La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.
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Articolo metodologico
Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l'ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l'accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all'interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell'RNA all'interno delle cellule. Qui, mostriamo l'importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.
Introduzione
Lo splicing dell'RNA è uno dei passi cruciali nell'espressione genica, catalizzata da un grande complesso di ribonucleoproteina chiamato slicsome. In totale, più di 150 proteine e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) sono integrati nello spliceosome nelle diverse fasi del percorso di giunzione. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA stanno partecipando alla giunzione dei principali introni GU-AG. Questi snRNA si uniscono allo spliceo come piccole particelle di ribonucleoproteina nucleare preformate (snRNP) che contengono snRNA, sette proteine Sm associate allo snRNA (o alle proteine Like-Sm, che si associano allo snRNA U6) e 1-12 proteine specifiche per ogni snRNP.
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Protocollo
1. Preparazione di snRNA per microiniezione
- Preparare un modello di DNA contenente la versione a lunghezza intera o troncata/mutata di snRNA da PCR utilizzando una seguente configurazione PCR: 98 C per 60 s, 98 s per 15 s, 68 gradi C per 30 s, 72 s per 1 min, 98 S per 15 s per 35x e 72 gradi centigradi per 5 min.
- Il primer in avanti deve contenere una sequenza promotore per la trascrizione in vitro appena a monte del primo nucleotide trascritto. Amplifica la sequenza di snRNA U2 usando il primer in avanti contenente il promotore T7 e il primer inverso, che termina con l'ultimo nucleotide trascritto (vedi Tabella dei materiali per i....
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Risultati
Per monitorare la localizzazione dello snRNA e il ruolo del sito di legame Sm nel targeting del corpo di Cajal, abbiamo preparato un modello di DNA contenente il promotore T7 e il snRNA U2 o U2 a piena lunghezza che mancano i sette nucleotidi (AUUUUUGUG) che formano il sito di legame Sm. gli snRNA sono stati trascritti in vitro, isolati e mescolati con dextran-70kDa accoppiato a TRITC. Abbiamo microiniettato la miscela contenente snRNA trascritto in vitro nel nucleo o il citoplasma delle cellule HeLa.
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Discussione
Abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per determinare sequenze importanti per la localizzazione del snRNA nei corpi nucleari di Cajal. Grazie alla rapida e piuttosto semplice preparazione degli RNA etichettati (preparazione del modello di DNA da PCR seguita dalla trascrizione in vitro) il metodo offre un'analisi efficace di come le varie sequenze contribuiscono alla localizzazione dell'RNA. In tempi relativamente brevi, siamo stati in grado di analizzare dieci diverse eliminazioni o sostituzioni dello.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (18-10035S), dal National Sustainability Program I (LO1419), dal sostegno istituzionale (RVO68378050), dal Fondo europeo di sviluppo regionale (C..02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e dall'Agenzia Università Charles (GAUK 134516). Riconosciamo inoltre lo strumento Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportato da sovvenzioni (Czech-Bioimaging - LM2015062).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Concentrazione di riserva 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio - alto | Sigma-Aldrich | D5796 | Contenente 4,5 g⁄ L D-glucosio, fenolo rosso e antibiotici |
| FemtoJet express Iniettore | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Ago per microiniezione da 0,5 &; m interno e 0,7 µ m diametro esterno |
| Fluoromont G con DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glicogeno | ThermoFisher | AM9510 | Concentrazione di riserva 5 mg/mL |
| Vetrini coprioggetti in vetro grigliato | Ibidi | 10817 | Vetrini coprioggetti con griglia, nessuna esperienza diretta con loro |
| InjectMan NI 2 Micromanipolatore | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G analogo del cappuccio trimetilato | Jena Bioscience | NU-853-1 | Concentrazione di riserva 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Kit di trascrizione | ThermoFisher | AM1354 | |
| Occhiali di copertura per microscopio 12 mm, n. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | Per lavori di routine |
| Occhiali di copertura per microscopio 12 mm, n. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | Per alte immagini di risoluzione |
| Microscopio DeltaVision | GE Healthcare | Per l'acquisizione | |
| delle immagini Microscopio DMI6000 | Leica | Per microiniezione | |
| Soluzione di paraformaldeide al 32% Grado EM | EMS | 15714 | Disciolto in TUBI alla concentrazione finale 4% |
| Fenolo:Cloroformio 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primer per l'amplificazione U2: Avanti: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Inverso: 5&acuto; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT | Sigma-Aldrich | T7 sequenza promotore in corsivo | |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Concentrazione madre 40 mM |
| Tetrametilrodamina isotiocianato destrano 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Disciolto in acqua, concentrazione madre 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Disciolto in acqua, concentrazione madre 10% |
Riferimenti
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.
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Ristampe e permessi
