Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Taylor McFadden; Rishi  K. Devulapalli; Timothy J. Jarome

doi:10.3791/59695

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Articolo metodologico

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

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DOI:

10.3791/59695

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21 maggio 2019

Taylor McFadden¹ , Rishi K. Devulapalli² , Timothy J. Jarome¹^,²

¹Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, ²School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Abstract

Il sistema ubiquitina-proteasoma è un regolatore chiave della degradazione delle proteine e una varietà di altri processi cellulari negli eucarioti. Nel cervello, gli aumenti dell'attività onniquitina-proteasomico sono fondamentali per la plasticità sinaptica e la formazione della memoria e i cambiamenti aberranti in questo sistema sono associati a una varietà di disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici. Uno dei problemi nello studio del funzionamento dell'ubiquitina-proteasoma nel cervello è che è presente in tutti i compartimenti cellulari, in cui i bersagli proteici, il ruolo funzionale e i meccanismi di regolazione possono variare ampiamente. Di conseguenza, la capacità di confrontare direttamente il targeting delle proteine dell'ubiquitina cerebrale e l'attività catalitica proteasosa in diversi compartimenti subcellulari all'interno dello stesso animale è fondamentale per comprendere appieno come l'UPS contribuisce alla plasticità sinaptica, memoria e malattia. Il metodo qui descritto consente la raccolta di frazioni sinaptiche nucleari, citoplasmatiche e grezze dallo stesso cervello di roditore (ratto), seguite dalla quantificazione simultanea dell'attività catalitica proteasome (indirettamente, fornendo attività del nucleo proteasome solo) e l'etichettatura della proteina ubiquitina specifica del collegamento. Così, il metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente i cambiamenti subcellulari nell'attività ubiquitina-proteasomesome in diverse regioni del cervello nello stesso animale durante plasticità sinaptica, formazione della memoria e diversi stati di malattia. Questo metodo può essere utilizzato anche per valutare la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.

Introduzione

Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule¹. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell'ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina². Alcuni di questi tag di pol....