Method Article

Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descritto qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microrganismi intestinali umani sono recentemente diventati un importante obiettivo di ricerca nella promozione della salute umana e nella prevenzione delle malattie. Di conseguenza, le indagini sulle interazioni tra endobiotici (ad esempio, farmaci e prebiotici) e microbiota intestinali sono diventate un importante argomento di ricerca. Tuttavia, gli esperimenti in vivo con volontari umani non sono ideali per tali studi a causa della bioetica e dei vincoli economici. Di conseguenza, sono stati utilizzati modelli animali per valutare queste interazioni in vivo. Tuttavia, gli studi sui modelli animali sono ancora limitati da considerazioni bioetica, oltre a diverse composizioni e diversità di microbiota negli animali rispetto all'uomo. Una strategia di ricerca alternativa è l'uso di esperimenti di fermentazione in batch che consentono di valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale in vitro. Per valutare questa strategia, gli esocriteri bifidobatterici (Bif) sono stati utilizzati come xenobiotici rappresentativi. Poi, le interazioni tra Bif EPS e microbiota intestinale umano sono state studiate utilizzando diversi metodi come la cromatografia a strato sottile (TLC), l'analisi compositiva della comunità batterica con il sequenziamento ad alto valore del gene rRNA 16S e la cromatografia a gas di acidi grassi a catena corta (SCFA). Presentato qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro. È importante sottolineare che questo protocollo può anche essere modificato per studiare le interazioni generali tra altri endobiotici e microbiota intestinali.

Introduction

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Il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nel funzionamento dell'intestino umano e nella salute dell'ospite. Di conseguenza, il microbiota intestinale è recentemente diventato un importante obiettivo per la prevenzione delle malattie e la terapia1. Inoltre, i batteri intestinali interagiscono con le cellule intestinali dell'ospite e regolano i processi fondamentali dell'ospite, comprese le attività metaboliche, le disponibilità dei nutrienti, la modulazione del sistema immunitario e persino la funzione cerebrale e il processo decisionale2,3 . Gli endobiotici hanno un notevole....

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Protocol

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Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico dell'Università di Scienza e Ingegneria dell'Università Hunan (Hunan, Cina), e dell'Università di Gongshang dello zhejiang.

1. Preparazione di batteri

  1. Preparazione del brodo medio bifidobacterium
    1. Unire i seguenti componenti in 950 mL di acqua distillata: estratto di carne, 5 g/L; estratto di lievito, 5 g/L; peptone di caseina, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucosio, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; soluzione sale, 40 mL (CaCl2.2H<....

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Results

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La produzione di Mucoid EPS potrebbe essere osservata nelle colture B. longum su piastre PYG dopo l'incubazione anaerobica per 72 h (Figura 1A). La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita da precipitazioni enole e essiccazione, ha portato alla raccolta di EPS simili alla cellulosa (Figura 1B). L'EPS essiccato e l'amido solubile sono stati poi utilizzati come fonti di carbonio per le colture di fermentazione. TLC è stato utilizzato per l'analisi d.......

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Discussion

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Sono stati compiuti progressi significativi verso la comprensione della composizione e delle attività del microbiota intestinale umano nell'ultimo decennio. Come conseguenza di questi studi, è emerso il concetto olobionte, che rappresenta le interazioni tra gli ospiti e le comunità microbiche associate, come tra gli esseri umani e il loro microbiota intestinale19,20. Inoltre, gli esseri umani sono ancora ora considerati come superorganismi21

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Le cifre sono state citate in Yin et al. 11.

Acknowledgements

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Questo studio è stato finanziato dalla National Nature Science Foundation of China (n. 31741109), dalla Hunan Natural Science Foundation (n. 2018JJ3200), e dal programma di costruzione di disciplina caratteristica applicata presso l'Università Hunan di Scienza e Ingegneria. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 µ m filtri a membranaMilliporeSLGP033RBUtilizzare per filtrare campioni
Setaccio da 0,4 mmThermo Fischer308080-99-1Utilizzare per preparare campioni fecali umani
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galattopiranoside (X-Gal)SolarbioX1010Utilizzare per preparare la piastra a colori
AceticSigma-Aldrich71251Campione standard per SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214Il componente della
camera anaerobicaElectrotekAW 400SGColtura e fermentazione dei batteri
AutoclaveSANYOMLS-3750Utilizzare per autoclavare
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178Il componente del forno di
cotturaShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AUtilizzare per riscaldare e cuocere
l'estratto di manzoSolarbioG8270Il componente del mezzo
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™batteri
Sali biliariSolarbioYZ-1071304Il componente del medio
ButirricoSigma-Aldrich19215Campione standard per SCFA
CaCl2SolarbioC7250Soluzione salina della
colonna capillareSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm &volte; 30 m &volte; 0,25 μ m)Utilizzato per la rilevazione SCFA
Caseina PeptoneSigma-Aldrich39396Il componente del mezzo
CentrifugaThermo ScientificSorvall ST 8Utilizzare per la centrifugazione
CoSO4.7H2OSolarbioC7490Il componente del mezzo
CuSO4.5H2OSolarbio203165Il componente del mezzo
Cisteina-HClSolarbioL1550Il componente del medio
EtanoloSigma-AldrichE7023Utilizzare per preparare la vitamina K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614Il componente del medio
Acido FormicoSigma-Aldrich399388Utilizzato per la
gascromatografiaShimadzu CorporationGC-2010 PlusUtilizzato per la rilevazione SCFA
Bicchiere di vetroFisher ScientificFB10050Utilizzato per la preparazione del liquame
GlucosioSolarbioG8760Il componente del mezzo
HaeminSolarbioH8130Il componente del mezzo
HClSigma-Aldrich30721Soluzione basica utilizzata per regolare il pH dei tamponi
IsobutirricoSigma-Aldrich46935-UCampione standard per
acidi isovalericiSCFA Sigma-Aldrich129542Campione standard per SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Soluzione salina del mezzo
KClSolarbioP9921Il componente del mezzo
KH2PO4SolarbioP7392Soluzione salina del mezzo
LiCl.3H2OSolarbioC8380Utilizzare per preparare la piastra colorata
Estratto di carneSigma-Aldrich-Aldrich70164Il componente del medio
Acido metafosforicoSigma-AldrichB7350Campione standard per SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160Il componente del mezzo
MgSO4.7H2OSolarbioM8300Soluzione salina del sistema
medio MISEQIlluminaMiSeq 300PESequenziamento del DNA
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Soluzione salina di
mupirocinaSolarbioYZ-1448901Antibiotico
NaClSolarbioYZ-100376Soluzione salina di
NaHCO3Sigma-Aldrich792519Soluzione salina di media
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Determinare le concentrazioni di DNA
NaOHSigma-Aldrich30620Soluzione basica utilizzata per regolare il pH dei tamponi
n-butanoloChemSpider71-36-3Utilizzato per TLC
NiCl2Solarbio746460Il componente del mezzo
OrcinolSigma-Aldrich447420Utilizzato per preparare reagenti
orcinoloPropionicSigma-Aldrich94425Campione standard per SCFA
QIAamp DNA Sgabello Mini KitQIAGEN51504Estratto DNA genomico batterico
Polvere PBS pronta all'usoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Utilizzato per preparare la sospensione lipidica
ResazurinSolarbioR8150Attrezzatura anaerobica
Concentratore sottovuoto di velocitàLABCONCOCentriVapUtilizzare per preparare EPS
AmidoSolarbioYZ-140602Utilizzare per la fonte di carbonio
Acido solforicoSigma-Aldrich150692Utilizzato per preparare reagenti
T100 PCRBIO-RAD1861096 PCR amplificazione
TLC fogli di alluminioMerckMillipore116835Utilizzato per TLC
Trypticase PeptoneSigma-AldrichZ699209Il componente del mezzo
TryptoneSigma-AldrichT7293Il componente del mezzo
Tween 80SolarbioT8360Soluzione salina del mezzo
ValericSigma-Aldrich75054Campione standard per SCFA
Vitamina K1Sigma-AldrichV3501Il componente dell'oscillatore
a vorticeScientific IndustriesVortex.Genie2Utilizzare per l'estratto di lievito a vortice
Sigma-AldrichY1625Il componente del mezzo
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251Il componente del mezzo
media medio media TLC media orcinoli medio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

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Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

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