Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.
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Articolo metodologico
Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chiarificazione della funzione di un gene comporta in genere il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi e dei ceppi di tipo selvaggio in cui il gene di interesse è stato interrotto. La perdita di funzione dopo l'interruzione genica viene successivamente ripristinata mediante l'aggiunta esogena del prodotto del gene interrotto. Questo aiuta a determinare la funzione del gene. Un metodo descritto in precedenza comporta la generazione di un ceppo Streptococcus mutans interrotto dal gene gtfC. Qui, viene descritto un metodo poco impegnativo per purificare il prodotto genico gtfC dal ceppo S. mutans appena generato dopo la rottura genica. Si tratta dell'aggiunta di una sequenza di codifica della polihistidina alla fine del gene di interesse, che consente una semplice purificazione del prodotto genetico utilizzando la cromatografia dell'affinità metallica immobilizzata. Non sono necessarie reazioni enzimatiche diverse da PCR per la modificazione genetica in questo metodo. Il ripristino del prodotto genetico mediante aggiunta esogena dopo la perturbazione genica è un metodo efficace per determinare la funzione genica, che può anche essere adattata a diverse specie.
Introduzione
L'analisi della funzione di un gene di solito comporta il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi di tipo selvaggio ai ceppi in cui il gene di interesse è stato interrotto. Una volta prodotto il ceppo dirompente genico, l'aggiunta esogena del prodotto genetico consente il ripristino funzionale.
Il metodo più comune per ottenere i prodotti genici purificati necessari per il successivo restauro è eseguendo un'espressione eterologa in Escherichia coli1. Tuttavia, l'espressione di proteine della membrana o di proteine di massa molecolari elevate è spesso difficile da usare in questo sistema1<....
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Protocollo
NOT: Generazione di S. mutans -gtfC, in cui l'intera area di codifica del gene gtfC viene sostituita con spcr, deve essere completata prima di eseguire questi protocolli. Fare riferimento all'articolo pubblicato per informazioni dettagliate sulla generazione5.
1. Progettazione di Primer
-
Preparare primer per la costruzione di S. mutans His-gtfC.
NOT: Le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo sono mostrate nella Tabella 1. Il metodo PCR di fusione in due f....
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Risultati
Figura 3 Mostra la dimensione di ogni amplificatore dal primo PCR (Figura 3A) e secondo PCR (Figura 3B). La dimensione di ogni amplificatore corrispondeva alla dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. La figura 4A mostra le colonie di S. mutans trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di agar BHI contenenti sp.......
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Discussione
La progettazione dei primer è il passo più critico del protocollo. Le sequenze dei primer gtfC-reverse e spcr-forward sono state determinate automaticamente in base alle sequenze sia della regione finale 3 di gtfC che della regione finale 5 di spcr. Ogni primer include 24 basi complementari che codificano un linker GS e una sequenza His-tag-coding nelle loro regioni 5'. L'interruzione delle sequenze normative native situate nelle regioni di fianco a monte può esse.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numeri di sovvenzione 16K15860 e 19K10471 a T. M., da 17K12032 a M. I., e da 18K09926 a N. H.) e dalla SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numero di sovvenzione 2018.09.10 n. 10).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Nippon Genetics | NE-AG02 | Per elettroforesi su gel di agarosio |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Sistema di coltura anaerobica |
| Anticorpo monoclonale Anti-His-Tag | MBL | D291-7 | coniugate HRP |
| Thermo Fisher Scientific | 23227 | Misurazione della concentrazione | |
| proteicaBrodo per infusione di cuore cerebrale | Becton, Dickinson | 237500 | Terreno di coltura batterica |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | Per la colorazione del biofilm |
| Unità di ultrafiltrazione centrifuga | Sartorius | VS2032 | Sostituzione del tampone e concentrazione proteica |
| Centrifuga | Kubota | 7780II | |
| Colonna cromatografica | Bio-Rad | 7321010 | Per IMAC |
| Morsetto a membrana per dialisi | Fisher marca | 21-153-100 | |
| Tubo per dialisi | As One | 2-316-06 | |
| DNA polimerasi | Takara | R045A | Sequenziamento del DNA DNA polimerasi ad alta fedeltà |
| Eurofins Genomics | |||
| Substrato ECL | Bio-Rad | 170-5060 | Per western blotting |
| EDTA (0,5 M pH 8,0) | Wako | 311-90075 | Preparazione del tampone Tris-EDTA |
| Elettroporazione cuvetta | Bio-Rad | 1652086 | 0,2 cm di spazio |
| Elettroporatore | Bio-Rad | 1652100 | |
| Soluzione EtBr | Nippon Gene | 315-90051 | Per l'elettroforesi su gel di agarosio |
| Taglierina per bande di gel | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel kit di estrazione | Nippon Genetics | FG-91202 | Estrazione del DNA da gel di agarosio |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | Per SDS-PAGE e western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Tampone di legame e preparazione del tampone di eluizione |
| Incubatore | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Impostazione della temperatura: 4 ° |
| C Incubatrice | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS Impostazione della | temperatura: 37 ° C |
| Filtro a membrana | Merck Millipore | JGWP04700 | 0,2 µ m diametro |
| Microcentrifuga | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| NaH2PO4· 2H2O | Wako | 192-02815 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Precipitazione del solfato di ammonio |
| Resina caricata con Ni | Bio-Rad | 1560133 | Per IMAC |
| Primer per PCR | Eurofins Genomics Standard proteico | su misura | |
| Bio-Rad | 161-0381 | Per SDS-PAGE e western blotting | |
| Apparato di filtrazione del solvente | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotici; utilizzare a 100 μ g/mL |
| Filtro per siringa sterile | Merckmillipore | SLGV004SL | 0,22 &; micro; m diametro |
| Streptococus mutans Δ gtfC | Stock in laboratorio. | gtfC sostituito con spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Ceppo stock in laboratorio. | S. mutans ATCC 700610, Ceppo wild-type | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | Per lo sviluppo di biofilm |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | Per elettroforesi su gel di agarosio Termociclatore |
| Bio-Rad | PTC-200 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Preparazione del tampone Tris-EDTA |
Riferimenti
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional an....
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Ristampe e permessi
