Articolo metodologico

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

DOI:

10.3791/59690

⸱

11 luglio 2019

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il morbo di Parkinson (PD) è causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nel mesencephalon ventrale (VM). La terapia sostitutiva cellulare promette molto per il trattamento della PD. Recentemente, le cellule staminali neurali indotte (iNSC) sono emerse come potenziale candidato per la terapia sostitutiva cellulare a causa del ridotto rischio di formazione del tumore e della plasticità di dare origine a neuroni e glia specifici della regione. Gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari somatiche autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule. Rispetto ad altri tipi di celle somatiche, i PBMCC sono un tipo di cellula di partenza accattivante a causa della facilità di accesso ed espansione nella coltura. Il virus Sendai (SeV), un virus RNA non integrativo, che codifica i fattori di riprogrammazione tra cui l'uomo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC, ha un genoma a senso negativo, a filamento singolo e non segmentato che non si integra genoma ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione. In questo studio viene descritto un protocollo in cui gli iNSC vengono ottenuti riprogrammando i PBMCNC, e differenziati in neuroni VM DA specializzati con un metodo a due stadi. Poi i precursori DA vengono trapiantati in modelli murini PD a 6-hyroxydopamina (6-OHDA) per valutare la sicurezza e l'efficacia per il trattamento della PD. Questo metodo fornisce una piattaforma per studiare le funzioni e gli effetti terapeutici delle cellule neurali DA specifiche del paziente in vitro e in vivo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo comune, causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nella mesincephalon ventrale (VM), con una prevalenza di oltre l'1% della popolazione sopra i 60 anni di età 1 : il nome del , 2. Nell'ultimo decennio, la terapia cellulare, volta a sostituire le cellule degenerative o danneggiate, o a nutrire il microambiente intorno ai neuroni degeneranti, ha mostrato un potenziale nel trattamento della PD3. Nel frattempo, la tecnologia di riprogrammazione ha fatto progressi significativi4, che fornisce una fonte cellulare promettente per la terapia sostitutiva. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) e le cellule staminali embrionali (ESC) hanno dimostrato di essere in grado di differenziarsi nelle cellule neurali DA, che potrebbero sopravvivere, maturarsi e migliorare le funzioni motorie quando innestate nei modelli di PD di ratti e primati non umani5 ,6,7,8. Gli iPSC rappresentano una pietra miliare nelle tecnologie di riprogrammazione cellulare e hanno un grande potenziale nel trapianto di cellule; tuttavia, c'è ancora una preoccupazione circa il rischio di formazione del tumore dalle cellule incompletamente differenziate. Una fonte cellulare alternativa per il trapianto di cellule è costituita da cellule staminali adulte impegnate nel lignaggio ottenute attraverso la riprogrammazione diretta, come le cellule staminali neurali indotte (iNSC), che possono essere derivate dagli intermedi instabili, bypassando la pluripotenza fase9,10,11.

Sia gli iPSC che gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule12,13,14, riducendo così la immunogenicità delle cellule trapiantate in gran parte. Inoltre, rispetto agli iPSC, gli iNSC sono intrinseci con ridotto rischio di formazione del tumore e plasticità impegnata nel lignaggio, solo in grado di differenziarsi in neuroni e glia11. Negli studi iniziali, iPSC umani o topi e iNSC sono stati generati da fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee, che è una procedura invasiva14,15. A questo proposito, i PBMNC Sono una fonte di cellule di partenza attraente a causa del processo di campionamento meno invasivo e della facilità di ottenere un gran numero di cellule entro un breve periodo di tempo di espansione16. Gli studi iniziali di riprogrammazione hanno impiegato sistemi di erogazione integrativi, come vettori lentivirali o retrovirali, che sono efficienti e facili da implementare in molti tipi di cellule17; tuttavia, questi sistemi di somministrazione possono causare mutazioni e riattivazione di transgeni residui, che presentano problemi di sicurezza per scopi terapeutici clinici12. Il virus Sendai (SeV) è un virus RNA non integrativo con un genoma a singolo filamento negativo che non si integra nel genoma dell'ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione18 ,19. Sono disponibili vettori SeV ricombinanti che contengono fattori di riprogrammazione, tra cui l'oggetto OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC nei frame di lettura aperti. Inoltre, i vettori virali SeV possono essere ulteriormente migliorati introducendo mutazioni sensibili alla temperatura, inmodo che possano essere rapidamente rimossi quando la temperatura di coltura viene aumentata a 39 . In questo articolo viene descritto un protocollo per riprogrammare i PBMNN in iNSC utilizzando il sistema SeV.

Molti studi hanno riportato la derivazione di neuroni DA da ESC umani o iPSC utilizzando vari metodi6,8,21. Tuttavia, c'è una carenza di protocolli che descrivono la differenziazione dei neuroni DA da iNSC nei dettagli. In questo protocollo, descriveremo la generazione efficiente di neuroni DA da iNSC utilizzando un metodo a due stadi. I precursori neuronali DA possono essere trapiantati nello striato dei modelli murini della PD per le valutazioni di sicurezza ed efficacia. Questo articolo presenterà un protocollo dettagliato che copre varie fasi dalla generazione di cellule staminali neurali indotte dal virus Sendai, la differenziazione di iNSC in neuroni DA, la creazione di modelli di PD murino, al trapianto di precursori DA nello striato dei modelli PD. Utilizzando questo protocollo, si possono generare iNSC da pazienti e donatori sani e derivare neuroni DA sicuri, standardizzati, scalabili e omogenei ai fini del trapianto di cellule, o per la modellazione della PD in un piatto e lo studio dei meccanismi l'insorgenza e lo sviluppo della malattia sottostante.

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Protocollo

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Tutte le procedure devono seguire le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Il consenso informato deve essere ottenuto da pazienti o volontari sani prima della raccolta del sangue. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell'istituzione ed è stato eseguito secondo le linee guida dell'istituzione per la cura e l'uso degli animali.

1. Raccolta, isolamento ed espansione di PBMNC

  1. Raccolta di PBMNC
    1. Raccogli 10-20 mL di sangue velenoso periferico del donatore con venipuncture con una fiala conservante di eparina di sodio.
      NOTA: I campioni di sangue devono essere conservati o spediti a temperatura ambiente (RT). Elaborare i campioni di sangue entro 24 ore.
  2. Preparazione del mezzo culturale
    1. Preparare il seme senza siero (SFM) combinando i seguenti componenti: 245 mL del mezzo di Dulbecco (IMDM) modificato di Iscove (IMDM), 240 mL di F-12 di Ham, 5 mL di supplemento insulino-trasferiscibile-X (ITS-X), 5 mL di 100x soluzione di broamina di glutamina (Tabella di Materiali), 5 mL di concentrato lipidico definito chimicamente, 2,5 g di siero bovino fetale, 0,025 g di acido ascorbico e 9 -L di 1-thiolicerolo. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
      AVVISO: L'acido ascorbico e il 1-thiolicerolo sono tossici per contatto con la pelle e per inalazione.
    2. Per preparare il mezzo a cellule mononucleari (MNC), integrare il mezzo SFM con 10 ng/mL di interleuchina umana pari a 3 (IL-3), 2 U/mL erythropoietin (EPO), 100 ng/mL fattore di cellule staminali umane (SCF), 40 ng/mL fattore di crescita umano simile all'insulina 1 (IGF-1), 100 M dexamethasone. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Preparare il supporto immediatamente prima dell'uso.
  3. Isolamento dei PBMNC
    1. Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un'autoclave.
    2. Trasferire il sangue periferico (PB) in un tubo conico da 50 mL e diluire il PB con un volume uguale di salina (D-PBS) di Dulbecco.
    3. Preparare 15 mL di gradiente di densità sterilizzato medio (Tabelle dei materiali) in un altro tubo conico da 50 mL.
      NOTA: mantenere il gradiente di densità medio e PB a RT per consentire un migliore isolamento dei PBMNC.
    4. Inclinare il tubo conico contenente il mezzo di pendenza di densità con un angolo di 45 gradi, quindi posare lentamente e con cura 30 mL di PB diluito sul mezzo di pendenza di densità.
      NOTA: fare attenzione e lasciare che il PB scorra lentamente lungo il lato del tubo conico sul livello medio del gradiente di densità. I globuli rossi si depositano sul fondo del tubo. Inclinare il tubo con attenzione per ridurre al minimo l'interruzione dell'interfaccia del livello.
    5. Centrifugare i tubi a 800 x g per 15 min a RT con il freno centrifuga impostato in posizione "off". Aspirare lo strato di plasma superiore giallo e scartato. Quindi trasferire lo strato di pellicola sottile torbida bianca contenente MNC con una pipetta da 10 mL in un nuovo tubo conico da 50 mL.
      NOTA: lo spegnimento del freno di centrifuga è importante per l'isolamento degli MNC.
    6. Aggiungere 30 mL di D-PBS al tubo con MNC e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante, quindi aggiungere 45 mL di D-PBS per sospendere nuovamente le celle. Centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Il freno centrifuga deve essere acceso per questo e le seguenti fasi di centrifugazione. Poiché i pellet cellulari sono densi, aggiungere 1-2 mL di D-PBS per sospendere delicatamente i pellet, quindi aggiungere D-PBS a 45 mL.
    7. Eliminare il supernatante e sospendere nuovamente le celle con 5 mL di D-PBS e contare le celle vive con il metodo di esclusione blu trypan.
    8. Dopo aver messo da parte gli MNC necessari per l'espansione, congelare le celle rimanenti per un uso futuro.
      NOTA: almeno 5 x 106 MNC possono essere congelati in una fiala con 1 mL di mezzo di congelamento (Tabella dei materiali). Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  4. Espansione delle MNC
    1. Il giorno -14, semina mNC ad una densità di 2-3 x 106 celle per millili, in un pozzo di sei pozzetti con 1,5 mL di mezzo MNC preriscaldato (37 gradi centigradi). Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 2 giorni.
    2. Il giorno -11, raccogliere le cellule e il mezzo con una pipetta sterilizzata e trasferirli in un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifugare le cellule a 250 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in 1 mL di preriscaldato (37 s) mezzo MNC.
    3. Contare le cellule vitali con trypan blu. Semina le MNC ad una densità di 1 x 106 cellule per millilivolante in mezzo MNC preriscaldato e incuba a 37 c, 5% di CO2 per 3 giorni.
      NOTA: Si prevede che il numero totale di celle possa diminuire il giorno -11.
    4. Il giorno -8 ripetere i passaggi da 1.4.2-1.4.3 e fare la coltura delle celle per 3 giorni.
    5. Il giorno -4 ripetere i passaggi da 1.4.2-1.4.3 e fare la coltura delle celle per 3 giorni.
      NOTA: dopo 14 giorni di cultura, un numero uguale o maggiore di MNC deve rimanere nella coltura.

2. Riprogrammazione di PBMNC a iNSC mediante infezione SeV

  1. Preparazione della soluzione e del mezzo di coltura
    1. Preparare una soluzione di riserva polid-lysina (PDL) sciogliendo 100 mg di PDL con 100 mL di H2O a una concentrazione di 1 mg/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in 1 mL aliquote.
    2. Preparare una soluzione di stock di insulina sciogliendo 100 mg di insulina in 20 mL di 0,01 N HCl a una concentrazione di 5 mg/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in 1 mL aliquote.
    3. Per preparare 200 mL di iNSC basal medium, combinare 96 mL di DMEM-F12 e 96 mL di mezzo di base (Tabella dei materiali) con 2 mL di 100x soluzione stock di glutammina, 2 mL di aminoacido non essenziale (NEAA), 2 mL di supplemento N2 e 2 mL di supplemento B27. Aggiungere 10 ng/mL fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, 3 -M CHIR99021 e 2 SB431542 prima dell'uso. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
      NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane. Aggiungere immediatamente prima l'uso del fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, CHIR99021 e SB431542.
  2. Riprogrammazione di PBMNC a iNSC da parte dell'infezione SeV
    1. Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un autoclave.
    2. Il giorno 0, raccogliere le celle nel mezzo MNC e trasferire in un tubo conico 15 mL. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Aspirate the supernatant e ri-sospendere le cellule con 1 mL di mezzo MNC preriscaldato.
    3. Contare le cellule vitali con trypan blu. Sospendere nuovamente le cellule con un mezzo MNC preriscaldato (37 gradi centigradi) a una concentrazione di 2 x 105 cellule per pozzo in piastre di 24 pozzetti.
    4. Dopo aver rimosso i tubi SeV dallo stoccaggio di -80 gradi centigradi, scongelare i tubi contenenti SeV in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5-10 s, quindi lasciarli scongelare a RT. Una volta scongelato, metteteli immediatamente sul ghiaccio.
    5. Aggiungere la codifica SeV umana Klf4, Oct3/4, SOX2 e c-MyC ai pozzi, ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Centrifugare le cellule con piastre a 1.000 x g per 30 min per facilitare l'attaccamento delle cellule. Lasciare le cellule e supernatali nelle piastre. Collocare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      AVVISO: Tutte le procedure che coinvolgono SeV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza e tutte le punte e i tubi devono essere trattati con etanolo o candeggina prima dello smaltimento.
    6. Il primo giorno, trasferire il mezzo e le cellule in un tubo di centrifuga di 15 mL. Sciacquare il pozzo con 1 mL di mezzo MNC. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Aspirate the supernatant e ri-sospendere le cellule con 500 .L di mezzo MNC preriscaldato fresco in piastre 24-well.
      NOTA: Utilizzare una piastra a basso fissaggio 24-po ' per evitare l'attacco di tutte le cellule prima della placcatura su PDL / lamina.
    7. Il giorno 2 diluire 1 mL di 1 mg/mL PDL con 19 mL di D-PBS a una concentrazione di 50 g/mL. Cappotto 6 lastre con 50 g/mL PDL per almeno 2 h a RT.
    8. Diluire 200 ll di 0,5 mg/mL di laminina con 20 mL di D-PBS a una concentrazione di 5 g/mL. Aspirate PDL nelle piastre a 6 pozzi, e asciugare sul banco verticale pulito.
    9. Cappotto 6 lastre con 5 g/mL di laminina e incubare per 4-6 h a 37 gradi centigradi. Lavare con D-PBS prima dell'uso.
    10. Il giorno 3, piastrare le cellule trasdotte ottenute al passo 2.2.6 in mezzo iNSC su piastre a 6 velo rivestite di PDL/lamininin.
      NOTA: Spostare delicatamente le piastre se necessario dopo che le cellule sono state posizionate su piastre rivestite di PDL / laminani, cercando di non disturbare l'attaccamento delle cellule.
    11. Il giorno 5, aggiungere 1 mL di mezzo preriscaldato (37 gradi centigradi) in ogni pozzo in 6 piatti delicatamente.
      NOTA: Si prevede che le cellule subiranno una morte drastica (>60%).
    12. Il giorno 7, aggiungere 1 mL di mezzo preriscaldato (37 gradi centigradi) in ogni pozzo in 6 piatti delicatamente.
    13. Dal giorno 9 al giorno 28, sostituire mezzo trascorso con fresco preriscaldato (37 gradi centigradi) mezzo iNSC ogni giorno. Monitorare l'emergere delle colonie iNSC. Scegli e trasferisci i cloni iNSC per l'espansione in circa 2-3 settimane. Raccogliere colonie con morfologia appropriata utilizzando pipette di vetro bruciate, escludendo eventuali cellule contaminanti, e aspirare le colonie con 200 punte.
      NOTA: Gli iNSC caratterizzati possono essere congelati per un uso futuro con 2-5 colonie in una fiala. Il mezzo di congelamento comprende il mezzo basale senza siero (Tabella dei materiali) e il basaforno dimetilo miscelato ad un rapporto di 9:1, che deve essere preparato immediatamente prima dell'uso. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Differenziazione degli iNSC ai neuroni dopaminergici

  1. Preparazione della soluzione e del mezzo di coltura
    1. Preparare 200 mL di iNSC differenziazione basale medium combinando 192 mL di DMEM-F12 con 2 mL di 100x soluzione stock di glutamina, 2 mL di NEAA, 2 mL di supplemento N2 e 2 mL di supplemento B27.
      NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane.
    2. Preparare il supporto I della fase di differenziazione iNSC integrando il supporto basale di differenziazione iNSC con 1 -M SAG1 e 100 ng /mL FGF8b.
      NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane.
    3. Preparare il mezzo iNSC dedere lo stadio di differenziazione iNSC II medio integrando il mezzo basale di differenziazione iNSC con 0,5 mm di adenosina ciclica monofosfata (cAMP), 0,2 mM di acido ascorbico, 10M DAPT, 10 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF), 10 ng/mL derivato gliale fattore neutrofico (GDNF) e 1 ng/mL che trasforma il fattore di crescita di ZIII (TGF-III).
      NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane.
  2. Rivestimento dei piatti della cultura
    1. Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un autoclave.
    2. Per il rivestimento PDL, almeno un giorno prima di ri-placcare le cellule, diluire 1 mL di 1 mg/mL PDL con 19 mL di D-PBS ad una concentrazione di 50 g/mL. Coat 12 mm vetro coprelabbra che sono stati sterilizzati con 75% di alcool nelle piastre 24-pozzo con 50 g /mL PDL a RT per almeno 2 h.
    3. Per il rivestimento di lamino, diluire 200 - L di 0,5 mg/mL di laminina con 20 mL di D-PBS a una concentrazione di 5 g/mL. Aspirate PDL e asciugare i pozzi nella panca pulita. Rivestire i copricapi da 12 mm con 5 laminina da 12 g/mL e incubare per 4-6 h a 37 gradi centigradi. Lavare con D-PBS prima dell'uso.
  3. Celle di passaggio per differenziazione.
    1. Quando la confluenza di iNSC coltivati raggiunge il 70-90%, aspira il mezzo dalla piastra di coltura e aggiunge 1 mL di D-PBS per lavare le cellule. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare preriscaldato (37 gradi centigradi) (Tabella dei materiali) per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 3 min per dissociare le cellule.
    2. Dopo l'incubazione per 3 min, le cellule sono diventate semi-galleggianti; aggiungere 3 mL di preriscaldato (37 gradi centigradi) di DMEM-F12 medio per pozzo, e le cellule pipette su e giù per dissociare i pellet cellulari in singole cellule.
    3. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL, e centrifugare a 250 x g per 3 min. Aspirate the supernatant, ri-sospendere le cellule con il volume appropriato di preriscaldato (37 c) iNSC medio in base al numero di cellule.
    4. Contare le celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Piastra 5 x 103 celle per coprivele di vetro da 12 mm in piastre a 24 piani e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
  4. Differenziare iNSC in neuroni dopaminergici.
    1. Iniziare la differenziazione 24 h dopo aver ri-placcato le cellule su copritrici rivestite di PDL / laminina. Aspirare il mezzo di coltura, lavare le cellule una volta con D-PBS, quindi aggiungere 600 l di fase di differenziazione preriscaldata I medio per bene in piastre 24 pozzetti e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    2. Cambia media ogni giorno dal giorno 1 al giorno 10 durante la prima fase di differenziazione.
    3. Il giorno 10, aspirare il mezzo di coltura, e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungete 600 l di fase di differenziazione preriscaldata (37 gradi centigradi) medio II per pozzo in piastre di 24 pozzetti e incubate a 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
    4. Cambiare media a giorni alterni dal giorno 11 al giorno 25 durante la seconda fase di differenziazione. Le cellule differenziate possono essere fissate da paraformaldeide in diversi momenti di analisi.
    5. Per la colorazione immunofluorescente, lavare le cellule con D-PBS tre volte delicatamente nei punti temporali scelti entro il giorno di differenziazione 11-25.
    6. Pipette 300 - L di surfactant nonionico (Tabella dei materiali) in 100 mL di PBS per fare un surfactant nonionico dello 0,3% in PBS.
      INFORMATIVA: Il surfactant non ionico è tossico per contatto con la pelle e per inalazione.
    7. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide per 10 min a RT. Quindi lavare con lo 0,3% in PBS tre volte.
      AVVISO: la paraformaldeide è tossica per contatto con la pelle e inalazione.
    8. Bloccare le cellule del 3% di siero d'asino per 2 h a RT.
    9. Diluire l'anticorpo primario in 1% siero d'asino ad una concentrazione appropriata e triturare delicatamente per mescolare. Aggiungere 300 l della soluzione anticorpale primaria ad ogni pozzo della piastra di 24 pozze. Incubare le cellule a 4 gradi centigradi durante la notte. Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte.
    10. Diluire l'anticorpo secondario in 1% siero d'asino ad una concentrazione appropriata e triturare delicatamente per mescolare. Aggiungere 300 l della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzetto della piastra di 24 pozze. Incubare le cellule a RT per 2 h, protetto dalla luce.
    11. Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte. Diluito 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) con PBS con 1:500 diluizione. Incubare le cellule in ogni pozzetto della piastra di 24 pozze con 300 l di DAPI diluito per 15 min a RT, protetto dalla luce. Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte.
    12. Estrarre delicatamente i coperchi dai pozzetti delle piastre con pinze. Asciugare al buio durante la notte al Monto RT. al microscopio a fluorescenza.

4. Istituzione di modelli murini unilaterali da 6-hyroxydopamina (6-OHDA)

  1. Per generare modelli murini PD per il trapianto di cellule, utilizzare topi maschi adulti SCID-beige del peso di 20-25 g per l'iniezione di 6-OHDA.
  2. Preparazione di farmaci per la chirurgia
    1. Preparare una soluzione di acido ascorbico dello 0,2% sciogliendo 0,2 g di acido ascorbico in 100 mL di salina sterilizzata (0,9%) e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso. Il giorno dell'intervento, diluire la soluzione dell'acido ascorbico dello 0,2% di 10 volte per ottenere una soluzione di acido ascorbico dello 0,02%.
      NOTA: Viene aggiunto acido ascorbico per prevenire l'ossidazione di 6-OHDA a una forma inattiva.
    2. Per preparare una soluzione 6-OHDA, pesare la quantità appropriata di 6-OHDA in un tubo sterilizzato da 1 mL, quindi aggiungere un po' di volume di acido ascorbico dello 0,02% per creare una soluzione a 5 g/L 6-OHDA. Vorticare la miscela fino a quando non è sciolto. Posizionare il 6-OHDA sul ghiaccio fino all'uso.
      NOTA: 6-OHDA è sensibile alla temperatura e alla luce. Fare attenzione a proteggere la soluzione dalla luce e tenerla sul ghiaccio prima dell'uso.
  3. Preparare l'apparecchiatura chirurgica sterilizzata autoclaving prima dell'intervento chirurgico. Pulire tutte le attrezzature e le aree di superficie con etanolo durante la configurazione del telaio stereotassico. Impostare una gabbia di recupero del mouse sotto una lampada di riscaldamento.
  4. Condurre un intervento chirurgico per stabilire modelli murini unilaterali 6-OHDA-lesioned.
    1. Pesare ogni topo, registrare il peso e calcolare la quantità di farmaco che deve essere somministrato. Ogni topo riceve 0,5 mg/kg di atropina 20 min prima delle operazioni. Anestesizzare il topo con 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilizina.
    2. Somministrare 0,5 mg/kg di atropina mediante iniezione intraperitoneale.
    3. Anestesizzare il topo con 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilografia mediante iniezione intraperitoneale 20 min dopo la somministrazione di atropina.
    4. Mettere il mouse in una camera chiusa. Dopo 3-5 min, il mouse sarà profondamente anetizzato senza risposta al pizzico della gamba posteriore.
      NOTA: Si prevede che il topo che ha ricevuto l'anestesia sperimenterebbe un periodo di eccitazione.
    5. Rasare la testa di topo e applicare erithromycin unguento occhio sugli occhi del mouse per la protezione da sviluppare ulcere corneali.
    6. Posizionare il mouse sull'apparato stereotassico. Fissare il mouse con le barre di incisivo in primo luogo. Inserire correttamente le cuffie auricolari per rendere la testa del mouse in una posizione piatta e sicura.
    7. Sterilizzare la testa del topo con iodio povidone e alcool isopropile. Tagliare un'incisione sagittale (1,5 cm) sulla pelle della testa con una lama del bisturi ed esporre il cranio. Regolare la barra di incisione e le barre dell'orecchio per ridurre la differenza di altezza tra bregma e lambda a meno di 0,1 mm.
      NOTA: Il topo bregma si trova all'intersezione di suture coronali e sagittali, e lambda si trova all'intersezione di suture lambdoid e sagittali.
    8. Spostare lentamente e abbassare la punta dell'ago verso il bregma e trattare il bregma come un punto zero. Spostare la punta in una posizione con le coordinate A/P 0,5 mm, M/L -2,1 mm rispetto al bregma. Ritirare la punta e contrassegnare il punto. Burr un piccolo buco nel cranio.
    9. Estraete nella microsiringe 2 -G/L 6-OHDA (Tabella dei materiali). Riportare l'ago al punto contrassegnato e inserire l'ago in D/V -3,2 mm.
    10. Iniettare 2 luna di 5 soluzione di 6-OHDA (10 g in totale) ad una velocità di 1 L/min. Dopo l'iniezione di 6-OHDA è completato, lasciare l'ago in posizione per altri 5 min. Quindi ritrarre lentamente l'ago di iniezione.
    11. Chiudere l'incisione con suture e applicare unguento occhio erithromycin sugli occhi del mouse. Consegnare sottocutaneamente 0,5 mL per prevenire la disidratazione e applicare un unguento antibiotico direttamente sulla pelle suturata.
    12. Rimuovere il mouse dall'apparato stereotassico e metterlo nella gabbia di recupero. Rimettere il mouse indietro e consentire l'accesso al cibo e all'acqua fino a quando non riacquista conoscenza. Trattare il mouse con analgesico in acqua potabile ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per 2-3 giorni, e un dosaggio raccomandato di Ibuprofene è 0.03 mg/g di peso corporeo al giorno.
    13. Ispezionare il mouse quotidiano post-chirurgia.

5. Valutazione comportamentale dopo 6-OHDA unilaterale

  1. Due o tre settimane dopo l'intervento chirurgico, condurre la valutazione comportamentale per stimare i sintomi della PD. Pesare ogni topo, registrare il loro peso e calcolare la quantità di farmaco che deve essere somministrato (0,5 mg/kg di apomorfina prima della valutazione).
  2. Somministrare 0,5 mg/kg di apomorfina mediante iniezione sottocutanea prima della valutazione e posizionare il mouse in un cilindro di vetro.
  3. Dopo un periodo di abitudine di 5 minuti, contare il numero di rotazioni contralaterali e ipsilaterali rispetto al lato di lesione al minuto e registrare la loro attività con una videocamera.
  4. I topi con rotazioni con controlaterale meno ipsilaterali >7 rpm/min sono considerati riscioni e selezionati con successo come candidati per esperimenti di trapianto di cellule. Riportare i topi nelle gabbie di alloggiamento dopo un riposo di 30 min.
    NOTA: Se il topo è stato lesionato con successo, 6-OHDA iniettato mouse mostrerà una maggiore distorsione nel girare verso il lato contralaterale dal momento che l'agonista DA attiva lo striato denervato supersensibile del lato lesioned prevalentemente.
  5. Condurre la valutazione comportamentale una settimana prima e 2, 4, 6, 8, 12, 16 settimane dopo il trapianto di cellule.

6. Trapianto di cellule di precursori DA

  1. Preparare la sospensione cellulare per il trapianto. Per l'innesto cellulare, sospendere 2 x 105 precursori DA miscelati dai precursori D10 e D13 DA a un rapporto di 1:7 in 4 : L di 5 g di glucosio L-1 in soluzione di sale equilibrato (Tabella dei materiali) del buffer di trapianto.
  2. Eseguire un trapianto di cellule seguendo le procedure descritte nella sezione 4.4, ad eccezione del fatto che 6-OHDA è sostituito da DA prima della sospensione cellulare o buffer.
  3. Eseguire la valutazione comportamentale 2, 4, 6, 8, 12, 16 settimane dopo il trapianto di cellule dei precursori DA seguendo le procedure descritte nella sezione 5. Contare il numero di rotazioni contralaterali indotte da apomorfina rispetto al lato di lesione al minuto e registrare la loro attività con una videocamera.
    NOTA: Dopo il trapianto, un tasso ridotto di rotazioni contralaterali suggerisce una funzione motoria migliorata.
  4. A 4, 8 ,12, e 16 settimane dopo il trapianto di cellule, perfedire il topo in anestesia profonda con 4% paraformaldeide fino a quando il corpo del topo diventa rigido e il fegato del topo diventa pallido.
  5. Separare delicatamente il cervello del topo e mettere il cervello in 4% paraformaldeide a 4 gradi centigradi durante la notte.
  6. Il secondo giorno, mettere il cervello nel 30% saccarosio per la disidratazione fino a quando il cervello affonda sul fondo.
  7. Affettare il cervello a 40 m di spessore utilizzando un microtoma di congelamento.
  8. Eseguire l'immunostaining come descritto in precedenza nei passaggi 3.4.5-3.4.12.

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Risultati

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Qui, segnaliamo un protocollo che copre le diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per il trattamento dei modelli PD. In primo luogo, i PBMNC sono stati isolati e ampliati e riprogrammati in iNSC dall'infezione da SeV. Nella figura 1è illustrata una rappresentazione schematica delle procedure con espansione PBMNC e induzione iNSC. Il giorno -14, i PBMNC sono stati isolati utilizzando un supporto di sfumatura di densità (Tabella dei materiali). Prima della centrifuga, il...

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Discussione

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Qui abbiamo presentato un protocollo che ha coperto diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per i modelli PD. Gli aspetti critici di questo protocollo includono: (1) isolamento e espansione dei PBMCNC e riprogrammazione dei PBMCNC in iNSC mediante infezione da SeV, (2) differenziazione degli iNSC ai neuroni DA, (3) creazione di modelli murini PD unilaterali 6-OHDA-lesioned e (4) il trapianto di cellule dei precursori da DA e la valutazione comportamentale.

In questo protocollo, la prima p...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA010101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 815611138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Progetto di sostegno degli insegnanti di alto livello nelle università comunali di Pechino nel periodo del tredicesimo piano quinquennale (CIT e TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Pechino Fondo della Commissione Sanitaria Comunale (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Amministrazione Municipale di Medicina Clinica degli Ospedali Sviluppo di Sostegno Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo conico da 15 mlCorning430052
1-TioglicerinaSigma-AldrichM6145Tossico per inalazione e contatto con la pelle
Piastra a 24 pozzettiCorning3337
Tubo conico da 50 ml...Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
Piastra a 6 pozzettiCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Reagente di dissociazione cellulare
ApomorfinaSigma-AldrichA4393
Acido ascorbicoSigma-AldrichA92902Tossico a contatto con la pelle 
Integratore di B27Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Fattore neurotrofico derivato dal cervello
Provette per la raccolta del sangue contenenti eparina di sodioBD367871
BSAyisheng36106es60Siero fetale
bovino cAMPSigma-AldrichD0627Dibutirriladenosina monofosfato ciclico
CellBanker 2ZENOAQ100mlUtilizzato come mezzo di congelamento per PBMNC
Concentrato lipidico chimicamente definitoInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
Vetrino coprioggettiFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DesametasoneSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Siero d'asinoJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGEritropoietina umana
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, gradiente di densità medio
GDNFPeprotech450-10Fattore neurotrofico derivato gliale
GlutaMAXInvitrogen21051024100 & Soluzione madre di glutammina
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Soluzione salina bilanciata
Fattore inibitorio della leucemia umanaMillporeLIF1010
Ricombinante umano SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGCrescita umana insulino-simile fattore 
IL-3Peprotech200-03-10UGInterleuchina umana 3
IMDMGibco215056-023Iscove modificato Dulbecco medio
InsulinaRoche
ITS-XInvitrogen51500-056Integratore di insulina-transferrina-selenio-X
Sostituzione del siero knockoutGibco10828028Terreno basale privo di siero
LamininRoche 
MicrosiringaHamilton7653-01
N2 supplemento Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Aminoacido non essenziale
NeurobasalGibco10888Mezzo basico
PDLSigma-AldrichP7280Poli-D-lisina
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mgConservare dalla luce a -20?
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
Saccarosiobaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36EFattore di crescita trasformante  β?
TransferrinaR& D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeTensioattivo non ionico
Trypan blueGibcoT10282
XilazinaSigma-AldrichX1126
1258501411243217001

Riferimenti

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