Articolo metodologico

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

DOI:

10.3791/59695

⸱

21 maggio 2019

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Abstract

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Il sistema ubiquitina-proteasoma è un regolatore chiave della degradazione delle proteine e una varietà di altri processi cellulari negli eucarioti. Nel cervello, gli aumenti dell'attività onniquitina-proteasomico sono fondamentali per la plasticità sinaptica e la formazione della memoria e i cambiamenti aberranti in questo sistema sono associati a una varietà di disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici. Uno dei problemi nello studio del funzionamento dell'ubiquitina-proteasoma nel cervello è che è presente in tutti i compartimenti cellulari, in cui i bersagli proteici, il ruolo funzionale e i meccanismi di regolazione possono variare ampiamente. Di conseguenza, la capacità di confrontare direttamente il targeting delle proteine dell'ubiquitina cerebrale e l'attività catalitica proteasosa in diversi compartimenti subcellulari all'interno dello stesso animale è fondamentale per comprendere appieno come l'UPS contribuisce alla plasticità sinaptica, memoria e malattia. Il metodo qui descritto consente la raccolta di frazioni sinaptiche nucleari, citoplasmatiche e grezze dallo stesso cervello di roditore (ratto), seguite dalla quantificazione simultanea dell'attività catalitica proteasome (indirettamente, fornendo attività del nucleo proteasome solo) e l'etichettatura della proteina ubiquitina specifica del collegamento. Così, il metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente i cambiamenti subcellulari nell'attività ubiquitina-proteasomesome in diverse regioni del cervello nello stesso animale durante plasticità sinaptica, formazione della memoria e diversi stati di malattia. Questo metodo può essere utilizzato anche per valutare la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.

Introduzione

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Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule1. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell'ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina2. Alcuni di questi tag di poliubiquitina sono specifici per degradazione (K48)3, mentre altri sono in gran parte indipendenti dal processo di degradazione delle proteine (M1)4,5,6. Pertanto, il processo di ubiquitinazione delle proteine è incredibilmente complesso e la capacità di quantificare i cambiamenti in un tag poliubiquitin specifico è fondamentale per comprendere in ultima analisi il ruolo di quella data modifica nel funzionamento cellulare. Complicando ulteriormente lo studio di questo sistema, il proteasome, cheè la struttura catalitica dell'UPS 7, degrada le proteine ma può anche essere coinvolto in altri processi non proteolitici8,9. Non sorprende quindi, dalla sua scoperta iniziale, l'attività ubiquitina-proteasosa normale e aberrante è stata implicata nella formazione della memoria a lungo termine e in una varietà di stati di malattia, tra cui molti disturbi10,11. Di conseguenza, i metodi in grado di quantificare in modo efficace ed efficiente l'attività dell'UPS nel cervello sono fondamentali per comprendere in ultima analisi come questo sistema è disregolato negli stati di malattia e l'eventuale sviluppo di opzioni di trattamento rivolte all'ubiquitina e/o funzionamento proteasome.

Ci sono una serie di problemi nella quantificazione dell'attività di ubiquitina-proteasososo nel tessuto cerebrale da ratti e topi, che sono i sistemi modello più comuni utilizzati per studiare la funzione UPS, tra cui 1) la diversità delle modifiche dell'ubiquitina, e 2) distribuzione e regolazione differenziale dell'UPS funzionante attraverso scomparti subcellulari12,13,14. Per esempio, molte delle prime dimostrazioni della funzione ubiquitina-proteasosomico nel cervello durante la formazione della memoria utilizzato lisato intere cellule e indicato aumenti dipendenti dal tempo in entrambi l'ubiquitinazione delle proteine e l'attività proteasomiana15, 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20. Tuttavia, recentemente abbiamo scoperto che l'attività di ubiquitina-proteasososo variava ampiamente attraverso i compartimenti subcellulari in risposta all'apprendimento, con aumenti simultanei in alcune regioni e diminuzioni in altre, un modello che differiva in modo significativo da quanto descritto in precedenza in lisati intericellulari 21. Ciò è coerente con la limitazione di un approccio a tutta la cellula, in quanto non può dissociare il contributo dei cambiamenti nell'attività UPS in diversi compartimenti subcellulari. Anche se studi più recenti hanno impiegato protocolli di frazione sinaptica per studiare l'UPS specificamente nelle sinapsi in risposta all'apprendimento22,23,24, i metodi utilizzati occllude la capacità di misurare cambiamenti nucleari e citoplasmaici dell'ubiquitina-proteasososo nello stesso animale. Ciò si traduce in un bisogno inutile di ripetere gli esperimenti più volte, raccogliendo una frazione subcellulare diversa in ciascuno. Questo non solo comporta una maggiore perdita di vite umane, ma elimina la capacità di confrontare direttamente l'attività UPS attraverso diversi compartimenti subcellulari in risposta a un determinato evento o durante uno stato di malattia specifico. Considerando che gli obiettivi proteici dell'ubiquitina e del proteasoso variano ampiamente in tutta la cellula, comprendere come la segnalazione onniquitina-proteasome sia diversa nei compartimenti subcellulari distinti è fondamentale per identificare il ruolo funzionale dell'UPS neurologico durante la formazione della memoria e disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici.

Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato una procedura in cui le frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche potrebbero essere raccolte per una determinata regione cerebrale dallo stesso animale21. Inoltre, per tenere conto della quantità limitata di proteine che si può ottenere raccogliendo più frazioni subcellulari dallo stesso campione, abbiamo ottimizzato protocolli stabiliti in precedenza per analisi dell'attività proteasome in vitro e proteine in cellule lisci raccolte dal tessuto cerebrale del roditore. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di raccogliere e confrontare direttamente i cambiamenti dipendenti dall'apprendimento nell'attività proteasosa, K48, K63, M1 e i livelli complessivi di poliubiquitinazione proteica nel nucleo e nel citoplasma e nelle sinapsi nell'amigdala laterale dei ratti. In questo articolo viene descritta in dettaglio la procedura (Figura 1), che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione di come l'UPS è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine e in vari stati di malattia. Tuttavia, va notato che l'attività proteasome in vitro discussa nel nostro protocollo, anche se ampiamente utilizzata, non misura direttamente l'attività di complessi proteasome 26S completi. Piuttosto, questo saggio misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso proteasome 26S.

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Protocollo

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Tutte le procedure, comprese le materie animali, sono state approvate dal Virginia Polytechnic Institute e dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della State University (IACUC).

1. Raccolta e dissezione del tessuto cerebrale del roditore

NOT: Questo protocollo può essere applicato a una varietà di regioni del cervello e utilizzato con varie procedure di raccolta dei tessuti. Di seguito è riportata la procedura utilizzata nel nostro laboratorio per la subcellulare del tessuto cerebrale del ratto, usando ratti Sprague Dawley maschi di 8-9 settimane. Per elaborare tutti i compartimenti cellulari nello stesso animale, sezione 1.3. deve essere seguita indipendentemente dalla procedura di raccolta dei tessuti utilizzata.

  1. Estrarre il cervello del ratto e metterlo in una tazza criogenica pre-raffreddata sul ghiaccio secco. Congelare il cervello sul ghiaccio secco, o utilizzare azoto liquido, se disponibile, e trasferire in un congelatore -80 . I cervelli possono essere sezionati lo stesso giorno o in un secondo momento.
  2. Rimuovere il cervello congelato dalla tazza criogenica e mettere in una matrice cerebrale ratto raffreddato con ghiaccio secco. Ogni slot sulla matrice corrisponde a 0,5 mm, che può essere utilizzato per determinare la posizione approssimativa della regione di interesse (ROI).
    1. Utilizzando un Atlante cervello di ratto, inserire una lama di rasoio nella matrice immediatamente davanti (anteriore) dell'inizio previsto del ROI. Successivamente, inserire una lama di rasoio immediatamente all'estremità prevista (posteriore) del ROI.
    2. Rimuovere la fetta tra le lame del rasoio utilizzando un bisturi e posizionare su un vetrino al microscopio raffreddato sul ghiaccio secco. In genere, le sezioni sono spesse 2-3 mm, ma questo varia in base al ROI.
  3. Utilizzando un bisturi, sezionare il ROI un emisfero alla volta. Collocare ogni emisfero in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL separati preraffreddamentati su ghiaccio secco. Il tessuto congelato può essere immediatamente utilizzato per la frazione subcellulare o elaborato in un secondo momento se conservato a -80 gradi centigradi.

2. Estrazione nucleare e citoplasmatica

NOT: Questo protocollo utilizza soluzioni stock predefinite di sostanze chimiche di laboratorio comuni, tra cui 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,5 M di acido etilenoniaminetraceacetico (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) e 50% glicerolo. Se l'endpoint viene utilizzato nei saggi di attività proteasome, glicerolo e ATP possono essere aggiunti a tutti i buffer per evitare lo smontaggio di complessi proteasome durante la lisi.

  1. Preparare il buffer di lisi. Aggiungere 8,63 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un tubo conico sterile da 15 mL.
    1. Al tubo conico, aggiungere 1.000 .L di 0,1 M HEPES, 15 L di 1 M MgCl, 100 L di 1 M DTT e 50 -L del 10% NP-40.
    2. Aggiungete 100 l di cocktail inibitore della proteasi e 100-L di inibitore al fosfosi. Vorticare brevemente la soluzione da mescolare e posizionare sul ghiaccio bagnato per raffreddare. Si noti che la soluzione può avere una tinta gialla dall'inibitore del fosfosi.
      NOT: L'uso di inibitori della proteasi è essenziale per preservare le proteine e garantire la specificità dell'attività proteasomica in vitro. Tuttavia, questi inibitori possono anche comportare una leggera riduzione dell'attività proteasosa, il che significa che l'attività misurata sul saggio in vitro può essere una sottovalutazione dei livelli di attività effettivi.
  2. Preparare il buffer di estrazione. Aggiungere 5.925 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) ad un tubo conico sterile da 15 mL.
    1. Al tubo conico, aggiungere 2.000 'L di 0,1 M HEPES, 1250 'L del 50% glicerolo, 15 L di 1 M MgCl2, 5 L di 1 M DTT, 5 -L di 0,5 M EDTA e 600 -L di 5 M NaCl.
    2. Aggiungete 100 l di cocktail inibitore della proteasi e 100-L di inibitore al fosfosi. Vorticare brevemente la soluzione da mescolare e posizionare sul ghiaccio bagnato per raffreddare. Si noti che la soluzione può avere una tinta gialla dall'inibitore del fosfosi.
  3. Rimuovere il microtubo di centrifuga di 1,5 mL contenente un emisfero del ROI dal congelatore -80 . Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale. Ad esempio, in un esperimento a due gruppi, utilizzare l'emisfero sinistro per i primi due animali in ogni gruppo e l'emisfero destro per i due campioni successivi, ecc.
  4. Utilizzando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato a un omogenizzatore Teflon di vetro da 2 mL. Aggiungere 500 l di tampone di lis al tubo di Teflon.
    1. Utilizzando pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto utilizzando 15 tratti fino a quando non è presente alcuna quantità visibile di materiale solido. Utilizzare un movimento di tornitura (in senso orario o antiorario) durante ogni colpo.
  5. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Mettere il tubo sul ghiaccio bagnato e incubare per 30 min.
  6. Mettere il tubo in microcentrismo e girare per 10 min a 845 x g e 4 gradi centigradi. Dopo il completamento, rimuovere con attenzione il supernatante con il pipetting e metterlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml; questa è la Frazione Citoplasmatica, che può essere conservata sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi fino alla Sezione 2.9.
  7. Aggiungere 50 l buffer di estrazione al pellet risultante e risospendere con il pipettaggio. Non vorticare il pellet. Posizionare il tubo contenente il pellet risospeso sul ghiaccio e incubare per 30 min.
  8. Mettere il tubo in microcentrifuga e girare per 20 min a 21.456 x g, 4 gradi centigradi. Dopo il completamento, rimuovere con attenzione il supernatante con il pipetting e metterlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml; questa è la Frazione Nucleare. Il pellet può ora essere scartato.
  9. Misurare la concentrazione proteica delle estrazioni citoplasmatiche e nucleari utilizzando il saggio di proteine Dc (secondo le istruzioni del produttore), o qualsiasi saggio equivalente per i campioni raccolti utilizzando detergenti non ionici. Procedere immediatamente al saggio di attività proteasosa (Sezione 4) o al gonfiore occidentale (Sezione 5). In alternativa, i campioni possono essere conservati a -80 gradi fino a quando necessario.

3. Collezione frazione sinaptica

NOT: Questo protocollo utilizza soluzioni stock predefinite di sostanze chimiche di laboratorio comuni, tra cui 1 M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M NaCl e 10% SDS. Se l'endpoint viene utilizzato nei saggi di attività proteasome, glicerolo e ATP possono essere aggiunti a tutti i buffer per aiutare a prevenire lo smontaggio di complessi proteasomi durante la lisi

  1. Preparare il buffer TEVP con saccarosio a 320 mM. Aggiungere 60 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un becher pulito da 100 mL.
    1. Al becher, aggiungete 1.300 l'l di 1 M Tris (pH 7,5), 260 l di 0,5 M EDTA, 100 l di cocktail inibitore della proteasi, 100 L di cocktail inibitore di fosforo e 10,944 g di saccarosio. Mescolare con una barra di agitazione fino a quando il saccarosio è completamente sciolto.
    2. Portare il pH a 7,4 dollari aggiungendo gocciolamento di acido cloridrico (HCl) alla soluzione utilizzando una pipetta.
    3. Trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml. Portare il volume a 100 mL aggiungendo acqua ultrapura. Raffreddare la soluzione finale sul ghiaccio fino a quando necessario.
  2. Preparare il buffer di omogenesi. Aggiungere 60 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un becher pulito da 100 mL.
    1. Al becher, aggiungere 5.000'L di 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 l'l di 5 M NaCl, 100 l di cocktail inibitore della proteasi, 100L di cocktail inibitore del fosfosi e 2.000 .L di 10% SDS. Mescolare con una barra di agitazione.
      NOT: I detergenti ionici possono interferire con i saggi di attività proteasomici con conseguente decondimento del complesso proteasome. Il volume di SDS potrebbe essere abbassato per aiutare a preservare la funzione proteasomese, se lo si desidera.
    2. Portare il pH a 7,4 aumentando il dropwise HCl alla soluzione utilizzando una pipetta.
    3. Trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml. Portare il volume a 100 mL aggiungendo acqua ultrapura. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente; non raffreddare come SDS precipiterà fuori soluzione.
  3. Rimuovere la centrifuga di 1,5 mL contenente un emisfero del ROI dal congelatore -80 . Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale. Ad esempio, in un esperimento a due gruppi, utilizzare l'emisfero sinistro per i primi due animali in ogni gruppo e l'emisfero destro per i due campioni successivi, ecc.
  4. Utilizzando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato a un omogenizzatore Teflon di vetro da 2 mL. Aggiungere 500 l di tampone TEVP al tubo di Teflon.
    1. Utilizzando pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto utilizzando 15 tratti fino a quando non sono presenti trasferimenti visibili di materiale solido. Utilizzare un movimento di tornitura (in senso orario o antiorario) durante ogni colpo.
  5. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare il campione a 1.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi.
  6. Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando una pipetta da 1.000 l.l. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi. Il pellet originale (P1) contiene nuclei e grandi detriti e può essere scartato.
  7. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Questa è una Frazione Citosolica. Aggiungere 50 L di buffer di omogenesi al pellet (P2) e sospendere nuovamente con la pipettatura fino a quando non è visibile alcun materiale solido.
  8. Centrifugare il campione a 20.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 mL; questa è la Frazione di Membrana Synaptosomica grezza (sinaptica). Il pellet può essere scartato.
  9. Misurare la concentrazione proteica della frazione sinaptica utilizzando il saggio di proteina Dc (secondo le istruzioni del produttore), o qualsiasi saggio equivalente per i campioni raccolti utilizzando detergenti ionici. Procedere immediatamente al saggio di attività proteasosa (Sezione 4) o al gonfiore occidentale (Sezione 5). In alternativa, i campioni possono essere conservati a -80 gradi fino a quando necessario.

4. Saggio di attività proteasoso

NOT: L'attività proteasomesina può essere misurata nel tessuto cerebrale omogeneizzato utilizzando una versione leggermente modificata del 20S Proteasome Activity Kit. Questo test non misura direttamente l'attività di complessi proteasosi 26S completi. Piuttosto, misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso proteasome 26S. Il successo di questo saggio diminuisce con cicli di congelamento-disgelo ripetuti e/o livelli crescenti di detergenti, in particolare ionico, e richiede l'uso di un lettore di lamiere con un set di filtri 360/460 (eccitazione/emissione) e capacità di riscaldamento fino a 37 gradi centigradi.

  1. Impostazioni del lettore di lamiere: Pre-caldo a 37 gradi centigradi e tenere premuto durante la corsa.
    1. Impostare l'eccitazione su 360 ed emissione a 460. Se la piastra 96 bene utilizzata è chiara, impostare la posizione ottica su Bottom. Se viene utilizzata una piastra di ben essere scuri/neri 96, impostare la posizione dell'ottica su Superiore.
    2. Impostare i vecchi modelli di lettore di lamiere ad Auto-Gain sotto le opzioni di lettura fluorescente; modelli più recenti sono preimpostati per questo. Programmare una corsa cinetica con un tempo di 2 h, la scansione (lettura) ogni 30 min.
  2. Ricostituire il buffer di prova 10x fornito nel kit con 13,5 mL di acqua ultrapura. Aggiungere 14 l-L di 100 mM ATP al buffer ora 1x; questo migliora significativamente l'attività proteasosa nei campioni e migliora l'affidabilità del saggio. Il buffer di prova 20S finale può essere conservato sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi fino a quando necessario ed è stabile per diversi mesi.
  3. Ricostituire lo standard AMC fornito in kit con 100 L di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, in quanto lo standard è sensibile alla luce.
  4. Creare una curva di supporto di AMC utilizzando lo standard ricostituito, al buio o in condizioni di scarsa illuminazione.
    1. In tubi separati da 0,5 mL di microcentrismo, aggiungere 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 l dello standard AMC, che corrisponde alla concentrazione a 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 M AMC.
    2. A questi tubi, nello stesso ordine, aggiungere 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 . Questo crea una serie di concentrazioni di AMC da alto a basso, che verranno utilizzate per la calibrazione del lettore di lastre e l'analisi dell'attività proteasomico nei campioni omogeneizzati.
    3. Conservare tutti gli standard diluiti sul ghiaccio al buio fino a quando necessario.
  5. Ricostituire il substrato proteasoso (Suc-LLVY-AMC) fornito in kit con 65 -L di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, in quanto il substrato è sensibile alla luce. Creare una diluizione 1:20 del substrato proteasoso in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando un buffer di analisi 20S. Conservare il substrato diluito sul ghiaccio al buio fino a quando necessario.
    NOT: Ad esempio, se la piastra avrà 10 campioni e 1 vuoto, sarà necessario un substrato diluito sufficiente per 22 pozzetti (con duplicati) a 10 l per pozzo. Ciò equivale a 220 , è necessario 30 - L per gli errori di pipettaggio, che richiedono 12,5 l di substrato e 237,5 l di buffer di assione 20S.
  6. Scongelare i campioni desiderati (se congelati) e aggiungere una quantità normalizzata a una piastra di 96 pozze. Eseguire ogni campione in duplicati. La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione dei tessuti. In genere, 10-20 g è sufficiente per qualsiasi frazione subcellulare.
  7. Portare il volume del pozzo del campione a 80 oL con acqua ultrapura. La quantità aggiunta dipende dal volume del campione aggiunto. Ad esempio, se il campione 1 era di 4,5 litri di proteine e il campione 2 era di 8,7 l, la quantità di acqua necessaria sarà rispettivamente di 75,5 e 71,3 l. In due pozze separate, aggiungere 80 l di acqua da solo; questi sarà il saggio Blanks.
    NOT: Al fine di limitare i cambiamenti nel volume delle proteine dovuti a errori di pipettaggio, le concentrazioni di proteine possono essere normalizzate al campione meno concentrato. Ciò consentirà l'uso dello stesso volume campione in tutte le condizioni.
  8. Aggiungete 10 l di 20S Assay buffer in ogni pozzo, incluso Assay Blanks. Un ripetitore/pipetta automatizzato è consigliato qui per garantire un volume di analisi coerente tra i pozzi.
  9. Facoltativo: In questa fase, introdurre manipolazioni in vitro, se lo si desidera; questo richiederà che ogni campione abbia altri 2 pozzi per trattamento, compreso il veicolo. In caso affermativo, aggiungere 5-10 l of drug/compound di interesse a 2 dei pozze campione e un volume equivalente di controllo/veicolo ad altri 2 pozze. Posizionare la piastra sul lettore di piastre preriscaldato o in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min.
  10. Spegnere le luci o entrare in una stanza buia. Aggiungere tutti i 100 l di standard AMC diluiti a un nuovo pozzo; ogni standard avrà un unico pozzo.
  11. Al buio, aggiungere 10 L di substrato proteasoso diluito ai pozzi contenenti campione e Assay Blanks, ma non allo standard AMC. Un ripetitore/pipetta automatizzato è consigliato qui per garantire un volume di analisi coerente tra i pozzi.
  12. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e avviare la corsa cinetica.
    NOT: La piastra non deve essere in costante agitazione durante la corsa cinetica, tuttavia, l'utente può scegliere di se lo si desidera
  13. Al termine della corsa cinetica, esportare i valori fluorescenti 360/460 non elaborati in Microsoft Excel.
    1. Media insieme pozze duplicate per ogni standard, ogni campione e il Vuoto di prova per tutte e 5 le scansioni. I valori fluorescenti grezzi dovrebbero aumentare tra le scansioni dei campioni, ma rimangono stabili (o diminuiscono leggermente) per gli standard e Assay Blanks.
    2. Prendere la media del pozzo standard AMC più alta e dividere per la concentrazione nota (20 M). Dividere questo valore per la concentrazione del campione utilizzata nel saggio per ottenere il valore AMC standardizzato. Per ogni campione e Media vuota, dividere per il valore AMC standardizzato.
    3. Prendere questo valore finale e dividere per la concentrazione del campione utilizzato nel saggio per ottenere il valore normalizzato per ogni campione e il vuoto di analisi. Eseguire questa operazione per tutte e 5 le scansioni.
    4. Sottrarre il valore vuoto del campione normalizzato da ogni valore di campione normalizzato per tutte e 5 le scansioni.

5. Quantificazione dell'Ubiquitinazione proteica specifica del collegamento

  1. La quantificazione di diversi tag di poliubiquitina in diverse frazioni subcellulari raccolte dal tessuto cerebrale del roditore dovrebbe essere effettuata utilizzando una varietà di protocolli standard occidentali di gonfiore in combinazione con anticorpi di poliiquitina unici e specifici del collegamento.
    1. Per la denotazione, mescolare i campioni normalizzati con un volume uguale di buffer di campione Laemmli integrato con il buffer del campione di z-mercaptoetanolo a una percentuale del 5% in volume, secondo le istruzioni del produttore.
    2. Per la quantificazione di tutte le modifiche di monoubiquitinazione e poliubiquitination indipendentemente dal collegamento, utilizzare un anticorpo pan-ubiquitina.
    3. Per riconoscere tutte le proteine poliubizzate, utilizzare un anticorpo di ubiquitina che non reagisce in modo incrociato con la monoubiquitinazione.
    4. Per la poliubiquitinazione specifica del collegamento, utilizzare anticorpi in grado di rilevare lisina-27, lisina-48, lisina-63 e poliubiquitinazione lineare (M1).
  2. Per evitare la contaminazione incrociata tra gli sviluppi, che potrebbe provocare un falso positivo o interferire con l'imaging di una diversa modifica dell'ubiquitina, striscia membrane tra gli sviluppi utilizzando 0.1 M NaOH per 10 min.
    1. Lavare le membrane in TBS con 0,1% interpolazione due volte per 10 min e ribloccare (utilizzando qualsiasi agente di bloccante è preferito nel protocollo Western blot utilizzato).
    2. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario e riqualificare per confermare che la membrana è stata correttamente spogliata di anticorpi primari e secondari.
    3. Consigliato: Per lo sviluppo di successo di diversi anticorpi dell'ubiquitina senza contaminazione, utilizzare sistemi di imaging fluorescente o vicino all'infrarosso. Questo spesso può impedire il riporto tra anticorpi.
  3. Alcune immagini di ubiquitin Western blot forniranno colonne di bande distinte (come M1) mentre altre producono un modello simile a una sbavatura con poche o nessuna linea chiara (comune con K48). Per la quantificazione delle macchie occidentali di ubiquitina imaged, disegna una casella intorno alla colonna che estende l'intera scala di standard molecolari.
    1. Regolare la casella verso l'alto (o verso il basso) se l'ubiquitina colorazione si estende attraverso l'intera scala; questo è comune per le modifiche della lisina-48 e varia ampiamente tra i compartimenti subcellulari.
    2. Sottrarre lo sfondo, che viene calcolato come la densità ottica media dello sfondo immediatamente che circonda la colonna su tutti i lati.

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Risultati

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Utilizzando la procedura qui descritta, sono state raccolte frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche dall'amigdala laterale del cervello del ratto (Figura 1). La purezza delle singole frazioni è stata confermata attraverso il gonfiore occidentale, sondando con anticorpi contro le proteine che dovrebbero essere arricchiti o esauriti nel lisato. Nel primo emisfero in cui è stata raccolta una frazione sinaptica grezza, la proteina di densità post-sinaptic...

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Discussione

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Qui, dimostriamo un metodo efficiente per quantificare i cambiamenti nell'attività onniquitina-proteasoma attraverso diversi compartimenti subcellulari nello stesso animale. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di misurare i cambiamenti subcellulari nell'attività del sistema ubiquitina-proteasoma sono stati limitati a un singolo compartimento per campione, con conseguente necessità di ripetere gli esperimenti. Questo porta a costi significativi e perdita di vita animale. Il nostro protocollo allevia questo problem...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio del College of Agricultural and Life Sciences e il College of Science di Virginia Tech.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.5 M EDTAFisher15575020Vari altri fornitori
20S Proteasome Activity KitMillipore SigmaAPT280Altri fornitori hanno versioni diverse
ATPFisherFERR1441Vari altri fornitori
Anticorpi beta-actinaSegnalazione cellulare4967SVari altri fornitori
Cellula anticorpale beta-tubulina segnalazione2128TVari altri fornitori
BioTek Synergy H1 plate readerBioTekVATECHH1MT3Altri fornitori offrono diverse versioni
B-mercaptoetanoloFisherICN19024280Vari altri fornitori
Clasto lattacistina b-lattoneMillipore SigmaL7035Vari altri fornitori
Tazza criogenicaFisher033377BAltri fornitori
DMSO DMSOD8418Altri fornitori
DTTMillipore SigmaD0632Altri fornitori
GlycerolMillipore SigmaG5516Altri fornitori Anticorpi
H3Abcamab1791Altri fornitori
HEPESMillipore SigmaH3375Altri fornitori
Acido cloridricoFisherSA48Vari altri fornitori
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Vari altri fornitori
K48 Ubiquitina AnticorpoAbcamab140601Vari altri fornitori
K63 Ubiquitina AnticorpoAbcamab179434Vari altri fornitori
KClMillipore SigmaP9541Vari altri fornitori
Macinatore di tessuti KONTESVWRKT885300-0002Vari altri fornitori
Tampone per campioni LaemmliBio-rad161-0737Vari altri fornitori
Linear Ubiquitin AntibodyLife SensorsAB-0130-0100Solo anticorpo M1
MgClMillipore Sigma442611Vari altri fornitori
MicrocentrifugaEppendorf2231000213Vari altri produttori/modelli
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Carry by Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014Vari altri fornitori
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02Altri fornitori hanno diverse versioni
Inibitore della fosfatasiMillipore Sigma524625Vari altri fornitori
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373Vari altri fornitori
Inibitore della proteasiMillipore SigmaP8340Vari altri fornitori
Anticorpi PSD95Segnalazione cellulare3450TVari altri fornitori
SDSMillipore SigmaL3771Vari altri fornitori
Idrossido di sodioFisherSS255Vari altri fornitori
SaccarosioMillipore SigmaS0389Vari altri fornitori
TBSAlfa AesarJ62938Vari altri fornitori
TrisMillipore SigmaT1503Vari altri fornitori
Tween-20FisherBP337-100Vari altri fornitori
Ubiquitina AnticorpoEnzo Scienze della vitaBML-PW8810Vari altri fornitori

Riferimenti

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