Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.
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Articolo metodologico
Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nostro laboratorio e molti altri hanno sfruttato l'alto potere risolutivo della microscopia elettronica di trasmissione per studiare la morfologia e l'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche. Al fine di ottenere micrografi elettronici di alta qualità che possono produrre il grado di dettaglio morfologico necessario per l'analisi quantitativa della distribuzione della vescicola pre-sinaptica, la preparazione ottimale dei campioni è critica. La fissazione chimica è il primo passo nel processo di preparazione del provino, e della massima importanza per preservare l'ultrastruttura fine. La fissazione vascolare con una soluzione di glutaraldeide-formaldeide, seguita dal trattamento di esemplari sezionati con vibratoma con tetroxide di osmio, stabilizza il numero massimo di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traduce in una conservazione superiore di ultrastruttura. Il tessuto viene quindi elaborato con controcolorazione, disidratazione sequenziale e resina-incorporamento. La colorazione in blocco con l'acetato di uranile (cioè la colorazione del tessuto vibratoma-sezionato prima dell'incorporamento della resina) migliora il contrasto endogeno e stabilizza i componenti cellulari contro l'estrazione durante la lavorazione del campione. Il contrasto può essere ulteriormente aumentato applicando l'acetato di uranile come post-macchia su sezioni ultrasottile. La doppia colorazione delle sezioni ultrasottile con citrato di piombo dopo il trattamento con acetato di uranile migliora anche la risoluzione dell'immagine, intensificando l'opacità dell'elettrone delle strutture contenenti acido nucleico attraverso il legame selettivo del piombo all'acetato di uranile. La microscopia elettronica di trasmissione è un potente strumento per la caratterizzazione dei dettagli morfologici delle vescicole sinaptiche e la quantificazione delle loro dimensioni e organizzazione spaziale nel bouton terminale. Tuttavia, poiché utilizza il tessuto fisso, la microscopia elettronica di trasmissione può fornire solo informazioni indirette sui processi viventi o in evoluzione. Pertanto, altre tecniche dovrebbero essere prese in considerazione quando l'obiettivo principale è quello di studiare aspetti dinamici o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche ed esocitosi.
Introduzione
Descriviamo i metodi per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici di alta qualità per l'analisi morfolometrica approfondita della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica ai terminali nervosi1,2. I micrografi ad alto contrasto che possono essere ottenuti elaborando campioni seguendo questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia dettagliata di un certo numero di componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali3,4.
Il microsc....
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Protocollo
Tutti gli studi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Virginia (Charlottesville, VA) e condotti in conformità con le linee guida degli istituti nazionali di sanità.
1. fissazione per perfusione vascolare
Nota: Una descrizione generale del metodo per la perfusione vascolare del cervello del ratto è stata già dettagliata in questa rivista13 ed è oltre l'ambito di questo protocollo. Tuttavia, i seguenti passaggi sono specifici per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi....
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Risultati
Sono stati stabiliti criteri generali che sono per lo più accettati come indicativi di una conservazione soddisfacente o difettosa del campione per TEM. Questi criteri sono esemplificati in quattro micrografi elettronici selezionati (due esempi di preparazione ottimale, due esempi di preparazione difettosa) che sono stati ottenuti trattando il tessuto cerebrale del ratto giovane seguendo i metodi descritti in questo protocollo.
In generale, un Micrografo elettronico di buona qualità appare com.......
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Discussione
La manipolazione delle sezioni tissutali durante la preparazione del campione per TEM richiede un notevole grado di finezza, concentrazione e pazienza. Quando si utilizza una micropipetta per aggiungere e rimuovere soluzioni, i campioni possono essere aspirati nella punta della pipetta dalla tensione superficiale, pertanto è necessario prestare molta attenzione per evitare danni ai tessuti da parte della pipetta. Inoltre, alcuni passaggi della sequenza di disidratazione possono essere rapidi come 1 min, quindi l'operator.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo manoscritto è stato supportato da NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) e dai fondi del dipartimento di anestesiologia presso l'Università della Virginia. Gli autori desiderano ringraziare Alev Erisir (dipartimento di biologia, Università della Virginia, Charlottesville, VA) per un'eccellente formazione e assistenza tecnica con TEM, e per la sua preziosa critica manoscritta. Gli autori ringraziano inoltre la struttura avanzata di microscopia elettronica presso l'Università della Virginia per l'assistenza tecnica con sezionamento e post-colorazione dei campioni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% tetrossido di osmio | Scienze della microscopia elettronica | 19170 | acquoso |
| 50% glutaraldeide | Scienze della microscopia elettronica | 16310 | grado EM, acquoso |
| Aclar 33 C film di inclusione | Scienze della microscopia elettronica | 50425-25 | 7,8 mil di spessore, dimensioni 8 "x10" |
| BEEM porta capsula | Scienze della microscopia elettronica | 69916 | Formato "00" |
| Capsule di inclusione BEEM Microscopia | elettronica | Scienze 70021 | "misura 00, piatto (fondo tagliato)" |
| Trimmer per blocchi Butler | Microscopia elettronica | Scienze 69945-01 | |
| Pennello per capelli di cammello | Microscopia elettronica | Scienze 65576-01 | |
| Perforatore a disco | Microscopia elettronica Scienze | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Scienze della microscopia elettronica | 14120 | |
| Microscopia elettronica | dell'acetato di piombo | Scienze 17600 | |
| Microscopia elettronica | del citrato di piombo | Scienze 17800 | |
| Microscopia elettronica del nitrato di piombo | Scienze 17900 | Microtomo | |
| ultracut Leica UC7 | Leica | ||
| Micro scala | Scienze della microscopia elettronica | 62091-23 | |
| Scienze della microscopia elettronica | paraformaldeide | 19208 | di precisione granulare di grado EM |
| Thelco Thelco | 51221159 | ||
| Sodio azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Microscopia elettronica | Scienze 72109-01 | |
| Tyrode | Scienze della microscopia elettronica | 11760-05 | |
| Acetato di uranile | Scienze della microscopia elettronica | 22400 | polvere |
Riferimenti
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
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Ristampe e permessi
