Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.
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Articolo metodologico
Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chiarificazione della funzione di un gene comporta in genere il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi e dei ceppi di tipo selvaggio in cui il gene di interesse è stato interrotto. La perdita di funzione dopo l'interruzione genica viene successivamente ripristinata mediante l'aggiunta esogena del prodotto del gene interrotto. Questo aiuta a determinare la funzione del gene. Un metodo descritto in precedenza comporta la generazione di un ceppo Streptococcus mutans interrotto dal gene gtfC. Qui, viene descritto un metodo poco impegnativo per purificare il prodotto genico gtfC dal ceppo S. mutans appena generato dopo la rottura genica. Si tratta dell'aggiunta di una sequenza di codifica della polihistidina alla fine del gene di interesse, che consente una semplice purificazione del prodotto genetico utilizzando la cromatografia dell'affinità metallica immobilizzata. Non sono necessarie reazioni enzimatiche diverse da PCR per la modificazione genetica in questo metodo. Il ripristino del prodotto genetico mediante aggiunta esogena dopo la perturbazione genica è un metodo efficace per determinare la funzione genica, che può anche essere adattata a diverse specie.
Introduzione
L'analisi della funzione di un gene di solito comporta il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi di tipo selvaggio ai ceppi in cui il gene di interesse è stato interrotto. Una volta prodotto il ceppo dirompente genico, l'aggiunta esogena del prodotto genetico consente il ripristino funzionale.
Il metodo più comune per ottenere i prodotti genici purificati necessari per il successivo restauro è eseguendo un'espressione eterologa in Escherichia coli1. Tuttavia, l'espressione di proteine della membrana o di proteine di massa molecolari elevate è spesso difficile da usare in questo sistema1. In questi casi, la proteina bersaglio è solitamente isolata dalle cellule che sintetizzano nativamente la proteina attraverso una complessa serie di passaggi, che possono portare alla perdita del prodotto genetico. Per superare questi problemi, è stata sviluppata una semplice procedura per la purificazione del prodotto genico a seguito di un metodo di interruzione genica2, del metodo di giunzione del DNA basato su PCR3 (PCR di fusione in due fasi) e dell'elettroporazione per la genetica trasformazione in Streptococcus mutans. L'aggiunta di un tag polihisinoso (His-tag) al capo-terminus del prodotto genetico ne facilita la purificazione mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).
Per isolare il ceppo che esprime tag His, l'intero DNA genomico del gene di interesse (in questo ceppo disgregazione genica che esprime i suoi tag) viene sostituito da un gene marcatore resistente agli antibiotici. La procedura per generare la varietà His-tag-expressing è quasi identica a quella per generare un ceppo genico-interrotto come descritto in precedenza4,5. Pertanto, i metodi per la perturbazione genica e l'isolamento del prodotto genico dovrebbero essere eseguiti come esperimenti seriali per l'analisi funzionale.
Nel lavoro attuale, una sequenza di codifica della polihisina è collegata al gene gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans6. Quindi, sono stati eseguiti studi di espressione in una specie streptococcale. Raggiungere l'espressione eteologa di gtfC da parte di E. coli è difficile, probabilmente a causa dell'alta massa molecolare di GTF-SI. Questo ceppo si chiama S. mutans His-gtfC. Un'illustrazione schematica raffigurante l'organizzazione della cassetta del gene gtfC e della spettromica (spcr)7 loci in Wild-type S. mutans (S. mutans WT) e i suoi derivati è mostrato in Figura 1. Il GTF-SI è una proteina secretoria che contribuisce allo sviluppo del biofilm dentale cariogenico6. Sotto la presenza di saccarosio, un biofilm aderente è osservato su una superficie di vetro liscia in WT S. mutans ceppo ma non nella deformazione S. mutans gtfC-interrotto (S. mutans -gtfC)2,5 . La formazione di biofilm viene ripristinata in S. mutans gt -fC dopo l'aggiunta esogena del ricombinante GTF-SI. Il ceppo, S. mutans His-gtfC, viene quindi utilizzato per produrre il ricombinante GTF-SI.
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Protocollo
NOT: Generazione di S. mutans -gtfC, in cui l'intera area di codifica del gene gtfC viene sostituita con spcr, deve essere completata prima di eseguire questi protocolli. Fare riferimento all'articolo pubblicato per informazioni dettagliate sulla generazione5.
1. Progettazione di Primer
-
Preparare primer per la costruzione di S. mutans His-gtfC.
NOT: Le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo sono mostrate nella Tabella 1. Il metodo PCR di fusione in due fasi per la generazione di S. mutans His-gtfC è illustrato in modo schematico nella Figura 2.- Primer di progettazione (gtfC-reverse e spcr-forward) per l'attaccamento della sequenza di codifica His-tag, intervenendo tra il gene gtfC e spcr (Figura 2A).
- Includere linker GS e sequenza His-tag-coding in entrambi gtfC-reverse e spcr-forward primers, in cui 24 basi alle regioni 5' sono complementari tra loro.
NOTA: La sequenza degli amminoacidi del linker GS e His-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His) è collegata al C-terminus di GTF-SI attraverso la traduzione genica. - Progettare un primer gtfC-forward per indirizzare il gene gtfC nel genoma S. mutans WT >1 kb a valle del gene e il primer spcr-reverse per indirizzare la regione di fianco a valle di spcr nel S. mutans -gtfC. Impostare la temperatura di fusione8 (Tm) del gtfC-forward and spcr-reverse primers in modo che corrispondano alle temperature di fusione del gtfC-reverse and spcr- primer in avanti, rispettivamente.
- Includere linker GS e sequenza His-tag-coding in entrambi gtfC-reverse e spcr-forward primers, in cui 24 basi alle regioni 5' sono complementari tra loro.
- Progettare i numeri primi annidati (nested-forward e nested-reverse) per la seconda PCR (Figura 2B).
- Primer di progettazione (gtfC-avanti e colonia-inversione) specifici per il DNA genomico del trasformativo (Figura 2C; i primer vengono utilizzati per la colonia PCR).
NOT: Gli amplificatori a cavallo del bordo tra gtfC e spcr. Il primer gtfC-forwardpuò essere applicato come primer in avanti. - Progettare primer (avanti e inbasso) per la conferma finale della generazione di S. mutans His-gtfC (Figura 2C; il prodotto PCR amplificato dai primer viene utilizzato per il sequenziamento del DNA).
- Primer di progettazione (gtfC-reverse e spcr-forward) per l'attaccamento della sequenza di codifica His-tag, intervenendo tra il gene gtfC e spcr (Figura 2A).
2. Estrazione del DNA genomico da S. mutans
NOT: Ogni ceppo S. mutans deve essere coltivato in mezzi di infusione del cuore cerebrale (BHI) a 37 gradi centigradi in condizioni anaerobiche. I ceppi mutanti di S. mutans -gtfC e S. mutans His-gtfC sono coltivati in BHI integrati con 100 spectinomycin s/mL.
- Streak S. mutans WT e S. mutans -gtfC separatamente su ciascuna delle piastre di agar BHI. Incubarli durante la notte a 37 .
- Scegli singole colonie di S. mutans WT o S. mutans -gtfC utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare in 1,5 mL di brodo BHI. Incubarli durante la notte a 37 .
NOT: Le colonie possono essere utilizzate come fonte di DNA modello per la prima PCR (passaggio 3.1). - Trasferire 1 mL di ogni coltura batterica in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare la coltura per 1 min a 15.000 x g.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL del buffer Tris-EDTA (pH 8.0) per risospendere il pellet cellulare.
- Centrifugare la sospensione per 1 min a 15.000 x g. Togliete il super-acletterante. Risospendere il pellet cellulare in 50 : L di buffer Tris-EDTA (pH 8.0).
- Riscaldare la sospensione con un'incubatrice a blocchi per 5 minuti a 95 gradi centigradi. Centrifugare la sospensione per 5 min a 15.000 x g.
- Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 mL (il supernatante servirà come DNA modello per il primo PCR).
3. Amplificazione PCR
NOT: Le tabelle 1, tabella 2e 3 riepilogano rispettivamente i primir, i reagenti e i cicli di amplificazione PCR.
- Eseguire il primo PCR utilizzando il S. mutans WT e S. mutans -genoma gtfC come i modelli PCR. Amplificare le regioni che ospitano la parte a valle del gene gtfC e quelle che ospitano spcr utilizzando i primer descritti nel passaggio 1.1.1.2 (Figura 2A).
- Elettroforizzare ogni prodotto PCR su 1% gel di agarose. Accise i frammenti di DNA desiderati di circa 1.000 bp e 2.000 bp. Purificare i frammenti dai gel utilizzando il metodo di estrazione del gel a base di membrana di silice.
NOT: Le procedure di base per PCR9, elettroforesi gel di DNA10e purificazione del DNA11 sono dettagliate altrove. - Eseguire una seconda PCR utilizzando i prodotti del primo PCR (approssimativamente equimolar) come modelli PCR con le primer nested forward e nested-reverse (Figura 2B).
- Elettroforese un decimo della miscela PCR sul gel di agarose. Confermare la generazione dell'amplificatore appropriato di circa 3.000 bp.
-
Far precipitare il prodotto PCR rimanente.
NOTA: La purificazione del prodotto PCR non è necessaria, perché gli amplificatori non specifici generati dalla seconda PCR non interferiscono con la ricombinazione omologa.- Aggiungere acqua priva di nuclenonità alla miscela PCR e portare il volume totale a 100 gradi centigradi, seguito da 0,1 volume (10 M) di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi (250 ) di etanolo assoluto. Mescolare e conservare la miscela per 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugare il campione per 20 min a 15.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Aggiungere 1 mL di 70% di etanolo per lavare il pellet di DNA.
- Centrifugare il campione per 5 min a 15.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Asciugare all'aria e sciogliere il pellet di DNA con 10 gradi di acqua priva di nuclea.
4. Trasformazione delle celle
- Preparare l'competente S. mutans WT per introdurre il secondo prodotto PCR seguendo i passaggi descritti nella precedente pubblicazione5. Conservare le celle a -80 gradi centigradi.
NOT: Per questo esperimento, le cellule WT S. mutans competenti sono già state conservate in -80 gradi centigradi per generare S. mutans -gtfC. - Mescolare 5 l del secondo prodotto PCR concentrato al 50 -L aliquota di celle competenti ghiacciate congelate in precedenza. Aggiungere il composto in cuvette di elettroporazione. Dare un singolo impulso elettrico (1,8 kV, 2,5 ms, 600, 10 f) alle celle utilizzando l'apparato di elettroporazione.
- Risospendere le cellule in 500 . Immediatamente, stendete 10-100 gradi nidi delle sospensioni su piastre di agar BHI contenenti spettronomica. Incubare le piastre per 2-6 giorni a 37 gradi centigradi fino a quando le colonie non sono cresciute abbastanza per essere raccolte.
5. Verifica della ricombinazione e dell'immagazzinamento dell'enome G
- Esegui la colonia PCR, usando i primer gtfC-forward e colony-reverse per la ricombinazione. Elettroforizzare ogni costatunitense prodotto PCR su un gel di agarose. Confermare il frammento di DNA di circa 1.500 bp.
- Scegli una delle colonie positive usando uno stuzzicadenti sterilizzato e la sottocoltura le cellule durante la notte in 2 mL di brodo BHI contenente spettronomina.
- Mescolare 0,8 mL di coltura batterica con 0,8 mL di legalo sterile 50% e fare scorta a -80 o -20 gradi centigradi.
- Trasferire il rimanente 1 mL di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Ripetere i passaggi da 2,3 a 2,7 per estrarre il DNA genomico dalle cellule.
- Esegui la PCR usando i primer up-forward e down-reverse e il DNA genomico come modello. Ripetere il passaggio 3.2 per purificare il prodotto di DNA amplificato dai gel.
- Determinare la sequenza del DNA dell'amplificatore purificato mediante il sequenziamento del DNA.
NOT: Assicurati di confermare la generazione di S. mutans His-gtfC dal sequenziamento del DNA.
6. Purificazione della GTF-SI con tag poliistino
- Streak S. mutans His-gtfC su una piastra di BHI agar contenente spettromicina. Incubarli durante la notte a 37 .
- Raccogliere una singola colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e cellule secondarie in 3 mL di brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Preparare due flaconi conici con 1 L di brodo BHI senza spettronomia. Inoculare 1 mL della sospensione della coltura notturna in 1 L del brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Concentrare le proteine della coltura supernatante dalla precipitazione solfato di ammonio.
NOTA: Estrarre dai corpi cellulari se una proteina bersaglio è intracellulare. Le procedure di base per le precipitazioni di solfato di ammonio sono descritte altrove12.- Centrifugare la sospensione della coltura batterica per 20 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Recuperare la coltura supernatant in un bicchiere di vetro 3L.
- Aggiungere 1.122 g di solfato di ammonio a 2 L del supernatante (80% di saturazione) con agitazione vigorosa utilizzando un agitatore magnetico. Lasciare che il precipitato si formi per 4 ore o più a 4 gradi centigradi con agitazione.
NOTA: La formazione precipitata può essere continuata durante la notte. - Centrifugare la soluzione di solfato di ammonio a 15.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Decant il super-natante.
- Raccogliere il precipitato con una spatola e trasferire in un bicchiere di vetro 200 mL. Risospendere i pellet in 35 mL di buffer di rilegatura (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0).
- Dialisi la sospensione contro 2.500 mL del tampone di legame utilizzando un tubo di dialisi cellulosa rigenerato, a 4 gradi centigradi, con agitazione. Sostituire la soluzione di dialisi dopo 2 h e continuare la dialisi durante la notte.
- Sostituire nuovamente la soluzione di dialisi. Continuare a dialisire per altre 2 h.
- Centrifugare la sospensione diallym a 20.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Filtrare il supernatante attraverso un filtro a membrana utilizzando attrezzature di filtrazione di aspirazione. Trasferire il filtrato in un pallone da 75 cme 2.
- Frazionare il GTF-SI con etichettatura polihistista dalla sospensione filtrata dalla cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).
- Trasferire 2 mL di liquami in resina Ni-charged IMAC (circa 1 mL di resina) in una colonna cromatografica il cui sbocco è montato su un tubo di silicone. Rimuovere la soluzione di stoccaggio dal flusso di gravità.
ATTENZIONE: Non lasciare asciugare la resina in tutto l'IMAC. - Aggiungere 3 mL di acqua distillata nella colonna per lavare la resina. Aggiungere 5 mL del buffer di rilegatura per equilibrare la resina.
- Spegnere il flusso con un cazzo di pizzico Hoffmann. Aggiungere 5 mL della sospensione filtrata dal passaggio 6.5 per creare il liquame.
- Aggiungere tutti i liquami alla sospensione filtrata rimanente. Swirl il composto delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Caricare nuovamente la miscela sulla colonna. Rimuovere la sospensione dal flusso di gravità. Lavare la resina IMAC con 20 mL di buffer di rilegatura.
NOT: Regolare la portata a circa 2 mL/min con un pizzico Hoffmann in tutto l'IMAC successivo. - Eluire il ricombinante GTF-SI con 20 mL del tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0).
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. L'eluate deve essere conservato a 4 gradi centigradi. La resina IMAC può essere riutilizzata. Fare riferimento alle istruzioni per la resina IMAC.
- Trasferire 2 mL di liquami in resina Ni-charged IMAC (circa 1 mL di resina) in una colonna cromatografica il cui sbocco è montato su un tubo di silicone. Rimuovere la soluzione di stoccaggio dal flusso di gravità.
- Sostituire il buffer di elusione con il buffer di memorizzazione (buffer di fosfato da 50 mM, pH 6.5) e concentrare la soluzione GTF-SI ricombinante a circa 1 mL utilizzando un'unità di ultrafiltrazione centrifuga. Conservare la soluzione GTF-SI ricombinante a 4 gradi centigradi.
NOT: Confermare la purificazione GTF-SI con etichetta polihistide utilizzando SDS-PAGE13 e western blotting14 utilizzando un anticorpo monoclonale anti-polihisdano coniugato in zapsia di rafano. Aggiunta di CHAPS (concentrazione finale, 0,1%) all'eluente può essere richiesto per evitare l'adsorbimento non specifico all'unità, a seconda della proteina bersaglio.
7. Restauro funzionale di Recombinante GTF-SI
- Streak ogni S. mutanceppo su una piastra di agar BHI individualmente. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
- Utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato, raccogliere una singola colonia per inoculare in 2 mL di brodo BHI. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Utilizzare 20 l della coltura notturna di S. mutans -gtfC per inoculare 2 mL di brodo BHI contenente 1% di saccarosio senza antibiotici in una provetta di vetro. Aggiungere il GTF-SI o un volume equivalente del veicolo per la coltura S. mutans -gtfC, e la coltura le cellule con il tubo posto in una posizione inclinata durante la notte.
NOT: Sterilizzare la soluzione GTF-SI con un filtro sterile di siringa e determinare la concentrazione di proteine utilizzando un test proteico acido bicinchoninico15 prima dell'uso. - Agitare le sospensioni di coltura con un mixer vortice per 10 s. Decant le sospensioni. Lavare le provette con una quantità sufficiente di acqua distillata.
- Macchiare i biofilm sulla parete del tubo con 1 mL di 0.25% Coomassie brillante blu (CBB).
- Decantare la soluzione di colorazione dopo 1 min. Asciugare all'aria le provette.
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Risultati
Figura 3 Mostra la dimensione di ogni amplificatore dal primo PCR (Figura 3A) e secondo PCR (Figura 3B). La dimensione di ogni amplificatore corrispondeva alla dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. La figura 4A mostra le colonie di S. mutans trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di agar BHI contenenti sp...
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Discussione
La progettazione dei primer è il passo più critico del protocollo. Le sequenze dei primer gtfC-reverse e spcr-forward sono state determinate automaticamente in base alle sequenze sia della regione finale 3 di gtfC che della regione finale 5 di spcr. Ogni primer include 24 basi complementari che codificano un linker GS e una sequenza His-tag-coding nelle loro regioni 5'. L'interruzione delle sequenze normative native situate nelle regioni di fianco a monte può esse...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numeri di sovvenzione 16K15860 e 19K10471 a T. M., da 17K12032 a M. I., e da 18K09926 a N. H.) e dalla SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numero di sovvenzione 2018.09.10 n. 10).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Nippon Genetics | NE-AG02 | Per elettroforesi su gel di agarosio |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Sistema di coltura anaerobica |
| Anticorpo monoclonale Anti-His-Tag | MBL | D291-7 | coniugate HRP |
| Thermo Fisher Scientific | 23227 | Misurazione della concentrazione | |
| proteicaBrodo per infusione di cuore cerebrale | Becton, Dickinson | 237500 | Terreno di coltura batterica |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | Per la colorazione del biofilm |
| Unità di ultrafiltrazione centrifuga | Sartorius | VS2032 | Sostituzione del tampone e concentrazione proteica |
| Centrifuga | Kubota | 7780II | |
| Colonna cromatografica | Bio-Rad | 7321010 | Per IMAC |
| Morsetto a membrana per dialisi | Fisher marca | 21-153-100 | |
| Tubo per dialisi | As One | 2-316-06 | |
| DNA polimerasi | Takara | R045A | Sequenziamento del DNA DNA polimerasi ad alta fedeltà |
| Eurofins Genomics | |||
| Substrato ECL | Bio-Rad | 170-5060 | Per western blotting |
| EDTA (0,5 M pH 8,0) | Wako | 311-90075 | Preparazione del tampone Tris-EDTA |
| Elettroporazione cuvetta | Bio-Rad | 1652086 | 0,2 cm di spazio |
| Elettroporatore | Bio-Rad | 1652100 | |
| Soluzione EtBr | Nippon Gene | 315-90051 | Per l'elettroforesi su gel di agarosio |
| Taglierina per bande di gel | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel kit di estrazione | Nippon Genetics | FG-91202 | Estrazione del DNA da gel di agarosio |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | Per SDS-PAGE e western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Tampone di legame e preparazione del tampone di eluizione |
| Incubatore | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Impostazione della temperatura: 4 ° |
| C Incubatrice | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS Impostazione della | temperatura: 37 ° C |
| Filtro a membrana | Merck Millipore | JGWP04700 | 0,2 µ m diametro |
| Microcentrifuga | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| NaH2PO4· 2H2O | Wako | 192-02815 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Precipitazione del solfato di ammonio |
| Resina caricata con Ni | Bio-Rad | 1560133 | Per IMAC |
| Primer per PCR | Eurofins Genomics Standard proteico | su misura | |
| Bio-Rad | 161-0381 | Per SDS-PAGE e western blotting | |
| Apparato di filtrazione del solvente | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotici; utilizzare a 100 μ g/mL |
| Filtro per siringa sterile | Merckmillipore | SLGV004SL | 0,22 &; micro; m diametro |
| Streptococus mutans Δ gtfC | Stock in laboratorio. | gtfC sostituito con spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Ceppo stock in laboratorio. | S. mutans ATCC 700610, Ceppo wild-type | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | Per lo sviluppo di biofilm |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | Per elettroforesi su gel di agarosio Termociclatore |
| Bio-Rad | PTC-200 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Preparazione del tampone Tris-EDTA |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
