Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2a '-deossiguanosina (1,N2-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.
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Articolo metodologico
Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli addotti del DNA e le basi di DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze che sono elettrofiliche, generano elettrofili reattivi sulla biotrasformazione o inducono lo stress ossidativo. Tra i nucleobasi ossidati, il più studiato è 8-oxo-7, 8-diidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), un biomarcatore di danno di base ossidativamente indotto nel DNA. Aldeidi ed epoxyaldeidi risultanti dal processo di perossidazione lipidica sono molecole elettrofiliche in grado di formare addotti mutageni del DNA esociclico, come gli addotti addotti 1,n2-addotti-2'-deoxyguanosina (1,n2- εdGuo) e 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-εdado), che sono stati suggeriti come potenziali biomarcatori nella fisiopatologia dell'infiammazione. Metodi selettivi e sensibili per la loro quantificazione nel DNA sono necessari per lo sviluppo di strategie preventive per rallentare i tassi di mutazione cellulare e lo sviluppo di malattie croniche (ad esempio, cancro, malattie neurodegenerative). Tra i metodi sensibili disponibili per la loro rilevazione (cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata ai rivelatori di spettrometria di massa elettrochimica o tandem, test Comet, immunodosaggi, 32P-postetichettatura), le più selettive sono quelle basate su cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La selettività è un vantaggio essenziale nell'analisi di campioni biologici complessi e l'HPLC-ESI-MS/MS si è evoluto come lo standard Gold per la quantificazione dei nucleosidi modificati nelle matrici biologiche, come il DNA, l'urina, il plasma e la saliva. L'uso di standard interni con etichetta isotopica aggiunge il vantaggio delle correzioni per le perdite di molecola durante le fasi di arricchimento dell'idrolisi e dell'analita del DNA, nonché per le differenze di ionizzazione dell'analita tra i campioni. Aiuta anche a identificare il picco cromatografico corretto quando è presente più di un picco.
Qui vi presentiamo i metodi HPLC-ESI-MS/MS, sensibili, accurati e precisi, che sono stati applicati con successo per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,n6-dado e 1,n2-DGUO nel polmone, nel fegato e nel DNA dei reni dei topi a/J per valutazione degli effetti dell'esposizione ambientale PM2,5 .
Introduzione
Alcune specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono in grado di ossidare doppi legami di carbonio di basi di DNA e alcuni carboni nella frazione desossribosio, generando basi ossidate e rottura del filamento del DNA1. Come una molecola carica negativamente ricca di atomi di azoto e ossigeno, il DNA è anche un bersaglio per i gruppi elettrofilici che covalentemente reagiscono con i siti nucleofili (azoto e ossigeno), dando prodotti che sono chiamati addotti del DNA2. Quindi, gli addotti del DNA e le basi del DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze ....
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Protocollo
Quattro settimana vecchio maschio A/J topi, patogeno specifico libero, sono stati ottenuti dal centro di allevamento di animali da laboratorio di Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasile, e sono stati trattati di conseguenza al comitato etico della facoltà di medicina, Università di San Paolo (protocollo no 1310/09).
1. raccolta dei tessuti dei topi
- Anestetizzare l'animale con xylazina e chetamina. Per un topo con 30 g di peso corporeo, iniettare una soluzione (non più di 2 mL) contenente 2,63 mg di ketamina e 0,38 mg di Xylazine, intraperitoneale.
- Raccogliere il sangue (0,5-1,5 mL) per analisi....
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Risultati
Le concentrazioni medie di DNA (± DS) ottenute da topi epatici (~ 1 g di tessuto), polmone (~ 0,2 g di tessuto) e rene (~ 0,4 g di tessuto) erano, rispettivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, e 3.223 ± 723 μg/mL nel volume finale di 200 μL. Un cromatogramma rappresentativo ottenuto da HPLC-DAD del DNA purificato è mostrato in Figura 3. La presenza dei quattro 2'-deossinucleosidi, esenti dai ribonucleosidi dell'RNA, che eluto immediatamente prima dei corrisp.......
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Discussione
Un problema importante riscontrato nelle analisi 8-oxodGuo da HPLC Metodi è la possibile induzione della sua formazione durante le procedure di esame di estrazione del DNA, idrolisi del DNA, e la concentrazione di DNA idrolizzati22,38. Al fine di minimizzare il problema della formazione di 8-oxodGuo smontava, si raccomanda l'aggiunta di deferossamina a tutte le soluzioni di estrazione, stoccaggio e idrolisi del DNA, l'uso del metodo chaotropico ioduro di sodio e .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 e 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 e 429184/2016-6), Mantes, PRPUSP (PRÓ-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), into INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), Redoxoma INCT (FAPESP/CNPq/Mantes; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma di NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) e CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira e A. A. F. Oliveira hanno ricevuto borse di studio da FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) e CAPES (coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di mascio, P....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2'-deossiadenosina | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2'-deossiguanosina | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrile | Carlo Erba Reagenti | 412413000 | |
| alcalini fosfatasi dalla mucosa intestinale bovina | Sigma | P5521 | |
| acetato di ammonio | Merck | 101116 | |
| timo di vitello DNA | Sigma | D1501 | |
| soluzione di lisi cellulare | QIAGEN | 158908 | |
| cloroformio | Carlo Erba Reagenti | 412653 | |
| deferoxamina | Sigma | D9533 | |
| desossiribonucleasi I (DNasi I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| etanolo | Carlo Erba Reagenti | 414542 | |
| acido formico | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS sistema | HPLC: Agilent serie 1200 ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: pompa binaria (G1312B), pompa isocratica (G1310A), forno a colonna con valvola di commutazione a colonna (G1316B), rivelatore a diodi (G1315C), campionatore automatico (G1367C). ESI-MS/MS: Spettrometro di massa a trappola ionica a quadrupolo lineare, modello 4000 QTRAP. | |
| Sistema HPLC/DAD | Shimadzu | Due pompe (LC-20AT), rivelatore a matrice di fotodiodi (DAD-20AV), autoiniettore (Proeminence SIL-20AC), forno a colonna (CTO-10AS/VP) | |
| Colonna HPLC (diametro interno 50 x 2,0 mm, 2,5 e micro; m, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| (diametro interno 150 x 2,0 mm, 3,0 µ m, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| (diametro interno 250 x 4,6 mm, 5,0 &; m, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 cartuccia di protezione di sicurezza (4,0 x 3,0 mm ID) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| alcool isoamilico | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| alcool isopropilico (isopropanolo) | Carlo Erba Reagenti | A412790010 | |
| ketamina | Ceva | Nome commerciale: Dopalen | |
| cloruro di magnesio | Carlo Erba Reagenti | 349377 | |
| cloruro di magnesio | Sigma | M2393 | |
| metanolo | Carlo Erba Reagenti | L022909K7 | |
| fosfodiesterasi I da Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| soluzione di precipitazione proteica | QIAGEN | 158912 | |
| proteinasi K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonucleasi A | Sigma | R5000 | |
| sodio cloruro | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(idrossimetil)-aminometano | Carlo Erba Reagenti | 489983 | |
| xilazina | Syntec do Brasil | Nome commerciale: Xilazin |
Riferimenti
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
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