Qui descriviamo un'immunocattura indiretta del panino ELISA per determinare il contenuto di glicoproteina immunogenica nei vaccini sulla rabbia. Questo test utilizza un anticorpo Monoclonal neutralizzante (mAb-D1) riconoscendo i trimer di lecoproteine. È un'alternativa al test NIH in vivo per seguire la coerenza della potenza del vaccino durante la produzione.
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Articolo metodologico
Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia
In questo articolo
Sommario
Abstract
La crescente preoccupazione globale per il benessere degli animali sta incoraggiando i produttori e i laboratori nazionali di controllo (OMCL) a seguire la strategia 3Rs per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio. Lo sviluppo di approcci in vitro è raccomandato a livello dell'OMS e dell'Europa come alternative al test NIH per valutare la potenza del vaccino della rabbia. Sulla superficie della particella del virus della rabbia (RABV), i trimer di glicoproteina costituiscono il principale immunogeno per indurre gli anticorpi neutralizzanti virali (VNAbs). Un test ELISA, in cui neutralizzare gli anticorpi monoclonali (mAb-D1) riconosce la forma trimerica della glicoproteina, è stato sviluppato per determinare il contenuto della glicoproteina trimeric piegata nativa insieme alla produzione dei lotti di vaccino. Questo test di potenza in vitro ha dimostrato una buona concordanza con il test NIH ed è stato trovato adatto in sperimentazioni collaborative da parte dei produttori di vaccini RABV e oMCL. L'evitare l'uso degli animali è un obiettivo realizzabile nel prossimo futuro.
Il metodo presentato si basa su un'immunocattura indiretta del sandwich ELISA utilizzando l'mAb-D1 che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimovina RABV, cioè l'antigene rabV immunogenico. mAb-D1 viene utilizzato sia per il rivestimento che per il rilevamento dei trimer glicoproteici presenti nel lotto di vaccino. Poiché l'epitopo è riconosciuto a causa delle sue proprietà conformazionali, la glicoproteina potenzialmente denaturata (meno immunogenica) non può essere catturata e rilevata dal mAb-D1. Il vaccino da testare viene incubato in una piastra sensibilizzata con il mAb-D1. Le glicoproteine RABV trimeric legate vengono identificate aggiungendo nuovamente il mAb-D1, etichettato con perossidasi e poi rivelato in presenza di substrato e cromogeno. Il confronto dell'assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica.
Introduzione
Da più di 50 anni, il test NIH1 viene utilizzato come metodo gold standard per valutare la potenza del vaccino antirabbico prima del rilascio del lotto. Questo test consiste in un'immunizzazione intraperitale di gruppi di topi con il vaccino da testare seguita da una sfida intra-cerebrale (IC) 14 giorni dopo con il ceppo del virus della rabbia (RABV) Challenge Virus Standard (CVS). La potenza viene valutata dalla percentuale di topi che sopravvivono alla sfida IC. Sebbene l'OMS2 e la Pharmacopeia3 europea richiedano ancora il test NIH per valutare la potenza del vaccino, questo test subisce divers....
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Protocollo
1. Precauzioni di sicurezza
NOTA: questo metodo è applicabile sia al RABV vivo che al vaccino inattivato.
- Utilizzare le buone procedure di pratica e sicurezza di laboratorio.
- Indossare attrezzature di protezione personale (PPE) adeguate, tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera, occhiali, ecc.
- Quando il virus vivo è titolato, utilizzare un mobile di sicurezza biologica di classe II.
- Considerare qualsiasi materiale a contatto con i campioni (reagenti, soluzioni di lavaggio, ecc.) come materiale infettivo.
- Trattare il materiale contaminato immergendosi nella soluzione di candeggina (2,5% ....
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Risultati
Nell'esempio seguente viene utilizzato il vaccino di riferimento Lot 09, costituito da particelle di virus della rabbia inattivate purificate (ceppo vaccino fotovoltaico). Il contenuto di tagliatrici di glicoproteine (10 g/mL) in questo è stato stabilito dopo la determinazione della quantità totale di proteine virali (test BCA) e la valutazione della percentuale della glicoproteina da sDS-poliacritilmide gel elettroforesi. In alternativa, può essere utilizzato un vaccino di riferimento ca.......
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Discussione
L'epitopo riconosciuto dal mAb-D1 si trova nel sito antigenico III della glicoproteina RABV che non è solo immuno-dominante per l'induzione di VNAbs, ma anche coinvolto nella neurovirulenza, patogenicità40,41 e riconoscimento del recettore42. C'è un altro importante sito antigenico lungo la glicoproteina, sito II43, contro il quale diversi MAbs sono stati isolati come mAb-WI-111235. Questi po.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La dott.ssa Sylvie Morgeaux e il Dr. Jean-Michel Chapsal devono essere riconosciuti per la loro partecipazione chiave per stabilire il test ELISA sui lotti di vaccino e per organizzare workshop internazionali e studi collaborativi. Ringraziamo Sabrina Kali per la lettura critica del manoscritto. Il Dr. Pierre Perrin era responsabile dell'isolamento e della caratterizzazione di mAb-D1. Questo lavoro è stato principalmente sostenuto dai finanziamenti dell'Institut Pasteur.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cabina di sicurezza biologica di classe II | ThermoFisher Scientific | 10445753 | se titolante virus vivi |
| Piastre immuno non sterili a fondo piatto trasparenti a 96 pozzetti, 400 e micro; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | ottimo per legarsi all'anticorpo caricato |
| Equip Labo Cappa da laboratorio in polipropilene | ThermoFisher Scientific | 12576606 | per la preparazione di acido solforico |
| Piastra immunologica Strong Adsorbimento MAXISORP Flat Bottom Well F96 | Dutscher | 55303 | ottimo per legarsi all'anticorpo caricato |
| Sigillatura della micropiastra Nastro adesivo (100 fogli) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Lettore monomodale per micropiastre Sunrise | TECAN | ||
| Agitatore-incubatore per micropiastre | Dutscher | 441504 | |
| Lavapiastre Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Pipetta multicanale (30-300 &; L) Pipette | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Kit 2 : Pipette Finnpipette F2 0,2-2 μ L micro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L) | 4700880 | Scientifico ThermoFisher |
Riferimenti
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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Ristampe e permessi
