Questo rapporto descrive metodi completi per la preparazione di sezioni della retina del topo congelato per l'immunohistochimica (IHC). I metodi descritti includono la dissezione della coppa posteriore oculare, la fissazione della paraformaldeide, l'incorporamento nei supporti e nell'orientamento dei tessuti della temperatura di taglio ottimale (OCT), il sezionamento e l'immunostaining.
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Articolo metodologico
Preparazione delle sezioni ricrello della retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La preparazione di sezioni oculari del topo di alta qualità per l'immunoistochimica (IHC) è fondamentale per valutare la struttura e la funzione della retina e per determinare i meccanismi alla base delle malattie retiniche. Mantenere l'integrità strutturale durante la preparazione dei tessuti è fondamentale per ottenere dati IHC retinici riproducibili, ma può essere difficile a causa della fragilità e della complessità della citoarchitettura retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare in modo ottimale la struttura della retina, spesso impediscono l'analisi IHC migliorando la fluorescenza di fondo e/ o diminuendo le interazioni anticorpo-epitope, un processo noto come mascheramento epitopiano. I fissativi più lievi, d'altra parte, come il 4% di paraformaldeide, riduce la fluorescenza di fondo e la mascheratura epitope, devono essere utilizzate tecniche di dissezione meticolose per preservare la struttura retinica. In questo articolo, presentiamo un metodo completo per preparare tazze posteriori oculari del topo per IHC che è sufficiente per preservare la maggior parte delle interazioni anticorpo-epitopo senza perdita di integrità strutturale retinica. Includiamo l'IHC rappresentativo con anticorpi a vari marcatori di tipo cellule retiniche per illustrare la conservazione e l'orientamento dei tessuti in condizioni ottimali e non ottimali. Il nostro obiettivo è ottimizzare gli studi IHC della retina fornendo un protocollo completo dalla dissezione della tazza posteriore oculare all'IHC.
Introduzione
L'immunohistochimica (IHC) è una potente tecnica per localizzare specifiche proteine e strutture cellulari nei tessuti in situ1,2,3. Metodi di fissazione inappropriati e sezionamento non ottimale di tessuti complessi possono interrompere la struttura del tessuto, generare un'elevata colorazione di fondo o diminuire le interazioni anticorpo-epitopo, con conseguente colorazione artefatti e conseguente interpretazione errata di Dati IHC4. Poiché la retina vertebrata è un organo neurale complesso e altamente organizzato composto da strati di fotorecettori ....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati realizzati in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida nazionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio fornite dall'Istituto di risorse animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.
Tutti gli strumenti e le attrezzature per i metodi sono illustrati nella Figura 1 ed elencati nella tabella dei materiali.
1 . Enucleazione dell'occhio del mouse, dissezione della coppa per gli occhi e incorporamento
- Top....
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Risultati
Per illustrare come questi protocolli, garantire la conservazione ottimale della retina per IHC, abbiamo sondato le sezioni retiniche da topi P28 WT (C57BL/6N) con anticorpi a rodopsina (un marcatore fotorecettore)8, acido glutammico decarboxylase 65 (Gad65, una cellula amacina marcatore)9, sintetasi di glutammina (GS, un marcatore di cellule M-ller)10e calbindin (un marcatore di cella orizzontale)11.......
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Discussione
La dissezione della retina del topo è un processo delicato a causa delle piccole dimensioni e della forma degli occhi del topo e della fragilità del tessuto retinica. Anche se eseguire dissezione di alta qualità è una questione di pratica, avere un protocollo dettagliato, fornire metodi e suggerimenti efficienti è una necessità per ottenere sezioni retiniche e IHC. Oltre ai protocolli descritti qui, ci sono diversi suggerimenti che consentono sezioni retiniche coerenti di alta qualità che sono adatti per IHC riproducibil.......
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Dichiarazioni
Nessuna divulgazione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del NIH (RO1-GMO97327) e della University Research Foundation (UPenn). Ringraziamo in particolare Svetlana Savina per il suo aiuto nello sviluppo del protocollo di immunohistochimica, Gordon Ruthel (Università della Pennsylvania) e Penn Vet Imaging Core per l'assistenza con la microscopia e Leslie King, Ph.D. per la lettura critica di questo manoscritto .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bicchiere in acciaio inossidabile da 6 qt (185 x 218 mm) | Gilson | #MA-48 | Per azoto liquido (Figura 1E) |
| Foglio di alluminio | |||
| Cauterizzatore | Bovie | #AA01 | Per contrassegnare l'orientamento degli occhi (Figura 1A) |
| Pinze curve, pinzette Dumont #5/45, piegate a 45 gradi | Scienze della microscopia elettronica | #72703-D | Per l'enucleazione e la manutenzione dell'occhio del topo (Figura 1A) |
| Forbici curve, forbici a molla Vannas - Tagliente da 2,5 mm | Strumenti di Fine Science | #15002-08 | Per tagliare circonferenzialmente la cornea (Figura 1B) |
| Piatto | Per la dissezione della coppa oculare (Figura 1C) | ||
| Microscopio da dissezione | Leica, Houston, Stati Uniti | MZ12.5 Micro coltelli per stereomicroscopio | |
| - manico in plastica | Strumenti di Fine Science | #10315-12 | Per fare una piccola incisione in corrispondenza del segno di bruciatura (Figura 1A) |
| Cera dentale rosa | Scienze della microscopia elettronica | #72660 | Per il rivestimento del piatto di dissezione |
| Rack per vetrini e piastra di copertura | Ted Pella | #36107 | Per IHC retinico (Figura 1G) |
| Bicchiere in acciaio inossidabile (89 x 114 mm) | Gilson | #MA-40 | Per bagno di isopentano (Figura 1E) |
| polistirolo | Per dispositivo di raffreddamento isolato | ||
| Pinze sottili Dumont #5 | Strumenti di Fine Science | #11254-20 | Per rimuovere la cornea ed estrarre la lente (Figura 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Scienze della miscroscopia elettronica | #62534-10 | Stampo per OCT embedding |
| Tamponi e reagenti | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Soluzione bloccante | 2% siero di cavallo normale, 1,5% gelatina per pelle di pesce freddo (al 40-50% in H2O, #G7765 di gatto), albumina sierica bovina al 5% (cat #AK1391-0100) in tampone di permeabilizzazione. | ||
| Gelvatol (mezzi di montaggio anti-sbiadimento) | Sotto la cappa aspirante, sciogliere 0,337 g di DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10 ml di Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Regolare a pH 8-8,5 con 12N HCl (~ 5 gocce). Conservare in bottiglia a goccia ambrata a 4 gradi C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquotare e conservare al buio, a 4 gradi C per un massimo di 1 anno o a -20 gradi C per la conservazione a lungo termine. Preparare fresco a 1 ug/mL (1x) |
| Isopentano, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Azoto liquido | |||
| paraformaldeide (PFA) nelle scienze della | microscopia elettronica PBS | #15710 | Preparato fresco al 4% di PFA da stock di PFA al 16%. Conservare il restante 16% di PFA a 4 gradi C nel buio. |
| di permeabilizzazione | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Preparare fresco. | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4. Preparato da 10 brodi |
| Soluzioni di saccarosio | Fisher Scientific | #S-5-500 | Sciogliere la quantità appropriata di saccarosio in 37° C PBS (impiega ~15 minuti per dissolversi). Può essere conservato per alcuni giorni a 4 gradi C. |
| Tessuto-Tek OCT-composto | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Numero di catalogo | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Per marcare le cellule horinzotali |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Per marcare le cellule amacrine GABAergiche |
| anti-GS | BD Trasduzione | 610517 | Per etichettare Mü ller cells |
| anti-rodopsina | Millipore | MAB5316 | Per etichettare le aste |
Riferimenti
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
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Ristampe e permessi
