Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Sommario

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Abstract

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e il reticolo endolasmico (ER), creano una rete per svolgere una varietà di funzioni. Queste strutture altamente curve sono piegate in varie forme per formare una rete dinamica a seconda delle condizioni cellulari. La visualizzazione di questa rete tra mitocondri ed ER è stata tentata utilizzando l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione e la microscopia leggera; tuttavia, la risoluzione limitata non è sufficiente per osservare in dettaglio le membrane tra i mitocondri e il ER. La microscopia elettronica a trasmissione fornisce un buon contrasto della membrana e una risoluzione su scala nanometrica per l'osservazione degli organelli cellulari; tuttavia, è eccezionalmente dispendioso in termini di tempo quando si valuta la struttura tridimensionale (3D) di organelli altamente curvi. Pertanto, abbiamo osservato la morfologia dei mitocondri e del ER attraverso la microscopia correlativa degli elettroni di luce (CLEM) e le tecniche di microscopia elettronica del volume utilizzando una maggiore perossia ascorbate 2 e la colorazione della perossia di rafano. Un metodo di colorazione en bloc, la sezionamento seriale ultrasottile (tomografia a matrice) e la microscopia elettronica del volume sono stati applicati per osservare la struttura 3D. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di microscopia elettronica CLEM e 3D per eseguire studi strutturali dettagliati di mitocondri ed ER.

Introduzione

I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte¹. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa²; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione³ ed elettroscopia (EM)⁴ hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un'etichettatura spec....

Protocollo

1. Coltura cellulare con piatto di coltura della griglia modellato e trasfezione cellulare con SCO1-APEX2 e vettore plasmid HRP-KDEL

1. Seme 1 x 10^{5 cellule} HEK293T mettendole in piatti di coltura con fondo griglia in vetro da 35 mm in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ a 37 gradi centigradi nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomycin.
2. Il giorno dopo la semina delle cellule, quando sono cresciute al 50%-60% di confluenza, introdurre il SCO1-APEX2¹⁰ e HRP-KDEL¹² plasmide alle cellule utilizzando reagente di tra....

Risultati

Nella Figura 1 vengono descritti la pianificazione e il flusso di lavoro per questo protocollo. Il protocollo richiede 7 giorni; tuttavia, a seconda del tempo dedicato all'imaging SEM, questo può aumentare. Per la trafezione cellulare, la confluenza delle cellule deve essere controllata in modo da non coprire la parte inferiore dell'intera piastra della griglia (Figura 1A). Un'alta densità cellulare potrebbe impedire l'identificazione della cellula di interesse durante il microscopio leg.......

Discussione

Determinare la localizzazione cellulare di proteine specifiche a risoluzione di nanometri utilizzando EM è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari delle proteine. In generale, ci sono due tecniche per studiare la localizzazione di una proteina bersaglio tramite EM. Una è la tecnica dell'immunogolda, che è stata utilizzata in EM dal 1960, e l'altra è una tecnica che utilizza tag geneticamente codificati di recente¹⁶. Le tecniche tradizionali di immunogold hanno impiegato particelle d'oro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glutaraldeide	EMS	16200	Utilizzare solo in cappa
aspirante Paraformaldeide	EMS	19210	Utilizzare solo in cappa
aspirante Cacodilato di sodio	EMS	12300
Tetrossido di osmio 4 % soluzione acquosa	EMS	16320	Utilizzare solo in cappa aspirante
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultra-microtomo Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Acetato di uranile	EMS	22400	Sostanza chimica pericolosa
Citrato di piombo	EMS	17900
35mm Piastra vetrino coprioggetti a griglia	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Scaricatore di bagliore	Pelco	easiGlow
Formvar rivestito in carbonio Griglia	di rameTed Pella	01805-F
Acido cloridrico	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glicina	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidina (DAB)	SIGMA	D8001	Sostanza chimica pericolosa
30% Soluzione di perossido di idrogeno	Merck	107210
Esacianoferrato di potassio (II) triidrato	SIGMA	P3289
0,22 um filtro per siringa	Sartorius	16534
Tiocarbonildiidrazide	SIGMA	223220	Utilizzare solo in cappa aspirante
Idrossido di potassio	Fluka	10193426
Acido L-aspartico	SIGMA	A9256
Etanolo	Merck	100983
Microscopia elettronica a trasmissione	FEI	Tecnai G2
Vetrini coprioggetto rivestiti di ossido di indio e stagno (ITO) SPI		06489-AB	vetro fragile
Isopropanolo	Fisher Bioreagenti	BP2618-1
Coltello diamantato	Leica	AT-4
Microscopia ottica inveted	Nikon	ECLipse TS100
Microscopia elettronica a scansione	Zeiss	Auriga