Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell'osso coinvolti per l'analisi successiva, nonché l'uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.
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Articolo metodologico
Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali
In questo articolo
Sommario
Abstract
I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l'uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.
Introduzione
La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell'ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell'attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell'ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro
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Protocollo
Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall'Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930).
1. Installazione della legatura
NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L'uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all'interno di un armadio di biosicurezza, l'uso di strumenti sterili e l'inoculazione della cavità orale con patogeni parodontali per causare le manifestazioni cliniche della parodontite.
- Somministrare l....
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Risultati
Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un'ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di flu.......
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Discussione
L'elemento più critico associato all'uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni39. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo mod.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
J. W. C. è supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Chunxiang Sun per la sua assistenza nell'esecuzione della colorazione blu trypan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-topo F4/80 | BioLegend | 123131 | BV421, clone BM8 |
| Anti-topo Ly6G Anticorpo | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, clone 1A8 |
| C57BL/6 topi maschi | Charles River | 8 a 12 settimane di età | |
| FroggaBio | TB15-500 | 15 mL | |
| provetta da centrifuga conica | FroggaBio | TB50-500 | 50 ml |
| FACS Buffer | Multiplo | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Modello 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| del calore | Hallowell | HTP-1500 | |
| Sterilizzatore per perline di vetro caldo | Microscopia elettronica Sciences | 66118-10 | Germinatore 500 |
| Forbici dell'iride | Almedic | 7602-A8-684 | |
| Ketamina | Vetochinolo | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Siero di topo | Sigma | M5905-5ML | |
| Filtro a rete di nylon | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 & micro; m |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | 28908 | 16% (p/v), |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma | D1408-500ML | senza CaCl2 e MgCl2, 10 |
| siringhe monouso in plastica | BD | 309659 | 1 ml di |
| siero di ratto | Sigma | R9759-5ML | |
| Sutura | in setaCovidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Pinze per schegge | Almedic | 7726-A10-700 | # 1 |
| Pinze per schegge | Almedic | 7727-A10-704 | # 5 |
| Microscopio da dissezione stereo | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Ago ipodemico sterile | BD | 305111 | 26G x 1/2" |
| Siringa | BD | 309659 | 1 ml |
| Xilazina | Rompun | 20mg/mL |
Riferimenti
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005). <....
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Ristampe e permessi
