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Articolo metodologico

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

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DOI:

10.3791/59760

⸱

10 marzo 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Abstract

Oltre agli mRNA lineari, molti geni eucarioti generano RNA circolari. La maggior parte degli RNA circolari sono generati dall'unendo un sito di giunzione di 5' con un sito di giunzione a monte a monte di 3' all'interno di un pre-mRNA, un processo chiamato back-splicing. Questa circolarizzazione è probabilmente aiutata da strutture secondarie nel pre-mRNA che portano i siti di giunzione in stretta vicinanza. Nei geni umani, si pensa che gli elementi alu promuovano queste strutture secondarie dell'RNA, poiché gli elementi Alu sono abbondanti e presentano complementarità di base tra loro quando sono presenti in direzioni opposte nel pre-mRNA. Qui, descriviamo la generazione e l'analisi di grandi elementi Alu contenenti geni reporter che formano RNA circolari. Attraverso l'ottimizzazione dei protocolli di clonazione, è possibile generare geni reporter con una lunghezza di inserto fino a 20 kb. La loro analisi negli esperimenti di co-trasfezione consente l'identificazione di fattori normativi. Pertanto, questo metodo può identificare le sequenze di RNA e i componenti cellulari coinvolti nella formazione circolare dell'RNA.

Introduzione

RNA circolari
Gli RNA circolari (circRNA) sono rna a singolo spiaggiamento chiusi covalentmente chiusi che sono espressi nella maggior parte degli organismi. Vengono generati unendo un sito di giunzione a un downstream 5' a un sito di giunzione a monte 3', un processo chiamato back-splicing (Figura 1A)1. Le sequenze nel pre-mRNA che presentano una base complementare fino a 30-40 nt portano i siti di giunzione posteriore in un corretto allineamento per la formazione di circRNA2. Nell'uomo, gli elementi Alu 1, che rappresentano circa l'11% del genoma3, formano ampie strutture di RNA a doppio filamento nel pre-mRNA a causa della loro auto-complementarità4,5 e quindi promuovono la formazione di circRNA1.

Attualmente, sono state descritte tre funzioni principali dei circRNA. Alcuni circRNA legano microRNA (miRNA) e attraverso il sequestro agiscono come spugne di miRNA6. I circRNA sono stati implicati nella regolazione trascrizionale e post trascrizionale, attraverso la concorrenza con la giunzione lineare7 o la modulazione dell'attività del fattore di trascrizione8. Infine, i circRNA contengono brevi cornici di lettura aperte e studi di prova di principio dimostrano che possono essere tradotti9,10. Tuttavia, la funzione della maggior parte dei circolrRNA rimane enigmatica. La maggior parte degli RNA circolari è stata rilevata utilizzando i metodi di sequenziamento di nuova generazione11. Analisi dettagliate di singoli geni utilizzando approcci RT-PCR mirati rivelano che un gran numero di RNA circolari rimane da scoprire12.

Uso dei geni dei reporter per analizzare l'elaborazione pre-mRNA
L'analisi dell'mRNA derivato dai costrutti di segnalazione del DNA trasinfezione in cellule è un metodo ben consolidato per studiare lo splicing pre-mRNA alternativo, che può essere applicato agli RNA circolari. In generale, l'eson alternativo, gli introni circostanti e gli estrusioni coniugali vengono amplificati e clonati in un vettore di espressione eucatra. Spesso, gli introni sono accorciati. I costrutti sono trasfettati in cellule eucariotiche e di solito analizzati da RT-PCR13,14. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per mappare i siti di giunzione regolamentare e i fattori di trans-azione negli esperimenti di co-trasfezione13,15,16,17,18. Inoltre, la generazione di minigeni proteici ha permesso lo screening di sostanze che cambiano lo splicing alternativo19,20.

Il metodo è stato applicato agli RNA circolari. Attualmente, almeno 12 backbone minigene sono stati descritti nella letteratura e sono riassunti nella tabella 1. Ad eccezione del sistema di espressione basato sul tRNA21,22, tutti dipendono dai promotori di polimerasi II. Qui, descriviamo un metodo per generare minigeni di reporter umani per determinare i fattori di cis e trans-azione coinvolti nella generazione di RNA circolari. Una panoramica del metodo che utilizza sequenze di un reporter genepubblicato 23 è illustrata nella Figura 1.

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Protocollo

1. Progettazione dei costrutti

  1. Utilizzare il browser genoma UCSC24 per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione circolare di RNA e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i numeri di forza per l'amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi.
  2. Incollare la sequenza circolare dell'RNA (Supplemental Figure 1 è una sequenza di prova) in https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start e selezionare l'organismo giusto. Inviare la sequenza e passare alla visualizzazione browser, ridurre 1.5x o, a seconda dei casi (Figura 2A).
    NOTA: la sequenza di ricerca viene visualizzata nella riga superiore (Figura 2A, 1). A seconda dell'ordine degli esoni nell'RNA circolare, BLAT non collegherà tutti gli esoni. In questo esempio, exon 12 (Figura 2A, 4) non è connesso a 11 ( Figura2A, 2, 3), perché exon 12 è a monte di esone 11 nella sequenza circolare di RNA ( Figurasupplementare 1). Gli elementi ripetitivi si trovano nella traccia "ripeti masker", indicata da scatole, dove il colore nero-grigio indica la conservazione evolutiva (Figura 2A, 5).
  3. Passare il mouse sugli elementi ripetitivi per identificarne il sottotipo in una finestra mobile. Gli elementi Alu sono nella linea SINE (elemento nucleare breve intervallato). Utilizzare il pulsante 'default tracks' sotto la finestra per reimpostare il browser se si ottiene un'immagine diversa da quella della figura 2.
    NOTA: il mousingo degli esoni nel display genico genera una finestra con numeri esoni generati al computer. Questi numeri non corrispondono alla numerazione degli esoni stabilita nella letteratura e cambiano anche tra le isoformi.

2. Selezionare la sequenza da clonare in un vettore di espressione

  1. Scarica la sequenza di DNA mostrata nella finestra andando su Visualizza il DNA sulla linea superiore del browser del genoma UCSC. In Opzione di formattazione sequenza, selezionare Opzioni maiuscole/minuscole estese/colore.
  2. Selezionare il caso di default come Inferiore e selezionare Attiva/Disattiva caso per riferimento NCBI. Selezionare sottolineato, grassetto e corsivo per Controllo repeat . Fare clic su Invia. Ci saranno esoni come lettere maiuscole e introni come lettere minuscole. Controllare i bordi di eson/intron.
  3. In questo esempio è presente una sequenza 'ccctttacCTTTT', che indica che il browser mostra il complemento inverso. In questo caso, tornare indietro e selezionare la casella di complemento inverso fino a visualizzare i bordi di exon intron corretto (agEXONgt), in questo esempio AAAAAGgtaaaggg.
  4. Copiare il file con l'orientamento corretto (gli esoni interni sono circondati da ag... gt) in un documento di elaborazione testi ed evidenziare gli esoni (Figura supplementare 2).
    NOTA: In questo esempio, il frammento genomico che comprende esoni 9-12 è di circa 24 kb e quindi troppo grande per essere amplificato dal DNA genomico. Pertanto, ogni esonio circondato da circa 1 kb regione intronica è singolarmente amplificato e questi quattro frammenti sono assemblati in un vettore di clonazione.
  5. Selezionare i frammenti da amplificare (esone - 500 nt intron). Assicurarsi che l'intron non inizi o termini in una regione ripetitiva, poiché i primer di queste regioni non amplificano sequenze specifiche. Le aree selezionate sono illustrate nella Figura 2Be le relative sequenze sono illustrate nella figura supplementare 3.
    NOTA: In generale, più grandi sono i costrutti, più difficile sarà la clonazione. I frammenti possono essere assemblati sia passo saggio (cioè, esone 9 è combinato con il vettore e nel passo successivo exon 10 viene introdotto in questo costrutto tramite clonazione fino a quando tutti gli esoni sono a posto), o in alternativa, tutti i frammenti vengono assemblati contemporaneamente. Un approccio graduale funziona sempre ma richiede più tempo. Un assemblaggio simultaneo non sempre funziona e dipende da quanto bene i singoli frammenti possono essere amplificati dal DNA genomico e dalle dimensioni complessive del costrutto. Quindi di solito iniziamo con entrambi gli approcci contemporaneamente.

3. Progettare i primer per la clonazione

  1. Utilizzare uno strumento Web (https://nebuilder.neb.com/#!/) per progettare le prime rinportatrici per la clonazione. Ad esempio, immettere i frammenti 9, 10, 11 e 12 e la sequenza vettoriale (Figura supplementare 3) a questo strumento.
  2. Per la sequenza vettoriale, aggiungere il sito di inserimento come ultimo nucleotide e successivamente aggiungere i frammenti. Poiché la numerazione dei vettori non inizia con un determinato sito di inserimento, il sito di inserimento nel vettore si trova e la parte a valle viene inserita davanti alla sequenza a monte. In questo esempio gli inserti iniziano subito dopo il sito HindIII [AAGCTT] e terminano subito dopo il sito PmeI [GTTTAAAC] di pcDNA3.1. La sequenza da cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc è incollato davanti alla posizione 1 nella sequenza pcDNA3.1 (gttgctggtgtttttcc ...).
  3. Regolare i primer se i loro punti di fusione sono più di 4 gradi centigradi di distanza, in quanto non funzioneranno in amplificazione. L'assemblaggio dei frammenti e delle sequenze di primer progettate è illustrato nella figura supplementare 4. I Primer per la clonazione possono anche essere progettati manualmente25.

4. Rilevamento PCR e amplificatore

  1. Reazione PCR standard: fare un mix di reazione per un volume totale di 50 L per reazione. Di seguito è riportata la ricetta per una reazione utilizzando la polimerasi 1:
    10 L di 5 volte buffer di reazione
    1 - L di 10 mm dNTP
    2,5 ll di 10 M di Primer in avanti
    2,5 ll di 10 M Primer inverso
    0,5 litri di polimerasi 1
    32,5 l'l di Nuclease free H2O
    1. Se si desidera, aggiungere 10 L di 5 volte GC Enhancer se il prodotto ha un elevato contenuto di GC; fare un mix separato contenente GC Enhancer per testare la reazione PCR.
  2. Aliquota 49 -L della miscela in tubi PCR per campione di reazione.
  3. Aggiungere 1 l' di DNA alla PCR, la quantità varia da 10 pg a 1 ng.
  4. Abbassare i campioni per rimuovere i residui dai lati e metterli in una macchina PCR. Utilizzare la stessa macchina e gli stessi punti della macchina quando si ottimizzano le condizioni PCR.

5. Ottimizzazione per frammenti di DNA più lunghi per l'uso di diverse polimerasi

  1. Temperatura
    1. Ottimizzare la polimerasi 2 a lungo raggio.
      1. Utilizzare una temperatura di denaturazione più bassa (Polymerase 1: 98 gradi C, Polimerasi 2: 94 gradi centigradi).
      2. Utilizzare un tempo di denaturazione più lungo (Polymerase 1: 10 s, Polymerase 2: 30 s).
      3. Utilizzare un tempo di analising più lungo (Polymerase 1: 30 s, Polymerase 2: 60 s).
      4. Utilizzare un tempo di estensione più lungo (Polymerase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).
      5. Utilizzare una temperatura di estensione inferiore (Polymerase 1: 72 s, polimerasi 2: 65 gradi centigradi).
      6. Utilizzare una temperatura di annealing di 5 gradi sotto il Tm dei primer.
    2. Ottimizzare le concentrazioni di primer (5 x da meno a 5 volte in più rispetto alla concentrazione originale del primer). Ottimizzare le concentrazioni di DNA da 10 pg a 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.
    3. Come esempio di un programma PCR per amplificare una dimensione del prodotto di 15 kb utilizzando Polymerase 2, eseguire una denaturazione iniziale a 94 gradi centigradi per 30 s, la denaturazione del DNA a 94 s seguita dall'annealing a 58 gradi centigradi per 30 s, e l'estensione del DNA a 65 s per 12 min 30 s. Eseguire un'estensione finale a 65 gradi centigradi per 10 min con una presa finale di 4 gradi centigradi.
      NOTA: La temperatura di annessione (Ta) specifica per le primer determinata da calcoli di temperatura basati sul web specifici per ogni polimerasi. I tempi di estensione possono variare e devono essere ottimizzati se i frammenti sono maggiori di 10 kb.
  2. Tempi di estensione e concentrazioni di DNA
    1. Utilizzare tempi di estensione più lunghi per frammenti di DNA superiori a 6 kb: 1 min per 1 kb. I frammenti più lunghi dovrebbero usare meno DNA.
    2. Eseguire diluizioni di DNA per trovare la concentrazione ottimale del DNA per l'amplificazione, di solito da 1 pg a 1 ng per plasmidi o da 1 ng a 1 g per il DNA genomico.
      NOTA: Per la maggior parte della clonazione utilizzare la polimerasi 1, progettata fondendo il dominio di legame del DNA Sso7d in una polimerasi del DNA termostabile proprietario26. La polimerasi ha un basso tasso di errore e a causa del dominio Sso7d un'elevata processizia, necessaria per amplificare grandi frammenti genomici (10-15 kb). A causa di questa grande dimensione di frammento, l'assemblaggio enzimatico delle molecole di DNA27 viene utilizzato per l'inserimento nei vettori, in quanto questo metodo non richiede enzimi di restrizione. L'amplificazione di frammenti più lunghi di 15 kb diventa sempre più difficile con la polimerasi 1. Per l'amplificazione a frammento di grandi dimensioni utilizzare polimerasi 2 realizzata in piroccus-comela polimerasi di bozze fusa a Sso7d o il kit PCR a lungo raggio che dà, tuttavia, tassi di errore più elevati.

6. Purificazione dei prodotti PCR per la clonazione

  1. Eseguire metà dei prodotti PCR su gel di agarose dell'1% contenenti una macchia di acido nucleico intercalante (ad esempio, 1x GelGreen). Visualizza i gel macchiati su un transilluminatore lettore scuro. Questo DNA macchiato non è fedele alle dimensioni.
    NOTA: GelGreen intercala nel DNA, simile al bromuro di etidio, ma è eccitato dalla luce intorno a 500 nm (ciano), una lunghezza d'onda che non danneggia il DNA, che migliora notevolmente la clonazione.
  2. Parallelamente, eseguire metà dei prodotti PCR su un gel 1% che viene colorato post-esecuzione con bromuro di etidio (Figura 3A,B).
  3. Bande di accise della giusta dimensione dal gel colorato (passaggio 6.1) e isolano il DNA utilizzando un kit di pulizia gel e PCR. Nella deviazione dal suo protocollo standard, eluire il DNA solo in 20 - L di acqua doppia distillata, come di solito le concentrazioni di DNA sono basse.
  4. Prima della clonazione, controllare il DNA isolato su un gel di agarose per la concentrazione e l'integrità (Figura 3B). Puntare a un inserto molare 2:1 a un rapporto vettoriale. Quando si utilizzano più inserti, il rapporto è 2:2:2:1.

7. Assemblaggio del DNA e rilevamento dei cloni

NOTA: La clonazione viene eseguita utilizzando un kit di assemblaggio del DNA enzimatico, con piccole modifiche. L'assemblaggio viene eseguito per 60 min a 50 gradi centigradi e generalmente la gamma inferiore del DNA viene utilizzata per l'assemblaggio (20-100 fmol/20 - reazione l). L'intero mix di reazione viene aggiunto alle cellule chimiche competenti e le intere cellule placcate su una piastra di agar di 6 cm.

  1. Unire il vettore e l'inserto in un rapporto di 1:2 molare (20-500 fmol ciascuno) in 10 - L di acqua.
  2. Aggiungete 10 l di DNA Assembly Master Mix.
  3. Incubare i campioni per 60 minuti a 50 gradi centigradi.
  4. Successivamente, trasformare le celle competenti con la reazione di assemblaggio totale. Qui, utilizzare e. coli ceppo 1 cellule per i costrutti più brevi o E. coli ceppo 2 cellule per costrutti più lunghi o instabili. Le celle devono essere in un volume di 50.L.
  5. Scongelare le cellule sul ghiaccio e aggiungere 2 o più l del prodotto assemblato refrigerato alle celle competenti. Mescolare delicatamente il tubo 4-5 volte. Non vortice.
  6. Lasciare riposare il composto sul ghiaccio per 30 min.
  7. Scossa termica a 42 gradi centigradi per 30 s. Non mescolare.
  8. Trasferire il tubo di nuovo sul ghiaccio per 2 min.
  9. Aggiungere al tubo 950 l di supporto SOC a temperatura ambiente.
  10. Incubare il tubo di reazione a 37 gradi centigradi per 60 min. Agitare vigorosamente (300 giri/m).
  11. Piastre di selezione calde con l'antibiotico appropriato durante l'incubazione a 37 gradi centigradi.
  12. Pellet le cellule attraverso la centrifugazione (10.000 x g, 30 s) e piastre fuori 1/4 e 3/4 di cellule su due piastre di selezione e incubare a 37 gradi durante la notte.

8. Convalida dei cloni

  1. Utilizzare la colonia PCR, impiegando primer PCR che coprono i siti diassemblaggio( Figura 1C) per il rilevamento.
  2. Prendi uno stuzzicadenti sterile e tocca una singola colonia batterica.
  3. Toccare il fondo di un tubo PCR con lo stuzzicadenti che ha la colonia e poi strisciare lo stuzzicadenti su una piastra antibiotica agar, incubare la piastra striata a 37 gradi centigradi o temperatura ambiente per i costrutti sensibili durante la notte.
  4. Sovrapporre il tubo PCR toccato con la colonia con un mix PCR contenente i primer di rilevamento. Questi sono progettati utilizzando primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Il programma ha la possibilità di forzare la progettazione di primer attraverso una sequenza definita utilizzando i segni "[ccc]" per selezionare i primer attraverso la giunzione di assieme. Il DNA dei ceppi positivi viene isolato e verificato mediante sequenziamento.

9. Analisi dell'RNA circolare che esprime i geni dei reporter

  1. Per l'analisi, i geni dei reporter transfecti nelle cellule eucariotiche. Qui, utilizzare le cellule HEK293 (ATTC #CRL-1573) in quanto danno alta efficienza di trasfezione. Per risparmiare sui costi, utilizzare soluzioni PEI (polyethyleneimine).
  2. Per la soluzione PEI, sciogliere l'idrocloruro lineare in polietileneimine (PEI) a 1 mg/mL in acqua a basso pH, pH 2. Porta il pH a 7 con NaOH. Filtro sterile con filtri da 0,22 m e conservato a 4 gradi centigradi.
  3. Dividi le cellule in sei pozzi (circa 150.000 cellule per pozzo) e lasciale crescere durante la notte nel 10% di FBS nei supporti DMEM.
  4. Aliquota 1 g del gene reporter in un tubo sterile e aggiungere 200 -L di sterile filtrato 150 mM NaCl. Mescolare con il DNA vortice.
  5. Aggiungere la soluzione PEI a questo mix e vortice, centrifugare brevemente per raccogliere campioni sul fondo del tubo. Utilizzare un rapporto di 1 g di DNA per 3 L di PEI.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 10 min e quindi aggiungere direttamente alle cellule HEK 293.
  7. Incubare le cellule HEK293 a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2,durante la notte.
  8. Isolare l'RNA per RT-PCR tramite un kit di isolamento dell'RNA.

10. Trattamento RNase R per rimuovere gli RNA lineari

  1. Utilizzare 10 g di RNA totale in un tubo privo di RNase.
  2. Aggiungeteall'RNA10 L di 10x buffer RNase R (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl 2).
  3. Aggiungere RNase R all'RNA (1 ol - 20U).
  4. Aggiungete 1 l' di glycol blu all'RNA e portate il volume fino a 100 l un po' di acqua sterile.
  5. Incubare campioni a 37 gradi centigradi per 30 min.
  6. Aggiungere 100 l di fenolo/cloroformio e vortice per 1 min.
  7. Centrifuga a 21.000 x g per 1 min a fasi separate.
  8. Prendere il supernatante (fase acquosa) e aggiungere 1 volume (circa 80 -L di cloroformio).
  9. Vortice per 1 min, e quindi centrifugare per 1 min a fasi separate.
  10. Prendi supernatante, aggiungi 1:10 vol KAc e 2,5 vol etanolo, e precipita a -20 gradi centigradi per 1-4 h. Centrifughe a 4 gradi centigradi per 30 min a piena velocità (21.000 x g). Ci sarà un piccolo pellet blu nella parte inferiore.
  11. Rimuovere il supernatante e lavare con l'80% di etanolo. Lasciare asciugare l'aria per 5 min a temperatura ambiente e sciogliere in 10 acqua l.

11. Analisi RT-PCR

  1. Utilizzare 1 g di RNA per reazione RT.
  2. Fare mix di reazione per un volume totale finale di 20 -L per reazione. Per una sola reazione, utilizzare 1 L di 10 mM dNTP, 1 -L di 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 L di 5 volte Buffer First-Strand e 0,5 L di Trascrizione Inversa.
  3. Aliquota 6,5 l di miscela di reazione in nuovi tubi PCR.
  4. Mescolare fino a 5 primer in un unico mix. Tuttavia, alcuni primer possono vari accoppiamenti con altri primer nel PCR (Figura 5). Le sequenze di Primer sono nella tabella 2. Usiamo abitualmente primer esone-giunzione specifici per geni, ma è anche possibile l'innesco con hexamer casuali.
  5. Aggiungere l'insulto di 10 M al tubo di reazione RT desiderato.
  6. Aggiungere 1 g di RNA al tubo di reazione PCR.
  7. Aggiungere RNase-free H2O fino a un volume totale di 20 .L.
  8. Girare i tubi verso il basso per rimuovere i residui sul lato dei tubi e posizionare in termociclore.
  9. Eseguire la reazione RT in termociclore a 50 gradi centigradi per 50 minuti.
  10. Conservare RT cDNA a -20 gradi centigradi o procedere alla reazione PCR.

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Risultati

I geni dei reporter consentono la determinazione di fattori regolatori che influenzano la formazione circolare dell'RNA. Tuttavia, questi geni reporter sono grandi e contengono elementi ripetitivi che spesso rendono instabili i costrutti del DNA. A causa delle loro grandi dimensioni, è spesso necessario eliminare parti degli introni, che si ottiene amplificando i pezzi genomici contenenti gli esoni e le parti intronica laterali più piccole. Questi pezzi di DNA sono assemblati enzimaticamente, permettendo la costruzione s...

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Discussione

In generale, gli RNA circolari sono bassi abbondanti1, il che complica lo studio della loro funzione e formazione. Simile agli RNA lineari13, l'uso di minigeni reporter permette l'identificazione di cis e fattori trans-agire che regolano la formazione di RNA circolari. Pertanto, questo approccio genera ipotesi che possono essere ulteriormente testate utilizzando i geni endogeni.

Il passo più critico è la progettazione del gene reporter. L'assembl...

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Dichiarazioni

Niente da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa DoD grant A-180075. Stefan Stamm ringrazia Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin è stata supportata dal DAAD, programma di scambio accademico tedesco, Justin R. Welden ha ricevuto il premio Max Steckler Award dell'Università del Kentucky.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(PEI) CloridratoPolysciences24765-1
Strumento di costruzioneNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.Clare Chemical Research
Kit di assemblaggio del DNA enzimaticoNEBE2621S
Kit di pulizia per gel e PCRPromegaA9282
Glyco BlueThermo FisherAM9516
pcDNA3.1 sito diclonaggio Sitodi policlonaggiohttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polimerasi 1NEBM0491LQ5 DNA polimerasi
Polimerasi 2Biorad1725310Polimerasi a lungo raggio (NEB), iproof (BioRad)
Polimerasi 2Qiagen206402Kit per polimerasi a lungo raggio Qiagen
a trascrittasi inversaThermo Fisher18080044
Life Technologies12183025Ambion di Life Technologies
RNAse RLucigenRNR07250Epicentro/Lucigeno
Cellule stabilie competenti NEBC3040HCellule stabili NEB
Batteri di clonazione standardNEBC2988JNEB5-alpha strumento Web competente
per la progettazione di primerNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Calcoli di temperatura basati sul WebNEBhttps://tmcalculator.neb.com/#!/main
Kit di isolamento dell'RNA

Riferimenti

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