonde uniche come esempio. Il numero di codici a barre utilizzati può essere aumentato o diminuito per ospitare vari progetti sperimentali.

1. Creare un pool di gDNA che contiene tutti i codici a barre ad eccezione di uno. Utilizzare questo pool come diluente per eseguire una serie di diluizione con gDNA contenente il singolo codice a barre rimanente (lo schema di diluizione del campione è disponibile nella Figura4).
   NOT: L'utilizzo di gDNA raggruppato come diluente garantisce uno sfondo coerente, accertando al contempo la sensibilità. Utilizzando i numeri di copia determinati nel passaggio 4.3, diluire gDNA in un numero di copia compreso nell'intervallo PCR digitale consigliato (1-100.000 copie per 20 reazione l). Tenere presente che l'intervallo è impostato per ogni destinazione univoca (codice a barre), non per il gDNA totale.
2. Preparare le reazioni per la PCR digitale in duplicato secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Utilizzare le miscele del passaggio 6.1 come modello DNA. Utilizzare il mix master 20x primer-probe del passaggio 5.3 che contiene la sonda per il codice a barre diluito nel passaggio 6.1.
3. Preparare replicare le reazioni di controllo per la PCR digitale secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Le reazioni di controllo per ogni combinazione di probe devono essere costituite da 1) nessun controllo modello (NTC), 2) controlli negativi e 3) controlli positivi.
   NOT: Il numero minimo di reazioni di controllo di replica è due. In questo protocollo di esempio vengono utilizzati quattro NTC, sei controlli negativi e sei controlli positivi per ogni codice a barre. I controlli negativi devono contenere gDNA con ogni codice a barre, ad eccezione del codice a barre corrispondente alla sonda sottoposta a test. Questo convaliderà la specificità di ogni probe.
4. Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.3 per creare reazioni PCR digitali per ogni campione di gDNA con codice a barre. Nella figura 5è presente una disposizione della piastra di esempio.
   NOT: Questo e i passaggi successivi sono descritti sulla base di una specifica piattaforma PCR digitale che utilizza droplet e tecnologia flow-based. Le piattaforme PCR digitali alternative che utilizzano la tecnologia basata su chip possono essere facilmente sostituite con lievi modifiche a questo protocollo. Passo 6.4 può richiedere più di una piastra 96-po per convalidare tutti i set di primer. A differenza di qPCR, le piastre separate analizzate dalla PCR digitale possono essere facilmente confrontate senza la necessità di pozze di riferimento standardizzate tra piastre.
5. Generare goccioline per ogni condizione di reazione utilizzando un generatore di goccioline secondo le istruzioni del produttore.
6. Trasferire le goccioline appena create nella piastra appropriata di 96 pozzi. Utilizzare 200 punte di pipetta su una pipetta multicanale da 5 a 50 ll.
   NOT: Quando si pipettano le goccioline, pipetta lentamente e senza intoppi! Il produttore di apparecchiature PCR digitali consiglia di utilizzare solo pipette e punte di pipette di un particolare produttore (ad esempio, Ranin). Queste punte pipette hanno un'apertura liscia senza frammenti microscopici di plastica che possono distruggere le goccioline o danneggiare la microfluidica del lettore di goccioline. Numerosi marchi di punte sono stati esaminati e osservati per avere uno spettro di qualità di produzione. Risultati equivalenti sono stati ottenuti utilizzando alternative alla punta pipetta; tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si discosta dalle raccomandazioni del produttore.
7. Dopo che tutte le goccioline sono state generate e trasferite, sigillare la piastra con un sigillante piastra stagnola.
8. Utilizzare il termociclista raccomandato dal produttore per eseguire le seguenti condizioni di ciclismo: 1) 94 gradi centigradi per 10 min; 2) 94 gradi centigradi per 1 min, velocità di rampa impostata a 1 c/s; 3) 55 gradi centigradi per 2 min, velocità di rampa impostata a 1 gradi centigradi; 4) ripetere i passaggi 2 e 3 49 volte; 5) 98 gradi centigradi per 10 min; 6) tenere a 4 gradi centigradi fino a 24 h.
   NOT: Il trasferimento termico in una reazione di gocciolina non è lo stesso della PCR standard. Le condizioni di reazione possono richiedere modifiche.
9. Durante l'esecuzione del termociclo, programmare il software di analisi dei dati con le informazioni di impostazione della piastra, ad esempio il nome del campione, il tipo di esperimento (quantificazione assoluta), il supermix utilizzato, il nome del codice di destinazione 1 (nome del codice a barre FAM), il tipo target 1 (NTC, controllo positivo, controllo negativo, o sconosciuto), il nome del codice di destinazione 2 (nome del codice a barre HEX), il tipo di destinazione 2 (vuoto, controllo positivo, controllo negativo o sconosciuto). Le informazioni di configurazione della piastra finale sono mostrate nella Figura 5.
10. Al termine del termociclismo, trasferire le reazioni completate al lettore di goccioline e avviare il processo di lettura secondo le istruzioni del produttore.

7. Quantificare il numero di batteri in un esperimento sugli indici competitivi

1. Diluire gDNA isolato e quantificato dal paragrafo 4 ad una concentrazione appropriata come descritto sopra.
2. Preparare le reazioni per la PCR digitale secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo del supermix appropriato. Utilizzare il DNA del passaggio 7.1 come modello. Utilizzare un master mix 20x primer-probe che contiene la sonda (o sonde se rilevano sia FAM che HEX) per i possibili codici a barre presenti nell'esperimento.
3. Preparare ulteriori reazioni PCR digitali come nel passaggio 7.2 utilizzando diverse 20x primer-probe master mixes fino a quando tutti i codici a barre utilizzati nel progetto sperimentale possono essere rilevati.
4. Includere i controlli per ogni condizione come descritto in 6.3. Sono inclusi 1) nessun controllo modello (NTC), 2) controlli negativi e 3) controlli positivi.
5. Continuare con il protocollo come descritto nei passaggi 6.5-6.10.

8. Analizzare i dati PCR digitali e calcolare i numeri di copia assoluti

1. Quando tutti i pozzi sono stati letti e l'esecuzione è completa, aprire il file di dati .qlp utilizzando il software di analisi dei dati.
   NOT: I tipi di file e le procedure di analisi dei dati qui descritti sono specifici di un produttore digitale di PCR. Se si utilizzano piattaforme PCR digitali alternative, i tipi di file e le procedure di analisi dei dati saranno specifici della piattaforma utilizzata e devono essere eseguite in base alle specifiche consigliate dal produttore.
2. Selezionare tutti i pozzi che utilizzano lo stesso mix master primer-probe.
3. Nella scheda Goccioline, esaminare il numero di goccioline analizzate in ogni pozzo (sia goccioline positive che negative). Escludere dall'analisi qualsiasi pozzo con meno di 10.000 goccioline totali.
4. Passare alla scheda Ampiezza 1D ed esaminare le ampiezze delle goccioline positive e negative. Assicurarsi che comprendano due popolazioni distinte.
5. All'interno del software, utilizzare la funzione di soglia per effettuare un taglio tra goccioline positive e negative per ogni probe utilizzato (Figura 6).
   NOT: Tutti i pozzi che utilizzano lo stesso mix master primer-probe dal passaggio 5.3 devono avere le stesse soglie.
6. Una volta applicate le soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione. Esportare i dati in un foglio di calcolo per facilitare un'ulteriore analisi.
   NOT: Il software di analisi dei dati utilizza il numero di goccioline positive e negative che si adattano a una distribuzione di Poisson per determinare il numero di copie.
7. Utilizzando i valori del passaggio 8.6, calcolare il numero di copia iniziale di ogni codice a barre genomico univoco nell'esempio. Determinare il tasso medio di falsi positivi dalle reazioni di controllo negativo e sottrarre questo valore dai valori ottenuti nelle reazioni sperimentali. Moltiplicare i valori in base alle diluizioni eseguite durante l'impostazione di ogni esperimento (tabella3).

9. Determinare l'idoneità relativa di un organismo calcolando il CI o il COI dalla quantificazione digitale basata su PCR dei ceppi codificati a barre

1. Calcolare il CI di una deformazione con codice a barre utilizzando le seguenti formule in cui: A_Output è la quantificazione assoluta della deformazione con codice a barre in un determinato momento, WT_Output è la quantificazione assoluta dei batteri di tipo selvatico con codice a barre allo stesso timepoint, A_Input è la quantificazione assoluta dell'inoculum di ingresso della deformazione con codice a barre, WT_Input è la quantificazione assoluta dell'inoculo di ingresso dei batteri di tipo selvatico con codice a barre, X_Output è la somma di tutti i ceppi lo stesso timepoint, X_Input è la somma dell'inoculum di input totale di tutti i ceppi con codice a barre.

NOT: Vedere la discussione per vantaggi, svantaggi e l'uso più appropriato di ogni formula.

2. Ripetere il passaggio 9.1 per ogni deformazione con codice a barre in tutti i punti temporali.
3. Se applicabile, calcolare il COI utilizzando le seguenti formule in cui: A_Output è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con gene mutato A in un determinato momento, AB_Output è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con geni mutati A e B allo stesso tempo, A_Input è la quantificazione assoluta dell'inoculum di input del ceppo codificato a barre con gene mutato A, AB_Input è la quantificazione assoluta dell'inoculum di ingresso di ceppo codificato a barre con geni mutati A e B, B_Output è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con gene mutato B in un dato momento, e B_Input è la quantificazione assoluta dell'input inoculo del ceppo con codice a barre con gene mutato B.

O

Risultati

L'uso di questa metodologia richiede che vengano eseguite reazioni di controllo appropriate per convalidare la sensibilità e la specificità di ogni sonda utilizzata per identificare il DNA bersaglio. In questo esperimento rappresentativo, abbiamo convalidato otto codici a barre di DNA unici con le otto sonde corrispondenti per l'identificazione. Tutte e otto le sonde avevano un basso tasso di falsi positivi sia nella NTC che nelle reazioni di controllo negative (Tabella3)...

Discussione

La capacità di quantificare con precisione i microrganismi è di fondamentale importanza per la ricerca microbiologica e la capacità di enumerare ceppi unici provenienti da una popolazione mista iniziale si è dimostrata uno strumento inestimabile per valutare i tratti di forma e virulenza batteri. Tuttavia, le tecniche per realizzare questo non sono progredite al passo con gli sviluppi moderni nella biologia molecolare. La tecnologia per modificare facilmente i cromosomi di molti batteri, tra cui S. Typhimurium, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	22600028	Procure da qualsiasi produttore
Provette per coltura da 16 mL	MidSci	8599	Procure da qualsiasi produttore
5-200 μ L puntali per pipette	RAININ	30389241	Procurarsi marche di puntali alternativi con cautela in base alla qualità di produzione
5-50 μ Pipetta multicanale L	RAININ	17013804	Utilizzare con cautela pipette multicanale alternative
Agarosio	ThermoFisher Scientific	BP160-500	Procurarsi da qualsiasi produttore
Analisi BLAST	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler con modulo di reazione a 96 pozzetti profondi Bio	Rad	1851197	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Chimicamente competente DH5&alfa;	Invitrogen	18258012	Procurati da qualsiasi produttore o preparati tu stesso
Cloramfenicolo	ThermoFisher Scientific	BP904-100	Procurati da qualsiasi produttore
Cytation5 Lettore di micropiastre	BioTek	CYT5MF	Procurati da qualsiasi produttore, utilizza qualsiasi sistema in grado di quantificare con precisione il software di analisi dei dati del DNA
(QuantaSoft e QuantaSoft Data Analysis Pro)	Bio Rad	N/A	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Piastre ddPCR a 96 pozzetti	Bio Rad	12001925	Deve procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004	Deve procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
ddPCR Supermix per sonde (No dUTP)	Bio Rad	1863024	Deve procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Cartucce DG8 per generatore di gocce QX200/QX100 Bio	Rad	1864008	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Guarnizioni DG8 per generatore di gocce QX200/QX100 Bio	Rad	1863009	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Olio per la generazione di goccioline per sonde	Bio Rad	1863005	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	BP906-5	Procurati da qualsiasi produttore
Luria-Bertani agar	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	Procurati da qualsiasi produttore o fallo da solo da agar, triptone, lievito digestato e NaCl
Luria-Bertani brodo	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	Procurati da qualsiasi produttore o fallo da te da triptone, lievito digestato e NaCl
Piastra PCR Termosaldabile, lamina, perforabile	Bio Rad	1814040	Deve procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Provette per PCR	Eppendorf	951010022	Procure da qualsiasi produttore
Piastre di Petri	ThermoFisher Scientific	FB0875712	Procure da qualsiasi produttore
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	Non più disponibile in commercio
Primer/Probe Design	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP e pSKAP_Barcodes	Addgene	Numeri di plasmidi 122702-122726	www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Generatore di gocce QX200 Bio	Rad	1864002	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Lettore di gocce QX200	Bio Rad	1864003	È necessario procurarsi forniture ddPCR da Bio Rad. Le alternative non sono ancora disponibili.
Salmonella typhimurium ceppo ATCC 14028s	ATCC ATCC	14028s	www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate	BioTek	TAKE3	Procure da qualsiasi produttore, utilizzare qualsiasi sistema in grado di quantificare accuratamente il DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific	FERFD0054	Procure da qualsiasi produttore
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	Procura da qualsiasi produttore
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific	FERFD0504	Procura da qualsiasi produttore
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0832	Procura da qualsiasi produttore
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0503	Procura da qualsiasi produttore
Thermo Scientific Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	ThermoFisher Scientific	F534L	Procura da qualsiasi produttore
Thermo Scientific T4 DNA Ligasi	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	Procura da qualsiasi produttore
Thermocycler	Bio Rad	1861096	Procura da qualsiasi produttore
UVP Visi-Blue Transilluminator	ThermoFisher Scientific	UV95043301	O altro transiluminatore che consente la visualizzazione del DNA
Acqua, Grado di biologia molecolare	ThermoFisher Scientific	BP28191	Procurarsi da qualsiasi produttore