Method Article

Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riportiamo l'elettroporazione messaggera RNA (mRNA) come un metodo che permette l'espressione rapida ed efficiente di più proteine nel sistema del modello embrionale di quaglia. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule fluorescenti e registrare i loro movimenti in vivo mediante microscopia time-lapse poco dopo l'elettroporazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riportiamo che l'elettroporazione dell'mRNA consente alle proteine fluorescenti di etichettare le cellule negli embrioni di quaglia viventi più rapidamente e in generale rispetto all'elettroporazione del DNA. L'elevata efficienza di trasfezione consente di co-trasfetare almeno 4 mRNA distinti con un'efficienza dell'87%. La maggior parte degli mRNA elettroporate sono degradati durante i primi 2 h dopo l'elettroporazione, permettendo di effettuare esperimenti sensibili al tempo nell'embrione in via di sviluppo. Infine, descriviamo come immaginire dinamicamente embrioni vivi elettroporate con mRNA che codificano varie proteine fluorescenti subcellulari mirate.

Introduction

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L'elettroporazione è un metodo di trasfezione fisica che utilizza un impulso elettrico per creare pori transitori nella membrana plasmatica, permettendo a sostanze come gli acidi nucleici o le sostanze chimiche di passare nel citosol. L'elettroporazione è ampiamente utilizzata per fornire DNA in batteri, lieviti, piante e cellule di mammiferi1,2,3. Viene regolarmente utilizzato per introdurre carichi genetici nelle cellule bersaglio e nei tessuti all'interno dell'embrione aviario in via di sviluppo per studiare il controllo genetico dello sviluppo o etichettare le popolazioni migratorie di cellule4,5,6, 7. Tuttavia, esistono anche diverse limitazioni sperimentali con l'elettroporazione del DNA8. Per esempio, l'elettroporazione del DNA spesso introduce un numero altamente variabile di vettori di espressione per cellula e successivamente gli mRNA e le proteine che codificano. Questa variabilità può portare a una notevole eterogeneità cellulare-cellula che complica sia l'analisi dell'immagine che l'interpretazione dei dati9,10. Inoltre, le proteine dell'elettroporazione del DNA iniziano solo ad esprimere 3 h dopo l'elettroporazione e non raggiungono la massima efficienza nel numero di cellule e nell'intensità della fluorescenza fino a 12 h, probabilmente a causa del tempo necessario per il trasferimento nel nucleo e il completamento sia la trascrizione che la traduzione in vivo11.

Al contrario, la trafezione dell'mRNA è stata utilizzata efficacemente in una varietà di sistemi modello, tra cui Xenopus laevis oeciti per microiniezione12,13, riprogrammando le cellule staminali umane mediante trasfezione di lipofectamina di mRNA14 ed elettroporare le cellule staminali neurali nei topi adulti15. Abbiamo testato la capacità dell'elettroporazione dell'mRNA di etichettare in modo efficiente le cellule durante lo sviluppo embrionale aviaria precoce utilizzando mRNA sintetizzati in vitro che codificano proteine fluorescenti distinte (FP). Per i nostri studi, abbiamo utilizzato il vettore pCS2, un vettore di espressione multiuso che viene comunemente utilizzato per esprimere proteine negli embrioni di Xenopus e di pesce zebra. I promotori di polimerasi dell'RNA SP6 e T7 nel pCS2 consentono la sintesi di mRNA e proteine da qualsiasi gene clonato se usato in un sistema di trascrizione/traduzione in vitro.

Qui, dimostriamo che l'elettroporazione dell'mRNA consente un'espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo progettato e generato molti dei vettori di espressione utilizzati in questi studi. Ad esempio, abbiamo sottoclone del gene LifeAct-eGFP16 nel vettore pCS217 per esprimere dal promotore CMV e dal promotore SP6. Il gene inserito si trova a valle del promotore SP6 e a monte della coda18poli SV40. Negli embrioni co-elettropolizzati con mRNA e DNA, gli FP codificati da mRNA trascritti in vitro sono stati rilevati per la prima volta entro 20 min dall'elettroporazione, mentre le FP dei vettori di espressione del DNA sono state rilevate solo dopo 3 h. La codifica multipla degli mRNA per il nucleare, il Golgi e le proteine della membrana possono essere elettroporate in un embrione contemporaneamente, con conseguente espressione rapida ed efficiente di più proteine nelle singole cellule. Infine, utilizzando un recupero di fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP), mostriamo che la maggior parte dei mRNA elettroporate decade entro 2 h. Pertanto, una rapida produzione iniziale di proteine combinata con una nuova traduzione proteica limitata rende l'elettroporazione dell'mRNA una tecnica preziosa quando è necessario il controllo temporale dell'espressione.

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Protocol

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Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida approvate dal Children's Hospital di Los Angeles e dai comitati per la cura e l'uso degli animali della University of Southern California.

1. Vettori di espressione basati su pCS2 di generazione

  1. Per clonare pCS2.Lifeact-eGFP, preparare la spina dorsale vettoriale digerendo 2 g di pCS2.CycB1-GFP (un costrutto contenente un inserto diverso) con BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) nel buffer di digestione appropriato (vedere Tabella dei materiali) diluito a 1x in una reazione totale volume di 50 l per 1 h a 37 gradi (vedere la figura 1 per lo schema della procedura di clonazione).
    1. Dephosphorylate le estremità libere 3'OH della spina dorsale vettoriale dalla reazione enzimatica di restrizione con l'aggiunta di gamberi alcalini fosfofore (1 U). Incubare per 30 min a 37 .
    2. Eseguire l'intera miscela in un buffer 1% di gel di agarose/1x Tris Acetate EDTA (TAE) a 90 V per 50 min e quindi macchiare il gel in una soluzione di 0,5 g/mL di bromuro di etidio in 1x tampone TAE per 15 min con dondolo delicato. Inoltre, assicurati di caricare i marcatori di peso molecolare in una corsia libera per aiutare a determinare le dimensioni del DNA.
    3. Utilizzando un Transilluminatore UV sicuro per il DNA per evitare di intasare i DNA, ritagliare rapidamente la spina dorsale vettoriale (dimensione prevista della banda di 4kb) dal gel di agarose e isolare il frammento di DNA dal pezzo di gel utilizzando un kit di purificazione del gel utilizzando le istruzioni del produttore.
  2. Contemporaneamente al passo 1.1, preparare l'inserto digerindo 2 g di pEGFP-N1-Lifeact con BglII (10 U) e BsrGI (10 U) in un buffer di digestione appropriato diluito a 1x in un volume di reazione totale di 50 - L per 1 h a 37 . Eseguire l'intera miscela in un gel di agarose dell'1% per isolare la banda di 800 bp come spiegato in precedenza nel passaggio 1.1.2-1.1.3.
  3. Dopo che sia il vettore che l'inserto sono purificati e quantificati sullo spettrofotometro, combinate 50 ng del vettore e 38 ng dell'inserto (1:3 molare rapporto di vettore per inserto) nel buffer di ligase del DNA T4 prima di aggiungere il DNA T4 ligase per catalizzare la reazione di legatura. Inoltre, impostare un controllo nessun DNA, un controllo solo vettoriale e un controllo solo inserimento. Incubare tutte le reazioni a temperatura ambiente per 30 min.
    1. Trasformare 1 ll della miscela(s) di ligazione in competente E. coli DH10. Inoltre, trasformare l'acqua solo controllo negativo e 20 pg di controllo pUC19 positivo. Stendere i batteri su piastre di agar Luria Broth (LB) contenenti 50 g/mL di ampicillina e incubare durante la notte a 37 .
    2. La mattina seguente, conta le colonie su ogni piatto.
      NOT: Idealmente, non ci dovrebbero essere colonie sulle piastre di controllo negativo, >100 colonie sul vettore: inserire le lastre di legatura e meno colonie sulla piastra solo vettoriale.
    3. Scegli almeno 8 colonie batteriche dalla piastra di agar trasformate con la miscela di ligazione vettoriale e inocularle usando stuzzicadenti sterili o punte di pipetta in 2 mL di brodo LB liquido contenente 50 Ampicillina.
    4. Estrarre il DNA da ciascuno dei cloni utilizzando kit di miniprep plasmide commerciali.
    5. Eseguire un digest di restrizione diagnostica utilizzando 500 ng di DNA da ogni clone utilizzando NotI (10 U) e BamHI (10 U) nel buffer di digestione appropriato diluito a 1x per 1 h a 37 gradi centigradi ed eseguire il DNA digerito su un 1% di gel di agarose nel buffer 1x TAE. Le dimensioni previste per i cloni positivi pCS2.Lifeact-eGFP sono di 3,9 kb e 978 bp.
    6. Trasformate 1 pg-100 ng di DNA dal clone positivo in competente E. coli DH10 e preparate 3-4 miniprep reazione, come descritto nei passaggi precedenti, per ottenere una quantità sufficiente di DNA per la reazione di trascrizione in vitro (minimo di 10 g).

2. Preparazione dell'mRNA da parte della trascrizione in vitro

  1. Linearizzare 10 g di pCS2.LifeAct-eGFP all'estremità 3' dell'inserto con NotI (10 U) in un buffer di digestione appropriato diluito a 1x in un volume di reazione totale di 50 .L a 37 s durante la notte.
    NOT: Per prevenire la contaminazione da RNase e ridurre la degradazione dell'mRNA, indossare i guanti durante la manipolazione dei campioni di mRNA.
  2. Purificare il DNA utilizzando una miscela di fenolo: cloroformio: alcol isoamyl (25:24:1, v/v).
    1. Aggiungere 150 l di acqua senza RNase per rendere il volume totale della reazione di digestione pari a 200 .L. Quindi, aggiungere 200 l di fenolo: cloroformio: l'isoamyl alcol e vortice la miscela per 20 s.
    2. Centrifuga in un microfugo alla velocità massima (18.400 x g) per 2 min. Rimuovere con attenzione la fase acquosa superiore che contiene il DNA linearizzato. Ripetere questo passaggio per rimuovere ulteriori impurità e fare attenzione a non interrompere il precipitato bianco che può formarsi tra le fasi liquide inferiore e superiore.
  3. Il DNA linearizzato precipitato aggiungendo 1/10 di acetato di sodio 3M volume (senza RNase) e 2,5 volumi di 100% di etanolo. Lasciare la miscela a -20 gradi centigradi per >30 min, quindi pellet il DNA centrifugando alla velocità massima (18.400 x g).
    1. Lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo, quindi asciugare ad aria il pellet per >5 min.
    2. Sciogliere il pellet di DNA in 5-L di acqua senza RNase. Quantificare il DNA mediante spettrofotometro.
      NOT: La concentrazione prevista del DNA è di 0,5-1 s/L con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,7-2,0.
  4. Utilizzare 1 g di DNA linearizzato pCS2.LifeAct-eGFP per la trascrizione in vitro (IVT). Seguire le istruzioni del produttore nel kit commerciale (vedi Tabella dei materiali) per includere 10 l di tappo analogico (concentrazione finale 0,8 mM) e NTP (concentrazione finale 1 mM per ATP, CTP e TTP; 0,2 mM per GTP), 2 lun di buffer di reazione 10x (concentrazione finale 1x), 2 luna di polimerasi di RNA SP6 e acqua senza RNase fino a 20 -L.
    1. Incubare la miscela IVT per circa 2 h o più, a seconda delle dimensioni della trascrizione.
      NOTA: 2 h incubazione funziona bene per una trascrizione 3 kb, ma incubazione durante la notte funziona meglio per le trascrizioni che sono superiori a 5 kb.
    2. Per rimuovere i nucleotidi liberi dalla reazione di trascrizione, aggiungere 30 -L di soluzione di precipitazione dell'RNA LiCl (7,5 M di cloruro di litio, 50 mM EDTA) per far precipitare l'mRNA. Vorticare brevemente la miscela e conservare a -20 gradi centigradi per 30 min. Ruotare l'mRNA verso il basso per 15 min in un microfuge alla velocità massima (18.400 x g) e risciacquare con 70% di etanolo (senza RNase).
  5. Sciogliere l'mRNA sintetizzata in 15 -L di acqua senza RNase. Erogalare l'mRNA sintetizzato a 5 l/tubi (3 tubi in totale) e mettere a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. Quantitate l'mRNA con uno spettrofotometro.
    NOT: La resa prevista è di 15-20 g di mRNA. Per un esperimento con 10 embrioni è sufficiente un lpossibile per un esperimento con 10 embrioni, supponendo che l'mRNA sia diluito da 1 g/l a 500 ng/L e che ogni embrione sia iniettato con 200 nL. Ogni tubo dovrebbe, pertanto, contenere un mRNA sufficiente per gli esperimenti da 5 dollari.
  6. Eseguire 300 ng di mRNA su un 1% di gel di garose in 1x tampone TAE dopo aver pulito tutte le apparecchiature di gel con la soluzione di decontaminazione RNase (ad esempio, RNase Away) e assicurarsi che l'mRNA appaia come una banda (più bande possono essere presenti se si formano strutture secondarie) e che non nella corsia di gel, che indica la degradazione dell'RNA.

3. Preparazione del mix di elettroporazione dell'mRNA

  1. Scongelare e diluire l'mRNA alla concentrazione desiderata (250-500 ng/L in acqua priva di RNase funziona bene per tutti gli mRNA testati in questo lavoro). Aggiungere un volume di colorante colorato (vedere Tabella dei materiali, senza RNA, 0,1% concentrazione finale) per aiutare a visualizzare il sito di iniezione di mRNA e posizionare correttamente gli elettrodi.
    NOTA:     Se DNA e RNA sono combinati per eseguire una co-elettroporazione, assicurarsi che il DNA sia privo di RNacoli contaminati utilizzando l'estrazione del fenolo cloroformio e la precipitazione dell'etanolo prima della miscela di mRNA e DNA.
    1. Assicurarsi di preparare un controllo negativo utilizzando una soluzione di elettroporazione fittizia (senza RNA aggiunto). Se possibile, preparare un controllo positivo utilizzando mRNA pre-convalidato (mRNA che è stato dimostrato di produrre FP con successo negli esperimenti precedenti).
      NOT: Il controllo negativo è essenziale per tutti gli esperimenti di imaging per stabilire livelli di fluorescenza di fondo per la normalizzazione dei dati. Il controllo positivo è particolarmente importante quando si lavora con mRNA appena trascritto, aiutando a confermare che le impostazioni di elettroporazione hanno funzionato.
  2. Conservare la soluzione di elettroporazione dell'mRNA su un liquame di ghiaccio per prevenire la degradazione fino a quando non è pronto per procedere con l'elettroporazione.

4. Elettroporate mRNA in embrioni di quaglia vivente

  1. Raccogliere le uova di quaglia appena pelate ogni giorno e conservarle a 13 gradi centigradi in un frigorifero umido per non più di 1 settimana. Incubare le uova di quaglia a 38 gradi centigradi fino alle fasi di sviluppo embrionale desiderate19,20,21.
    NOT: Da HH3 a HH5 sono stati utilizzati in questo studio sia per l'imaging statico che per quello dinamico. Per gli embrioni HH3, lasciare gli ovuli a temperatura ambiente per 2 h prima della raccolta rende il processo di isolamento molto più facile in quanto gli embrioni sono generalmente più resistenti alle manipolazioni fisiche quando raffreddati.
  2. Isolare e preparare gli embrioni secondo il sistema di coltura CE22. Raccogliere almeno 5 embrioni per condizione, di cui almeno uno per fungere da controllo negativo (non elettroporate).
    1. Rompere delicatamente e versare l'uovo in un piatto Petri di 10 cm. Rimuovere la maggior parte della spessa albumina con una pipetta di trasferimento e rimuovere la restante albumina spessa intorno all'embrione asciugando delicatamente la superficie del tuorlo con una salvietta di tessuto per garantire che l'embrione si attacchi strettamente all'anello di carta.
    2. Posare la carta da filtro pretagliata (vedi Tabella deimateriali) sull'embrione e utilizzare le forbici per tagliare senza problemi intorno al perimetro dell'embrione.
    3. Utilizzare una pipetta Pasteur per essere alla base dell'embrione con PBS, utilizzando dolci flussi per liberare qualsiasi tuorlo attaccarsi all'embrione.
      NOT: Questo passaggio è fondamentale quando si lavora con embrioni più giovani (
    4. Tirare lentamente l'anello embrionale/carta con un angolo obliquo su e giù dal tuorlo in un piatto Petri pieno di PBS per un'ulteriore pulizia. Una volta rimossa la maggior parte del tuorlo, posizionare il lato ventrale dell'embrione su un piatto Petri da 35 mm coperto da una miscela semi-solida di agar/albumen.
  3. Preparare da sei a otto microcapillari di vetro lunghi 10 cm (O.D. - 1,2 mm) utilizzando uno strumento di espirazione a micropipetta in vetro.
  4. Collocare il lato ventrale dell'embrione nella camera di elettroporazione riempita con PBS. Utilizzando un microcapillare di vetro, iniettare un bolus di 200 nL del mix di elettroporazione mRNA o DNA/mRNA nella cavità tra l'epiblaste e la membrana vitelline che copre la regione desiderata.
    NOT: L'intera area anteriore per pellucida e qualche area per l'opaca è stata elettropolitanella nella maggior parte degli esperimenti mostrati in questo manoscritto.
  5. Posizionare gli elettrodi positivi e negativi (platino elettrodo quadrato piatto; lunghezza laterale di 5 mm) rispettivamente sulla parte superiore e inferiore dell'embrione e sull'elettroporate utilizzando la seguente sequenza di impulsi: cinque impulsi elettrici quadrati di 5 V, 50 ms di durata con intervalli di 100 ms utilizzando un elettroporatore in vivo. Assicurarsi che la distanza tra gli elettrodi sia di 5 mm.
    NOT: L'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione è fondamentale per evitare condizioni che possano uccidere le fragili cellule embrionali. I parametri di tensione, lunghezza dell'impulso, intervalli di impulsi e il numero di impulsi per DNA e mRNA devono essere considerati per vari dispositivi di elettroporazione.
  6. Incubare gli embrioni elettropotati a 38 gradi centigradi nella fase di sviluppo desiderata.
    NOT: Uno stereoscopio di dissecing fluorescente (vedi Tabella deimateriali) aiuta a vagliare gli embrioni trasfettati rispetto a quello non trasvenuto.
  7. Se gli embrioni devono essere immagine staticamente, fissarli in 4% paraformaldeide in PBS per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi.
    1. Rimuovere gli embrioni dalla membrana vilia tagliando agevolmente il perimetro della carta filtrante con le forbici e staccando delicatamente la membrana lucida sulla superficie dorsale con pinze affilate.
    2. Lavare gli embrioni fissi in PBS/Triton (0,1%) 2x per 5 min e continuare con l'ibridazione in situ o immunostaining, se lo si desidera.
    3. Infine, macchiare l'embrione in 0,5 g/DAPI in PBS/Triton (0,1%) per almeno 30 min a temperatura ambiente. Lavare gli embrioni in PBS/Triton 2x per 5 min e ripulire l'embrione nella soluzione SCALE-U223 durante la notte.
  8. Per analizzare l'efficienza dell'elettroporazione (vedere la figura2), utilizzare lo strumento di analisi binaria e delle particelle e il canale DAPI su ImageJ per ottenere contorni nucleari da tutte le celle dell'immagine.
    1. Per utilizzare lo strumento binario su ImageJ, utilizzare una singola z-slice nel canale DAPI contenente la maggior parte delle celle e fare clic su Elabora > Binario > Rendi binario. Per separare le celle vicine, fare clic su Elabora > Binario > Bacino idrografico. Ottenere i contorni delle celle facendo clic su Analizza > Analizza particelle, dimensione impostata su 100-500 (m2).
    2. Assicurarsi che la maggior parte delle celle sia delineata nel canale DAPI e salvare i contorni delle celle facendo clic su Altro > Salva nella finestra popup di Gestione ROI.
    3. Usate questi contorni per ottenere i valori di intensità della fluorescenza per il canale mRNA e DNA aprendo il file precedentemente salvato su una singola z-slice nel canale mRNA o DNA, quindi fate clic su Misura sul gestore del ROI.
    4. Infine, filtrare questi valori di intensità, contando le celle con intensità di <6,000 fluorescenza come celle non transfette e le cellule con intensità di fluorescenza >6,000 come trasfetate.

5. Immagini FPs codificati da mRNA elettroporate

  1. Scegli l'embrione più sano e migliore elettropozzato per gli esperimenti di imaging dinamico dopo aver esaminato tutti gli embrioni elettropotati sotto lo stereoscopio di dissecing fluorescente.
    1. Continuare a incubare gli altri embrioni elettropotati e l'embrione non elettropoterato (il controllo negativo) in un'incubatrice separata durante l'imaging dell'embrione scelto nel caso in cui questo embrione muoia durante l'esperimento.
  2. Per l'imaging dinamico, utilizzare la coltura dell'embrione aviario ex ovo intero come descritto in precedenza24,25,26 con un microscopio confocale invertito.
    NOTA:     Il microscopio è dotato di un'incubatrice sul palco (vedi Tabella deimateriali) che mantiene la temperatura a 36 gradi centigradi durante l'imaging. Durante l'allestimento del microscopio è stato osservato che gli embrioni incubati a 36 gradi centigradi sopravvivono più a lungo rispetto alle temperature più elevate, probabilmente perché il laser può causare il riscaldamento locale sull'embrione. I lettori devono determinare la temperatura di incubazione ottimale in fase per il proprio microscopio.
    1. Per creare dinamicamente un'immagine e visualizzare l'embriogenesi, pulire brevemente l'embrione elettropotizzati con PBS per rimuovere eventuali bolle che possono formarsi sul lato dorsale dell'embrione durante il processo di elettroporazione spostando l'embrione utilizzando le pinze in un PBS pulito soluzione.
    2. Posizionare l'embrione pulito direttamente su un piatto di imaging contenente un sottile strato di albumen-agar (150 dollari l, assicurandosi di non generare bolle sulla superficie dorsale dell'embrione22.
    3. Per garantire la sopravvivenza per l'imaging a lungo termine, aggiungere un piccolo pezzo di carta velina arrotolata ai bordi interni del piatto di imaging e sigillare il piatto utilizzando la pellicola di paraffina per ridurre al minimo l'evaporazione durante l'imaging e l'incubazione.
    4. Spostare rapidamente questo piatto allo stadio preriscaldato di un microscopio confocale e individuare il colorante colorato nell'embrione utilizzando il canale del campo luminoso (laser PMT 20%), che identifica la regione iniettata ed elettroporata.
  3. Impostare il software di imaging sull'obiettivo desiderato (10 o 20x), mirror dicroico (488 nm per GFP nm, 561 per RFP), spettri di emissione (499-562 nm per GFP, 570-695 nm per RFP) e attivare un laser appropriato (488 per GFP, 561 nm per RFP).
    NOTA:     l'mRNA elettrofocato è stato tradotto in proteine che sono state osservate entro 20 min (vedi Figura 3). I metadati di imaging utilizzati per la maggior parte delle immagini in questo articolo erano: un microscopio confocale invertito con un obiettivo 20x (vedi Tabella deimateriali); pixel di persire il tempo, 1,5 dollari; di scansioni a 4 righe.
    1. Fare clic su Live sul software di imaging e regolare la potenza del laser su un'impostazione appropriata per l'intensità di fluorescenza a seconda di ogni potenza laser del microscopio. Inizia con l'imaging dell'embrione usando l'1% di potenza laser, 800 guadagni, e aumenta la potenza laser lentamente dell'1% di incrementi fino a quando non si vedono pixel saturi.
    2. Seguire questo diminuendo leggermente la potenza del laser fino a quando non si vedono più pixel saturi.
      NOT: La potenza laser scelta per l'inizio di una sessione di imaging di un embrione può essere buona per i punti temporali precedenti, ma non ideale in momenti successivi se la fluorescenza delle cellule diventa molto più luminosa o dimmer nel tempo. Per affrontare questo problema, immagini l'embrione a impostazioni di potenza leggermente inferiori inizialmente poiché le cellule elettroporate generalmente diventano più luminose nelle prime 6 ore dopo l'elettroporazione (vedere la figura 3A-E per la quantificazione dell'aumento del segnale). Se le immagini successive sono sature, continuare a visualizzare l'immagine con le impostazioni di imaging originali, ma scattare un'immagine aggiuntiva subito dopo con impostazioni di imaging più deboli (foro stenopeico più piccolo o potenza laser più debole).
    3. Immagina l'embrione ogni 3-5 min per tracciare la migrazione delle singole cellule attraverso diversi punti temporali. Per questo lavoro, le immagini erano z-stack (spesso 50 m) dell'intera area elettropostata, più un po 'di spazio in più verso il fondo della z-stack nel caso in cui l'embrione sprofondi nel letto agarose per tutta la sessione di imaging.
    4. Osservare la velocità di movimento delle celle controllando i primi punti temporali del primo filmato. Se le celle si muovono rapidamente (il che significa che usciranno dall'area dell'area dell'immagine entro un altro punto temporale), è consigliabile espandere lo zoom dell'area di immagine (1x à 0.8x) o l'imaging di un'area diversa.
      NOT: Le regioni embrionali dell'area pellucida si muovono molto più rapidamente di quelle dell'opaca. Inoltre, gli embrioni più giovani (HH3, HH5) spesso contengono cellule che stanno subendo un movimento più rapido rispetto agli embrioni più vecchi (>HH7).
    5. Dopo aver creato l'imaging della regione elettroponata dell'embrione, immaginare una regione non elettroponata dello stesso embrione per determinare i livelli di autofluorescenza (dovrebbe essere minimo se si usa l'embrione a bassa potenza laser).

6. Recupero di fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP) per testare l'integrità dell'mRNA

NOT: Un assaggio di fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP) può essere utilizzato per determinare per quanto tempo l'mRNA transinfezione potrebbe essere tradotto in FP. Il seguente protocollo descrive un esperimento FRAP per rilevare l'emivita di H2B. MRNA di citrino in un embrione elettropotato.

  1. Eseguire esperimenti FRAP sul microscopio confocale invertito utilizzando un obiettivo 20x 0.8 NA e un foro stenopeico completamente aperto.
    1. Dopo aver confermato l'elettroporazione di H2B-Citrine sullo stereomicroscopio e aver impostato l'embrione sullo stadio preriscaldato sul microscopio confocale invertito (vedi passo 5.2.4), fotobleach la maggior parte della fluorescenza cellulare da H2B-Citrine in una varietà di tempo punti (45 min, 2 h e 5 h dopo l'elettroporazione) utilizzando il laser da 405 nm con 70% di potenza laser, 100 iterazioni, velocità di scansione 4, che lascia solo il 5% della fluorescenza rimanente.
      NOT: Questo processo dovrebbe richiedere un paio di minuti.
    2. Continuare a incubare gli embrioni sullo stage a 36 gradi centigradi dopo la fotosbiancatura.
  2. Assicurati di prestare attenzione alla divisione attiva delle cellule all'interno della regione fotosbiancata, che indicano che le cellule fotosbiancate non sono completamente morte dopo il trattamento.
  3. Acquisire immagini post-candeggina (z-stack s della regione elettropoterata) per un massimo di 30 min a intervalli di tempo regolari (3 o 5 min) utilizzando il microscopio confocale.
    NOT: Se disponibile, utilizzare una linea Transgenica H2B-XFP come controllo positivo per garantire la sopravvivenza delle cellule nella regione fotosbiancata. Il tasso di recupero della fluorescenza per l'FP codificato dall'mRNA elettroporate dovrebbe diminuire, ma che per l'FP codificato tramite transgene dovrebbe rimanere costante per tutto il film.
  4. Per garantire che le condizioni di imaging non influenzino deleteriamente la sopravvivenza degli embrioni, incubare contemporaneamente embrioni elettroporate non fotofalati, che possono fungere da controllo per l'imaging.
  5. Per quantificare i risultati della fotobleachazione per il decadimento dell'mRNA dopo l'elettroporazione, tracciare la fluorescenza cellulare nel tempo (3 o 5 min) misurando l'intensità di fluorescenza del centro (un cerchio di 7,5 m) di ogni cellula utilizzando ImageJ. Misurare questo per tutte le cellule all'interno della regione fotosbiancata che non sono sottoposte a mitosi e sono stati completamente fotosbiancati.
    NOT: Considerare l'omissione delle cellule mitotiche dalla quantificazione poiché i nuclei mitotici hanno una fluorescenza più forte rispetto ai nuclei interfase a causa della condensa della cromatina.
  6. Tracciare l'intensità della fluorescenza nel tempo post-candeggina in una varietà di punti temporali (45 min, 2 h, e 5 h).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettroporazione dell'mRNA è più efficiente dell'elettroporazione del DNA

Abbiamo usato il pCS2. H2B-Citrine per preparare mRNA trascritto in vitro. Dal momento che l'elettroporazione del DNA viene di solito eseguita a 1-2 g/L, abbiamo usato una concentrazione equimolare di mRNA (calcolata intorno a 0,25-0,5 g/l per H2B-Citrine) per l'elettroporazione dell'mRNA. Per prima cosa abbiamo testato l'efficienza dell...

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Discussion

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In questo protocollo, abbiamo fornito istruzioni passo dopo passo su come microiniettare ed elettroporate precisamente l'mRNA nelle cellule degli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo dimostrato che l'elettroporazione dell'mRNA in vitro sintetizzata consente un'espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti (Figura 2 e 3). La fluorescenza dalla proteina H2B-citriga tradotta da mRNA elettroporati potrebbe essere rile...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Ringraziamo David Huss per informazioni utili su questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) e dalla USC Provost's Undergrad Research Fellowship a M.T., dal Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award a M.D., e dall'Università di Premio Del Southern California Undergraduate Research Associates Program a R.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilicoThermo Fisher
trascrizione in vitro 15593031 SP6 mMessage MachineThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole, t-Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole tert-ottilfenil etere
DAPISigma AldrichD95422-(4-Amidinofenil)-6-indolecarbamidina dicloridrato, 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato, DAPI dicloridrato
Whatman No.1 carta da filtroSigma AldrichWHA1001125
gliceroloSigma AldrichG9012
UreaSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi è stato un dono di Dorus Gadella (Addgene plasmide # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Metodi 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneQuesto documento
pCS.H2B-citrinoAddgene53752pCS-H2B-citrino è stato un dono di Sean Megason (Addgene plasmide # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry è stato un dono di Sean Megason (Addgene plasmide # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Microscopio invertito Zeiss LSM-780Carl Zeiss Microscopy GmbHL'LSM-780 è un microscopio confocale e multifotonico che offre la sensibilità necessaria per il lavoro di imaging vitale. Dotato di un tavolino motorizzato, di un dispositivo di messa a fuoco automatica e di un'incubatrice oscurante completa, il 780 è un eccellente microscopio per l'imaging di cellule vive/embrioni di fascia alta. Il rivelatore Quasar a 32 canali ad alta sensibilità consente l'imaging spettrale, l'unmixing lineare e l'acquisizione di immagini ad alto numero di colori (>4). L'eccitazione può essere eseguita con laser a fotone singolo a 6 linee (405, 458, 488, 514, 564 e 633 nm), laser Chameleon (Coherent) a 2 fotoni (gamma da 690 nm a 1000 nm) ed eseguita con il software di sistema ZEN 2011 SP7 (nero).
Elettroporatore in vivo CUY-21 EDITBex Co., Ltd.
Elettrodo quadrato piatto in platino, lunghezza laterale 5 mmBex Co., Ltd.
Stereomicroscopio Olympus MVX10 FLOlympus LifeScience
XM10Soluzione
salina tamponata >con fosfato (PBS) per HCR (10&<24), pH 7,4 Per preparare 1 L di una soluzione madre 10&, combinare 80 g di NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g di KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g di Na2HPO4 (anidro; Sigma-Aldrich S3264) e 2,7 g di KH2PO4 (anidro; Sigma-Aldrich P9791). Regolare il pH a 7,4 con HCl e portare il volume finale a 1 L con H2O ultrapuro. Evitare l'uso di CaCl2 e MgCl2 nella PBS per l'HCR. È importante che il PBS per HCR sia preparato come soluzione priva di RNasi (ad esempio, tramite trattamento con dietilpirocarbonato [DEPC]).
1,37 m NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonAggiungere 1 mL di Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) e 100 mL di 10× PBS a 890 mL di H2O distillato ultrapuro. Filtrare la soluzione attraverso un 0,2 μ m filtrarlo e conservarlo a 4 ? C fino all'uso.
1& volte; soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (trattata con DEPC; pH 7,4)
0,1% Triton X-100
Kit di LF701P5E Fotocamera monocromatica

References

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