Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Sommario

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Abstract

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e il reticolo endolasmico (ER), creano una rete per svolgere una varietà di funzioni. Queste strutture altamente curve sono piegate in varie forme per formare una rete dinamica a seconda delle condizioni cellulari. La visualizzazione di questa rete tra mitocondri ed ER è stata tentata utilizzando l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione e la microscopia leggera; tuttavia, la risoluzione limitata non è sufficiente per osservare in dettaglio le membrane tra i mitocondri e il ER. La microscopia elettronica a trasmissione fornisce un buon contrasto della membrana e una risoluzione su scala nanometrica per l'osservazione degli organelli cellulari; tuttavia, è eccezionalmente dispendioso in termini di tempo quando si valuta la struttura tridimensionale (3D) di organelli altamente curvi. Pertanto, abbiamo osservato la morfologia dei mitocondri e del ER attraverso la microscopia correlativa degli elettroni di luce (CLEM) e le tecniche di microscopia elettronica del volume utilizzando una maggiore perossia ascorbate 2 e la colorazione della perossia di rafano. Un metodo di colorazione en bloc, la sezionamento seriale ultrasottile (tomografia a matrice) e la microscopia elettronica del volume sono stati applicati per osservare la struttura 3D. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di microscopia elettronica CLEM e 3D per eseguire studi strutturali dettagliati di mitocondri ed ER.

Introduzione

I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte¹. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa²; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione³ ed elettroscopia (EM)⁴ hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un'etichettatura specifica. EM è una tecnica adatta per ottenere un contrasto sufficientemente ad alta risoluzione per gli studi strutturali delle connessioni tra mitocondri e ER. Tuttavia, uno svantaggio è rappresentato dalle informazioni limitate sull'asse z, in quanto le sezioni sottili devono essere di circa 60 nm o più sottili per la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM). Per una sufficiente imaging dell'asse z EM, è possibile utilizzare la microscopia elettronica tridimensionale (3DEM)⁵. Tuttavia, questo comporta la preparazione di centinaia di sottili sezioni seriali di intere cellule, che è un lavoro molto difficile che solo pochi tecnologi qualificati hanno imparato. Queste sezioni sottili vengono raccolte su griglie TEM a foro rivestite con pellicola di forma fragile. Se il film si rompe su una cintura, l'imaging seriale e la ricostruzione del volume non sono possibili. La microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBEM) è una tecnica popolare per 3DEM che utilizza la sezionamento distruttivo del blocco all'interno della camera a vuoto del microscopio elettronico a scansione (SEM) con un coltello a diamante (Dik-SBEM) o un fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) ⁶. Tuttavia, poiché tali tecniche non sono disponibili in tutte le strutture, suggeriamo la tomografia array⁷ utilizzando il sezionamento seriale e SEM. Nella tomografia a matrice, le sezioni seriali tagliate con un ultramicrotoma vengono trasferite su una vetrina di vetro invece di una griglia TEM e visualizzate tramite microscopia leggera e SEM⁸. Per migliorare il segnale per l'imaging di elettroni backscatter (BSE), abbiamo utilizzato un protocollo di colorazioneen bloc EM che impiega cellule fisse osmioum tetrossido (OsO 4) con thiocarbohydrazide (TCH)⁹osmiofilia doppia colorazione post-incorporamento.

Inoltre, il marcatore mitocondriale SCO1 (proteina di assemblaggio citocromatico c ossidasi 1)– ascorbate peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ tag molecolare è stato utilizzato per visualizzare i mitocondri a livello di EM. APEX2 è di circa 28 kDa ed è derivato da soia ascorbate perossidasi¹¹. È stato sviluppato per mostrare la posizione dettagliata di proteine specifiche a livello EM nello stesso modo in cui la proteina con etichettatura proteica fluorescente verde viene utilizzata nella microscopia leggera. APEX2 converte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) in un polimero osmiofilo insolubile nel sito del tag in presenza del cofattore di perossido di idrogeno (H₂O₂). APEX2 può essere utilizzato come alternativa all'etichettatura tradizionale degli anticorpi in EM, con una localizzazione delle proteine per tutta la profondità dell'intera cellula. In altre parole, la proteina con etichetta APEX2 può essere visualizzata mediante osmicazione specifica¹¹ senza etichettatura immunogold e permeabilizzazione dopo l'ultracriosezione. La perossidasi di rafano (HRP) è anche un tag sensibile che catalizza la polimerizzazione dipendente da DAB H₂O₂in un precipitato localizzato, fornendo contrasto EM dopo il trattamento con OsO₄. La sequenza di peptidi bersaglio ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² è stata applicata per visualizzare ER all'interno di un'intera cellula. Per valutare il nostro protocollo di utilizzo di tag genetici e di attenuazione in blocco con osmio ridotto e TCH (metodo rOTO), utilizzando l'effetto osmicazione allo stesso tempo, abbiamo confrontato il contrasto della membrana con e senza l'uso di ogni tag genetico in rOTO en bloc colorazione. Anche se 3DEM con tomografia array e colorazione DAB con APEX e HRP sono stati, rispettivamente, utilizzati per altri scopi, il nostro protocollo è unico perché abbiamo combinato la tomografia di array per la colorazione 3DEM e DAB per la colorazione dei mitocondri e del ER. In particolare, abbiamo mostrato cinque cellule con e senza geni etichettati con APEX nella stessa sezione, il che ha aiutato a studiare l'effetto della modificazione genetica sulle cellule.

Protocollo

1. Coltura cellulare con piatto di coltura della griglia modellato e trasfezione cellulare con SCO1-APEX2 e vettore plasmid HRP-KDEL

1. Seme 1 x 10^{5 cellule} HEK293T mettendole in piatti di coltura con fondo griglia in vetro da 35 mm in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ a 37 gradi centigradi nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomycin.
2. Il giorno dopo la semina delle cellule, quando sono cresciute al 50%-60% di confluenza, introdurre il SCO1-APEX2¹⁰ e HRP-KDEL¹² plasmide alle cellule utilizzando reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 g DNA plasmide HRP-KDEL 0,5 g per 3 reagente di trasfezione).

2. Microscopia leggera delle cellule che crescono su piatti a coltura modellata e colorazione DAB per APEX2 e HRP

1. A 16-24 h dopo la trasfezione, rimuovere tutti i supporti di coltura e aggiungere immediatamente 250 l di soluzione di fissaggio calda (30-37 gradi centigradi) (Tabella 1) mediante un delicato pipettaggio. Rimuovere immediatamente la soluzione di fissaggio e sostituirla con 1,5 mL di soluzione di fissaggio nuova. Incubare sul ghiaccio per 60 min, quindi lavare tre volte per 10 min ciascuno in 1 mL di ghiaccio freddo tamponi cacodylate (Tabella 1).
   AVVISO: i fumi di aldeide sono estremamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione di glicina da 20 mM e incubare per 10 min sul ghiaccio seguito da tre lavatrici di 5 min ciascuno in 1 mL di tampone freddo di cacodilate di sodio.
3. Preparare una soluzione DAB fresca 1x (3,33 mL di soluzione cacodylate da 0,3 M: 10 -L del 30% H₂O₂ - 5,67 mL di acqua fredda - 1 mL 10x soluzione DAB).
4. Aggiungere 500 l della soluzione DAB 1x appena preparata (passaggio 2.3) e incubare sul ghiaccio per circa 5-45 min fino a quando una macchia marrone chiaro è visibile sotto un microscopio luminoso invertito (Figura 1A).
5. Rimuovere delicatamente la soluzione DAB e risciacquare tre volte con 1 mL di tampone freddo di cacodialato di sodio per 10 min ciascuno.
6. Utilizzare un microscopio invertito a contrasto di fase (o un microscopio luminoso a campo luminoso) per visualizzare la colorazione DAB a un ingrandimento di 100x o superiore. Utilizzare una penna marker per contrassegnare la parte inferiore del vetro in cui si trova l'area di interesse (ROI) (Figura 1B,C).

3. Preparazione del campione per il blocco EM

1. Eseguire la coltura cellulare e la colorazione DAB come descritto nei passaggi 2.1-2.6.
2. Dopo aver fissato i campioni con 1 mL del 2% ridotto OsO₄ per 1 h a 4 gradi centigradi.
   AVVISO: i fumi OsO₄ sono altamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata.
3. Preparare una nuova soluzione TCH (Tabella 1) durante il passaggio 3.2 e passare attraverso un filtro 0,22 m.
   AVVISO: i fumi TCH sono altamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata.
4. Rimuovere il fissativo e risciacquare tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a temperatura ambiente (RT).
5. Posizionare le cellule in 1 mL di soluzione TCH precedentemente preparata e filtrata per 20 min in RT.
6. Sciacquare le cellule tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuna a RT.
7. Esporre le cellule una seconda volta a 1 mL di 2% tetrossido di osmio in acqua distillata per 30 min a RT.
8. Rimuovere il fissativo e risciacquare tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a RT. Aggiungere 1 mL di 1% acetato di uranilo (acquoso), e lasciare peruna durante la notte a 4 gradi centigradi al buio.
9. Lavare le cellule tre volte in 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a RT.
10. Preriscaldare la soluzione di aspartazione di piombo di Walton (Tabella 1) in forno a 60 gradi centigradi per 30 min.
11. Macchiare le cellule con la soluzione di aspartate di piombo di Walton aggiungendo 1 mL della soluzione di aspartazione di piombo preriscaldato, e poi mettere in forno per 30 min a 60 gradi centigradi.
12. Sciacquare le cellule tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuna a RT.
13. Incubare in una serie graduata di 2-mL di etanoli (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) per 20 min ciascuno a RT.
14. Decantare l'etanolo e incubare per 30 min in 1 mL di 3:1 etanolo:low-viscosity incorporando miscela media a RT.
15. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 1:1 etanolo: basso-viscosità incorporando mezzo miscela. Incubare per 30 min a RT.
16. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 1:3 etanolo:low-viscosity incorporando mezzo miscela. Incubare per 30 min a RT.
17. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 100% a bassa viscosità incorporando il mezzo e incubare durante la notte.
18. Incorporare il campione in miscela di incorporamento a bassa viscosità al 100% e incubare per 24 h a 60 gradi centigradi.
19. Preparare sezioni spesse 90 nm utilizzando un ultramicrotome.
20. Osservare la griglia in TEM a 200 kV.

4. Sezionamento e montaggio seriale su coperchi rivestiti indio-tin-ossido per l'imaging SEM

1. Preparazione del substrato
   1. Pulire il vetro indium-tin-oxide (ITO)-rivestito di coperturalabbra (22 mm x 22 mm) da agitazione delicata in isopropanol per 30-60 s.
   2. Rimuovere i copricopertine, scolare l'isopropanolo in eccesso e lasciare in un ambiente privo di polvere fino a quando non è asciutto.
   3. Trattare i coperchi in vetro rivestito ITO con una scarica di bagliore utilizzando un rivestimento al plasma per 1 min.
      NOTA: L'attivazione del plasma conferisce una proprietà idrofila sulla superficie del substrato. Crea una pellicola d'acqua molto sottile sul substrato per prevenire la formazione di rughe nelle sezioni quando la sezione è attaccata al substrato.
   4. Inserire i coperchi in vetro rivestito ITO nel supporto del substrato e posizionarli nella barca del coltello.
2. Taglio del blocco campione e sezionamento seriale
   1. Inserire il blocco campione nel supporto campione dell'ultramicrotoma e impostarlo nel blocco di rifilatura.
   2. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare via tutta la resina in eccesso intorno alla posizione di destinazione (identificata nel passaggio 2.6, Figura 1D-G). La forma del quadrante del blocco deve essere trapezioo o rettangolare. Il bordo iniziale e il bordo finale devono essere assolutamente paralleli (Figura 1H,I).
   3. Inserire il supporto del campione sul braccio dell'ultramicrotoma e posizionare il coltello di diamante nel supporto del coltello. Inserire i coperchi del vetro ITO nel supporto nastro e bloccare il supporto con la maniglia (Figura 1J). Impostare il nastro portante nella barca coltello e riempire la barca coltello con acqua distillata filtrata (Figura 1K).
   4. Regolare la posizione del supporto con la diapositiva del coltello spingendo con attenzione la maniglia del supporto per impostare il bordo del vetro ITO vicino al coltello (Figura 1L).
   5. Dopo aver tagliato la sezione, interrompere il processo di sezionamento e aprire lentamente la vite di bloccaggio del tubo e drenare la barca ad acqua (velocità di flusso di una goccia d'acqua al secondo).
   6. Dopo aver completato il processo di raccolta del nastro, rimuovere il substrato con il manico del dispositivo di bloccaggio e asciugare il nastro (Figura 1M).

5. Imaging nel SEM e allineamento dello stack di immagini SEM

1. Montare il coperchio rivestito ITO su mozziconi di alluminio con nastro adesivo in carbonio. Sigillare la superficie di vetro e la superficie nello stub con nastro adesivo in carbonio, quindi rivestire con uno strato di carbonio spesso 10 nm (Figura 1N).
2. Osservare lo coverslip rivestito ITO in un SEM a emissione di campo a una bassa tensione di accelerazione di 5 kV e una distanza di lavoro adeguata per la raccolta efficiente di BSE.
3. Importare le immagini seriali nel software Image J (Fiji)¹³ utilizzando l'opzione di stack virtuale. Aprire un nuovo TrakEM¹⁴e importare lo stack di immagini in TrakEM. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere il menu di allineamento.
4. Quindi selezionare l'intervallo di immagini (dalla prima immagine all'ultima immagine). Completare l'allineamento automatico, salvare il set di dati allineato e scegliere Esporta per compilare un'immagine piatta dall'intervallo di immagini selezionato (dalla prima immagine all'ultima immagine). Infine, salvate i dati dell'immagine piatta in formato AVI nel menu principale Immagine J.
   NOTA: Filmato supplementare 1 e Filmato supplementare 2 mostrano rispettivamente la pila di immagini SEM e la pila di immagini ritagliate.

6. Segmentazione dei mitocondri ed ER da immagini seriali

1. Avviare il 3dmod nel software IMOD¹⁵ e aprire i file di immagine.
2. Nella finestra di ap, disegnare il contorno dei mitocondri e del ER utilizzando il pulsante centrale del mouse.
3. Per visualizzare il volume segmentato, aprire la finestra Vista modello (Filmatosupplementare 3 ).

Risultati

Nella Figura 1 vengono descritti la pianificazione e il flusso di lavoro per questo protocollo. Il protocollo richiede 7 giorni; tuttavia, a seconda del tempo dedicato all'imaging SEM, questo può aumentare. Per la trafezione cellulare, la confluenza delle cellule deve essere controllata in modo da non coprire la parte inferiore dell'intera piastra della griglia (Figura 1A). Un'alta densità cellulare potrebbe impedire l'identificazione della cellula di interesse durante il microscopio leg...

Discussione

Determinare la localizzazione cellulare di proteine specifiche a risoluzione di nanometri utilizzando EM è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari delle proteine. In generale, ci sono due tecniche per studiare la localizzazione di una proteina bersaglio tramite EM. Una è la tecnica dell'immunogolda, che è stata utilizzata in EM dal 1960, e l'altra è una tecnica che utilizza tag geneticamente codificati di recente¹⁶. Le tecniche tradizionali di immunogold hanno impiegato particelle d'oro...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glutaraldeide	EMS	16200	Utilizzare solo in cappa
aspirante Paraformaldeide	EMS	19210	Utilizzare solo in cappa
aspirante Cacodilato di sodio	EMS	12300
Tetrossido di osmio 4 % soluzione acquosa	EMS	16320	Utilizzare solo in cappa aspirante
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultra-microtomo Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Acetato di uranile	EMS	22400	Sostanza chimica pericolosa
Citrato di piombo	EMS	17900
35mm Piastra vetrino coprioggetti a griglia	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Scaricatore di bagliore	Pelco	easiGlow
Formvar rivestito in carbonio Griglia	di rameTed Pella	01805-F
Acido cloridrico	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glicina	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidina (DAB)	SIGMA	D8001	Sostanza chimica pericolosa
30% Soluzione di perossido di idrogeno	Merck	107210
Esacianoferrato di potassio (II) triidrato	SIGMA	P3289
0,22 um filtro per siringa	Sartorius	16534
Tiocarbonildiidrazide	SIGMA	223220	Utilizzare solo in cappa aspirante
Idrossido di potassio	Fluka	10193426
Acido L-aspartico	SIGMA	A9256
Etanolo	Merck	100983
Microscopia elettronica a trasmissione	FEI	Tecnai G2
Vetrini coprioggetto rivestiti di ossido di indio e stagno (ITO) SPI		06489-AB	vetro fragile
Isopropanolo	Fisher Bioreagenti	BP2618-1
Coltello diamantato	Leica	AT-4
Microscopia ottica inveted	Nikon	ECLipse TS100
Microscopia elettronica a scansione	Zeiss	Auriga