Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.
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Articolo metodologico
Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cultura primaria dei neuroni è una tecnica essenziale nel campo delle neuroscienze. Per ottenere approfondimenti meccanicistici nel cervello, è essenziale avere un robusto modello in vitro che può essere sfruttato per vari studi di neurobiologia. Anche se le colture neuronali primarie (cioè le colture ippocampali a lungo termine) hanno fornito agli scienziati modelli, non rappresentano ancora completamente la complessità della rete cerebrale. Sulla scia di queste limitazioni, è emerso un nuovo modello usando le neurosfere, che assomiglia più in sé al tessuto cerebrale. Il presente protocollo descrive la placcatura di densità alte e basse di neuroni corticali e ippocampali misti isolati dall'embrione dei ratti Sprague Dawley del giorno embrionale 14-16. Questo permette per la generazione di neurosfere e la cultura dei neuroni primari a lungo termine come due piattaforme indipendenti per condurre ulteriori studi. Questo processo è estremamente semplice e conveniente, in quanto riduce al minimo diversi passaggi e reagenti precedentemente ritenuti essenziali per la coltura dei neuroni. Questo è un protocollo robusto con requisiti minimi che possono essere eseguiti con risultati raggiungibili e ulteriormente utilizzati per una varietà di studi relativi alle neuroscienze.
Introduzione
Il cervello è un intricato circuito delle cellule neuronali e non neuronali. Per anni, gli scienziati hanno cercato di ottenere informazioni su questo complesso meccanismo. Per farlo, i neuroscienziati inizialmente hanno fatto ricorso a varie linee cellulari basate sui nervi trasformate per le indagini. Tuttavia, l'incapacità di queste linee cellulari clonali di formare forti connessioni sinaptiche e assoni o dendriti adeguati ha spostato l'interesse scientifico alle colture neuronali primarie1,2. L'aspetto più eccitante della cultura neuronale primaria è che crea l'opportunità di osservare e manipolare i neur....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono animali sono state approvate dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali del CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Preparazione del reagente e dei supporti
- Soluzione polid-lysina (PDL): preparare soluzioni PDL a concentrazioni di 0,1 mg/mL in acqua deionizzata e conservare in 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Mezzo di dissociazione: A 1 L di acqua sterile, filtrata deionizzata, combinare i seguenti componenti nelle rispettive concentrazioni: cloruro di sodio (8 mg/mL), cloruro di potassio (0,4 mg/mL), fosfato di potassio monobasico (0....
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Risultati
In questo protocollo, è stata chiarita una semplice strategia in cui si ottengono densità di placcatura a cellule variabili da due diverse piattaforme di screening neurale. La figura 1A,B illustra l'aderenza delle cellule dopo 4 h di placcatura dei neuroni in cellule placcate ad alta e bassa densità, rispettivamente. Osservando la corretta aderenza dei neuroni, come mostrato nella Figura1, il mezzo di placcatura .......
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Discussione
Questo protocollo descrive che come alterando la densità di placcatura cellulare dei neuroni primari, si ottengono due piattaforme neuronali variabili. Anche se questo è un metodo semplice, ogni passo deve essere eseguita meticolosamente per ottenere i risultati desiderati. Altri metodi precedenti hanno segnalato colture di neuroni primari a lungo termine o culture della neurosfera. La maggior parte dei protocolli di coltura neuronale primaria hanno coinvolto la coltura dei neuroni ippocampali per 3-5 settimane, ma la ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'impianto per animali CSIR-IICB. G. D. ringrazia ICMR, J. K. e V. G. ringraziano DST Inspire, e D. M. ringrazia NOT, India per le loro borse di studio. S. G. riconosce gentilmente seRB (EMR/2015/002230) India per fornire sostegno finanziario.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti-Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Integratore senza siero | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubatore | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucosio | SDFCL | 38450-K05 | |
| Etanolo | Merck Millipore | 100983 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | IX83 Modello | |
| Formaldeide | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplemento | Gibco | 35050-061 | |
| GtXM IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXM IgG (H + L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Siero di Cavallo | HiMedia | RM10674 | |
| Acido cloridrico | Rankem | H0100 | |
| Cappa laminare | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle' s con Earle' s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscopio | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (piastra a 24 pozzetti, filtri cellulari e piastre a bassa aderenza) | BD Falcon | 353047, 352350 e 3471 | |
| Petridish da 90 mm | Himedia | PW001 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Poli-D-lisina | Millipore | A.003.E | |
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Merck | MI6M562401 | |
| Cloruro di sodio | Qualigem | 15918 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Modello | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0,25 % Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Riferimenti
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G.
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Ristampe e permessi
