Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

Sommario

I batteri codificano diversi meccanismi per impegnarsi in una competizione interbatterica. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla cultura per caratterizzare le interazioni competitive tra gli isolati batterici e come influenzano la struttura spaziale di una popolazione mista.

Abstract

Questo manoscritto descrive un saggio di coincubazione basato sulla cultura per rilevare e caratterizzare le interazioni competitive tra due popolazioni batteriche. Questo metodo utilizza plasmidi stabili che consentono a ogni popolazione di essere etichettata in modo differenziale con capacità di resistenza agli antibiotici distinte e proteine fluorescenti per la selezione e la discriminazione visiva di ogni popolazione, rispettivamente. Qui, descriviamo la preparazione e la coincubazione dei ceppi Vibrio fischeri concorrenti, l'imaging a microscopia a fluorescenza e l'analisi quantitativa dei dati. Questo approccio è semplice, produce risultati rapidi e può essere utilizzato per determinare se una popolazione uccide o inibisce la crescita di un'altra popolazione e se la concorrenza è mediata attraverso una molecola diffusiva o richiede un contatto diretto tra le cellule. Poiché ogni popolazione batterica esprime una diversa proteina fluorescente, l'analizzatore consente la discriminazione spaziale delle popolazioni concorrenti all'interno di una colonia mista. Anche se i metodi descritti vengono eseguiti con il batterio simbiotico V. fischeri utilizzando condizioni ottimizzate per questa specie, il protocollo può essere adattato per la maggior parte degli isolati batterici culturable.

Introduzione

Questo manoscritto delinea un metodo basato sulla cultura per determinare se due isolati batterici sono in grado di interazioni competitive. Quando si studiano le popolazioni miste, è importante valutare la misura in cui gli isolati batterici interagiscono, in particolare se gli isolati competono direttamente attraverso meccanismi di interferenza. La competizione di interferenza si riferisce alle interazioni in cui una popolazione inibisce direttamente la crescita o uccide una popolazione concorrente¹. Queste interazioni sono importanti da identificare perché possono avere effetti profondi sulla struttura e sulla funzione di una comunità microb....

Protocollo

1. Preparare le tensioni per Coincubation

1. Scegli un ceppo di riferimento appropriato che servirà come bersaglio per la competizione batterica durante il saggio di coincubation. Vedere Discussione per le procedure consigliate per la selezione di un ceppo di riferimento e il modo in cui il ceppo di riferimento influirà sui risultati. In questo protocollo, ceppo V. fischeri ES114 servirà come ceppo di riferimento.
2. Determinazione dei metodi di selezione e screening da utilizzare per distinguere tra gli isolati nella coincubation
   1. Tipicamente, trasformare ceppi con plasmidi stabili contenenti diversi ....

Risultati

Al fine di valutare le interazioni competitive tra popolazioni batteriche, è stato sviluppato e ottimizzato un protocollo di analisi della coincubation per V. fischeri. Questo metodo utilizza plasmidi stabili che codificano geni di resistenza agli antibiotici e proteine fluorescenti, consentendo la selezione differenziale e la discriminazione visiva di ogni ceppo. Analizzando i dati raccolti dal saggio di coincubation, è possibile identificare l'esito competitivo di un'interazion.......

Discussione

L'analisi della coincubazione descritta sopra fornisce un potente metodo per scoprire la concorrenza interbatterica. Questo approccio ha permesso l'identificazione della concorrenza intraspecifica tra gli isolati di V. fischeri e la caratterizzazione del meccanismo competitivo¹⁹. Anche se il metodo descritto è stato ottimizzato per il batterio marino V. fischeri, può essere facilmente modificato per ospitare altre specie batteriche tra cui isolati clinici e ambientali. È importan.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Fisher	05-408-129
10 μ L pipetta
100 μ L pipetta
300 μ L pipetta
10 μ L pipetta
20 μ L pipetta
200 μ L pipetta
1.000 μ L pipetta
piastre a 24 pozzetti	Fisher	07-200-84	sterile con coperchio
piastre a 96 pozzetti	VWR	10062-900	sterile con coperchio
Calcolatrice
Cloramfenicolo	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in etanolo); concentrazione finale in terreno (2 μ g/mL LBS)
Microscopio da dissezione a fluorescenza con fotocamera e software
Pinze	Fisher	08-880
Kanamicina Solfato	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in acqua, filtro sterilizzato); concentrazione finale in terreno (1 μ g/mL LBS)
Membrana in nitrocellulosa (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0,22 μ m membrana in nitrocellulosa (confezione da 100)
piastre di Petri	Fisher	FB0875713	sterili con coperchio
Spettrofotometro
Cuvette semi-micro	VWR	97000-586
TipOne 0,1-10 μ L sistema di avviamento	USA Scientific	1111-3500	10 rack
TipOne 200 μ L sistema di avviamento	USA Scientific	1111-500	10 cestelli
TipOne 1000 μ Sistema di avviamento a L	USA Scientific	1111-2520	10 rack
Vortex
Name	Company	Catalog Number	Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7,5)			50 mL di tampone madre 1 M (62 mL di HCl, 938 mL di acqua deionizzata, 121 g di base Trizma)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Aggiungere solo per piastre)
Acqua			950 mL di
cloruro di sodio	Fisher	S640-3	20 g
Triptone	Fisher	BP97265	10 g
Estratto di lievito	Fisher	BP9727-2	5 g

multicanalemulticanalemulticanalemonocanalemonocanalemonocanalemonocanaledi imaging deionizzata