Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

Sommario

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Abstract

Oltre agli mRNA lineari, molti geni eucarioti generano RNA circolari. La maggior parte degli RNA circolari sono generati dall'unendo un sito di giunzione di 5' con un sito di giunzione a monte a monte di 3' all'interno di un pre-mRNA, un processo chiamato back-splicing. Questa circolarizzazione è probabilmente aiutata da strutture secondarie nel pre-mRNA che portano i siti di giunzione in stretta vicinanza. Nei geni umani, si pensa che gli elementi alu promuovano queste strutture secondarie dell'RNA, poiché gli elementi Alu sono abbondanti e presentano complementarità di base tra loro quando sono presenti in direzioni opposte nel pre-mRNA. Qui, descriviamo la generazione e l'analisi di grandi elementi Alu contenenti geni reporter che formano RNA circolari. Attraverso l'ottimizzazione dei protocolli di clonazione, è possibile generare geni reporter con una lunghezza di inserto fino a 20 kb. La loro analisi negli esperimenti di co-trasfezione consente l'identificazione di fattori normativi. Pertanto, questo metodo può identificare le sequenze di RNA e i componenti cellulari coinvolti nella formazione circolare dell'RNA.

Introduzione

RNA circolari
Gli RNA circolari (circRNA) sono rna a singolo spiaggiamento chiusi covalentmente chiusi che sono espressi nella maggior parte degli organismi. Vengono generati unendo un sito di giunzione a un downstream 5' a un sito di giunzione a monte 3', un processo chiamato back-splicing (Figura 1A)¹. Le sequenze nel pre-mRNA che presentano una base complementare fino a 30-40 nt portano i siti di giunzione posteriore in un corretto allineamento per la formazione di circRNA². Nell'uomo, gli elementi Alu ¹, che rappresent....

Protocollo

1. Progettazione dei costrutti

1. Utilizzare il browser genoma UCSC²⁴ per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione circolare di RNA e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i numeri di forza per l'amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi.
2. Incollare la sequenza circolare dell'RNA (Supplemental Figure 1 è una sequenza di prova) in https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start e selezionare l'organismo giusto. Inviare la sequenza e passare alla visualizzazio....

Risultati

I geni dei reporter consentono la determinazione di fattori regolatori che influenzano la formazione circolare dell'RNA. Tuttavia, questi geni reporter sono grandi e contengono elementi ripetitivi che spesso rendono instabili i costrutti del DNA. A causa delle loro grandi dimensioni, è spesso necessario eliminare parti degli introni, che si ottiene amplificando i pezzi genomici contenenti gli esoni e le parti intronica laterali più piccole. Questi pezzi di DNA sono assemblati enzimaticamente, permettendo la costruzione s.......

Discussione

In generale, gli RNA circolari sono bassi abbondanti¹, il che complica lo studio della loro funzione e formazione. Simile agli RNA lineari¹³, l'uso di minigeni reporter permette l'identificazione di cis e fattori trans-agire che regolano la formazione di RNA circolari. Pertanto, questo approccio genera ipotesi che possono essere ulteriormente testate utilizzando i geni endogeni.

Il passo più critico è la progettazione del gene reporter. L'assembl.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(PEI) Cloridrato	Polysciences	24765-1
Strumento di costruzione	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.	Clare Chemical Research
Kit di assemblaggio del DNA enzimatico	NEB	E2621S
Kit di pulizia per gel e PCR	Promega	A9282
Glyco Blue	Thermo Fisher	AM9516
pcDNA3.1 sito di	clonaggio Sito		di policlonaggiohttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polimerasi 1	NEB	M0491L	Q5 DNA polimerasi
Polimerasi 2	Biorad	1725310	Polimerasi a lungo raggio (NEB), iproof (BioRad)
Polimerasi 2	Qiagen	206402	Kit per polimerasi a lungo raggio Qiagen
a trascrittasi inversa	Thermo Fisher	18080044
	Life Technologies	12183025	Ambion di Life Technologies
RNAse R	Lucigen	RNR07250	Epicentro/Lucigeno
Cellule stabili	e competenti NEB	C3040H	Cellule stabili NEB
Batteri di clonazione standard	NEB	C2988J	NEB5-alpha strumento Web competente
per la progettazione di primer	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Calcoli di temperatura basati sul Web	NEB		https://tmcalculator.neb.com/#!/main

Kit di isolamento dell'RNA